Bendrąja prasme kolagenolizė - dalinė arba visiška konkretaus kolageno tipo molekulės proteolizė, vykstanti in vivo (fiziologinių ar patologinių procesų metu) ar in vitro. Vandens molekulė, kaip įprasta hidrolizės reakcijoms, būtinas antrasis kolagenolizės proceso substratas. Kolagenolizę katalizuoja kolagenoliziniu specifiškumu pasižyminčios peptidazės. Kolagenai -vieni svarbiausių baltymų tiek atliekamų funkcijų, tiek biotechnologinio panaudojimo atžvilgiais. Jų panaudojimas neįmanomas be kolagenolizės proceso, taigi -kolagenolizinių peptidazių. Tik nedaugeliui peptidazių būdingas kolagenolizinis specifiškumas. Eukariotų ir prokariotų skirtumai kolageno kaip kolagenolizės substrato produkavimo galimybės atžvilgiu, taip pat netapačios šio fibrilinio baltymo biologinės funkcijos šiuose gyvybės domenuose lėmė skirtumus tarp prokariotų ir eukariotų kolagenolizinių peptidazių. Nors prokariotinės kolagenolizinės peptidazės tiriamos vis intensyviau, daugiau dėmesio skiriama patogeninių kamienų (Clostridium, Porphyromonas genčių) produkuojamoms kolagenazėms. Tuo tarpu nepatogeninių prokariotų kolagenazių tyrimai vykdomi rečiau. Ilgainiui tai gali lemti nevisavertį prokariotų kolagenazių biotechnologinio potencialo išnaudojimą bei iš dalies riboti pačio kolageno taikymą, sprendžiant konkrečias problemas. Biotechnologinio panaudojimo poreikiams tenkinti būtina klonuoti kolagenolizinių peptidazių genus, pritaikant efektyvias ekspresijos sistemas. Darbo tikslas: Atlikti termofilinių... [toliau žr. visą tekstą] / Collagens are one of the most important proteins including their functions and biotechnological application. The biotechnological application of collagens wouldn‘t be possible without the process of collagenolysis which is catalysed by collagenolytic peptidases. The aim of this work was to perform transcriptional analysis of U32.002 (Helicobacter-type) collagenolytic peptidase gene and its cloning as well as basic analysis. The analysis of U32.002 peptidase gene transcription was performed after the extraction of total RNA from G. lituanicus DSM 15325T cells that were in two different stages of growth. Reverse transcription assays were performed after total RNA extraction. After the process of reverse transcription samples of cDNA were used for the diagnostic PGR that was carried out by using five different primers. This gene was cloned with and without putative signal/pro sequence in order to produce the preparation of U32.002 peptidase. Full sequence of U32.002 peptidase gene was cloned into pTZ57R/T and then into the expression vector pET28c(+). U32.002 gene without putative signal/pro sequence was cloned into pJET1.2, and then into pET28c(+). SDS-PAGE and MALDI-TOF analyses were performed in order to determine the fact of expression in E. coli BL21 (DE3). Full scale expression optimisation was performed, as well. The influence of calcium and zinc ions to the structural stability of U32.002 peptidase with putative signal/pro sequence was analysed. The collagenolytic... [to full text]

Geobacillus thermodenitrificans JK1 kamieno termostabilios ksilanazės geno klonavimas, ekspresija ir fermento savybių analizė Ksilanas - pagrindinis hemiceliuliozės komponentas ir antras pagal paplitimą polisacharidas gamtoje. Šis biologinis polimeras yra chemiškai heterogeniška bei kompleksiška medžiaga, kurios efektyviam degradavimui reikalingos multifermentinės sistemos. Tokios sistemos yra plačiai paplitusios tarp įvairių prokariotinių ir eukariotinių mikroorganizmų. Pagrindinį vaidmenį ksilano degradacijoje atlieka endo-1,4-β-ksilanazės. Ksilanazės pasižyminčios termostabilumu yra plačiai taikomas popieriaus ir maisto pramonėje, pašarų gamyboje bei biokonversijoje. Darbo metu buvo atrinktas JK1 kamienas, gebantis sekretuoti ksilanolizinius fermentus į ląstelės išorę. Remiantis 16S rRNR ir spo0A genų sekų palyginimais bei filogenetine analize nustatyta, kad tiriamas kamienas buvo artimiausias G. thermodenitrificans NG80-2 kamienui, kuriame taip pat nustatytas ksilanazės genas. Pagal šią geno seką sukurti pradmenys amplifikuojantys JK1 kamieno ksilanazės geną (1224 bp). Ksilanazės genas klonuotas ir perkeltas į ekspresijos vektorių (pET-28c(+)), sukonstruojant rekombinantinę ksilanazę su His inkarine uodega (50,979 kDa), kas leido ekspresuoti baltymą E. coli ir atlikti gryninimą nikelio afininės chromatografijos metodu. Šiame darbe pirmą kartą charakterizuota G. thermodenitrificans JK1 kamieno ksilanazė. Rekombinantinio fermento optimalios veikimo sąlygos - 70 °C... [toliau žr. visą tekstą] / Cloning, expression and biochemical characterization of the thermostable xylanase from Geobacillus thermodenitrificans strain JK1 Xylan is a major structural polysaccharide in plant cells, and is the second most abundant polysaccharide in nature. Due to its heterogeneity and complexity, the complete hydrolysis of xylan requires a variety of cooperatively acting enzymes. These xylanolytic enzyme systems are quite widespread among prokariotic and eukaryotic microorganisms. Endo-1,4-β-xylanase is considered to play the most important role in xylan degradation. Thermostable xylanases have potential applications in a wide range of industrial processes, including pulp and paper industry, food and animal feeds industry and bioconvertion. In this study a thermophilic JK1 strain producing xylanolytic enzymes was isolated from compost sample. The 16S rRNR and spo0A genes sequence analysis indicated that JK1 strain had the highest similarity with G. thermodenitrificans NG80-2 strain. Based on the xylanase gene sequence from G. thermodenitrificans NG80-2 strain, degenerated primers were designed for amplification of xylanase-coding gene (1224 bp) from JK1 strain. Subsequently, the amplified gene was cloned into expression vector (pET-28c(+)) and the recombinant xylanase with a polyhistidine-tag was designed (50,979 kDa). Biochemical properties of the purified by nickel affinity chromatography recombinant xylanase from G. thermodenitrificans JK1 strain were further characterized. The... [to full text]