La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Les éléments génétiques mobiles, comme les séquences d’insertion (IS), jouent un rôle important dans la dissémination des gènes de résistance, notamment chez les entérobactéries, pathogènes majeurs chez l’Homme. Nous avons identifié une IS atypique, l’IS1294b (1713 pb) en amont du gène de la céphalosporinase blaCMY-2 présent sur le plasmide conjugatif (p2735) d’une souche d’origine clinique de Klebsiella pneumoniae résistante à haut niveau à la ceftazidime (céphalosporine de 3ième génération). L’IS1294b appartient à la famille des IS91-like qui transpose probablement selon le mode de la réplication du cercle roulant. Nous avons montré expérimentalement que l’IS1294b était capable de mobiliser le gène blaCMY-2 d'un plasmide à un autre, via le mécanisme de "one-ended transposition". Cette transposition, se produisant avec une fréquence comprise entre 1,7 et 14,0%, et implique la non-reconnaissance de l’une de ses extrémités (terIS). Nous avons développé un test chez Escherichia coli et étudié l’effet des mutations introduites dans l’IS1294b sur la fréquence de transposition in vivo. Nous avons identifié 8 nucléotides critiques à l’extrémité oriIS, et un motif de liaison à l’ADN probable (6 cystéines et 1 histidine importantes) dans le domaine N-terminal de la transposase. La délétion de la région 1 à 24 de l’extrémité terIS pourrait favoriser efficacement le mécanisme de « one-ended transposition ». Des résidus tyrosines (Y254 et Y258) et histidines (H164, H166 et H153) sont indispensables à l’activité de cette transposase Y2 et conforte son appartenance à la superfamille des protéines HUH. La purification, en cours, de la transposase (fusionnée à la thioredoxine pour la solubiliser) permettra l’étude ultérieure de son activité in vitro. Notre étude constitue une première description expérimentale de la mobilisation d'un gène d’une ß-lactamase par un élément appartenant à la famille des IS91 et ouvre des voies dans la compréhension du mécanisme de transposition de ces éléments génétiques mobiles. / Antibiotic resistance is a major public health issue. Mobile genetic elements, such as the insertion sequences (IS), play an important role in the dissemination of antibiotic resistance genes mainly in enterobacteria, major human pathogens. We identified an atypical IS, IS1294b (1713 bp), upstream the cephalosporinase gene, blaCMY-2. They were located on the conjugative plasmid (p2735) from a clinical strain of Klebsiella pneumoniae, highly resistant to ceftazidime (third generation cephalosporin). IS1294b belongs to the IS91-like family which probably transposes according to the mode of rolling circle replication. We have shown experimentally that IS1294b was able to mobilize the blaCMY-2 gene from a plasmid to another, through the mechanism of "one-ended transposition". This mobilization involving the non-recognition of the terIS end occurred with a percentage ranging between 1.7 and 14%. We developed a transposition test in Escherichia coli and studied the effect of mutations introduced into the IS1294b on in vivo transposition frequency. We identified 8 critical nucleotides at the oriIS end, and a probable DNA binding motif (6 cysteines and one histidine are essential) in the N-terminal domain of the transposase. The deletion of the region 1-24 at the terIS end could enhance effectively the mechanism of "one-ended transposition." Tyrosines residues (Y254 and Y258) and histidines (H164, H166 and H153) are essential to the activity of the transposase Y2 and reinforce its belonging to the HUH protein superfamily. Purification of the transposase (fused to the thiroredoxine for solubilization) is in progress and will allow further study of its in vitro activity. Our study is the first experimental description of the mobilization of a beta-lactamase gene by an element belonging to the IS91 family, and could initiate the understanding of the mechanism of transposition of these mobile genetic elements.