Die Nachahmung natürlichen Kollagens stellt aufgrund dessen einzigartiger Struktur erhöhte Anforderungen an die chemische und biochemische Synthese artifizieller kollagenartiger Peptide. In dieser Arbeit wurden Cystein-Knoten und Organo-Template als Konzepte zur Vororganisation vorgestellt, um Peptideinzelstränge in die Anordnung kollagenartiger Dreifachhelices (CTH) zu dirigieren. Zusätzlich wurden diese mit einem schaltbaren DEPSI Struktursegment zur Steuerung der Helixstruktur kombiniert. Die templatbasierte Strategie beruht auf einem dreiarmigen Gerüstmolekül, an welches drei Peptideinzelstränge mittels nativer chemischer Ligation geknüpft werden. Für das Cystein-Knoten-Konzept wurden kollagen-mimetische Peptide entwickelt. Diese bestehen aus einer Cystein-reichen Domäne (wc2-Domäne) und einem Abschnitt, der eine kollagenartige Sequenz von [Gly-Pro-Pro]x aufweist. Die Vororganisation, als auch der Schalterdefekt zeigten maßgebliche Auswirkungen bezüglich der Adaption der Peptide in kollagenartige Dreifachhelices. Abhängig von der Position modulieren die Schalterdefekte die wc2-Organisation, die Nukleierung und den CTH-Faltungsprozess. Die Cystein-Organisationsdomäne wies den Vorteil auf, dass derartige Sequenzen ohne chemische Modifikation direkt im biotechnologischen Prozess in Unimere eingebracht werden konnten. Eine E. coli-basierte Produktionsstrategie ermöglichte den Zugang zu [GPP]50-Konstrukten, die ebenfalls die wc2-Domäne trugen. Weitere Untersuchungen wiesen zudem eine redox-reaktive Schaltbarkeit der Peptide nach. Um die Verwendbarkeit der synthetischen Kollagene als Biomaterial zu testen, wurde die Kompatibilität in zweidimensionalen Adhäsions- und Zytotoxizitätstests überprüft. / Due to its unique structure, the imitation of natural collagen increased the demands on the chemical and biochemical synthesis of artificial collagen mimetic peptides (CMPs). In this thesis, concepts of cysteine knots and organo-templates were presented for the reorganization of peptide single strands into the arrangement of collagenous triple helices (CTHs). These techniques were additionally combined with a switchable DEPSI structure segment to further control the helix structure. The template-based strategy relies on a three-armed scaffold to which three peptide strands are attached by native chemical ligation. For the cysteine-knot concept, collagen mimetic peptides consisting of a cysteine-rich domain (wc2-domain) and a domain with a collagen-like sequence of [Gly-Pro-Pro]x were developed. The preorganization, as well as the switch defect, showed significant effects on the adaptation of the peptides in collagenous triple helices. Depending on the position, the switch defects modulate wc2-organization, nucleation and the CTH folding process. This cysteine organization domain had the advantage that such sequences could be introduced into unimers directly in the biotechnological process without chemical modification. An E. coli-based production strategy allowed access to [GPP]50 constructs, which also carried the wc2-domain. Further investigations also showed a redox-reactive switchability of the peptides. To examine the utility of the synthetic collagen as a biomaterial, compatibility was tested in two-dimensional adhesion and cytotoxicity tests.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Schwefelgerbung. Warum aber mit der Schwefelgerbung? Die Ergebnisse der Literaturauswertung und beider Experimentalteile wurden zum gegenwärtigen Wissenstand über die Schwefelgerbung zusammengefasst und die sich daraus ergebenden wissenschaftlichen und praktischen Schlussfolgerungen gezogen. Die Arbeit soll unter einem betont praktischen Aspekt einen Beitrag zur Theorie der Schwefelgerbung liefern und zugleich eine Entscheidung darüber ermöglichen, ob die "alte" Schwefelgerbung in Kombination mit modernen Gerbverfahren erneutes Interesse für die Lederherstellung verdient oder nicht.

Introduction: Acellular scaffolds are increasingly used for the surgical repair of tendon injury and ligament tears. Despite this increased use, very little data exist directly comparing acellular scaffolds and their native counterparts. Such a comparison would help establish the effectiveness of the acellularization procedure of human tissues. Furthermore, such a comparison would help estimate the influence of cells in ligament and tendon stability and give insight into the effects of acellularization on collagen. Material and Methods: Eighteen human iliotibial tract samples were obtained from nine body donors. Nine samples were acellularized with sodium dodecyl sulphate (SDS), while nine counterparts from the same donors remained in the native condition. The ends of all samples were plastinated to minimize material slippage. Their water content was adjusted to 69%, using the osmotic stress technique to exclude water content-related alterations of the mechanical properties. Uniaxial tensile testing was performed to obtain the elastic modulus, ultimate stress and maximum strain. The effectiveness of the acellularization procedure was histologically verified by means of a DNA assay. Results: The histology samples showed a complete removal of the cells, an extensive, yet incomplete removal of the DNA content and alterations to the extracellular collagen. Tensile properties of the tract samples such as elastic modulus and ultimate stress were unaffected by acellularization with the exception of maximum strain. Discussion: The data indicate that cells influence the mechanical properties of ligaments and tendons in vitro to a negligible extent. Moreover, acellularization with SDS alters material properties to a minor extent, indicating that this method provides a biomechanical match in ligament and tendon reconstruction. However, the given protocol insufficiently removes DNA. This may increase the potential for transplant rejection when acellular tract scaffolds are used in soft tissue repair. Further research will help optimize the SDS-protocol for clinical application.

Knorpel ist ein kompliziertes System aus einem kollagenen Netzwerk, gefüllt mit wasserbindenden Makromolekülen (Proteoglykanen) und darin eingebetteten Zellen. Störungen in den komplexen Wechselbeziehungen können zur Gefährdung der strukturellen Integrität des Knorpels führen. Die hochauflösende Magnetresonanztomographie (NMR-Mikroskopie) kann über die Analyse der Signalintensität interne Knorpelstrukturen darstellen (hypo- und hyperintense Zonen). Mit Hilfe ionenmikroskopischer Analysemethoden (PIXE, RBS, ERDA) wurden im Knorpel (femorale und tibiale Kondyle des Hausschweins) im Querschnitt die zweidimensionalen Verteilungen der Knorpelelemente (H, C, N, O, P, S, Cl, K und Ca) aufgenommen sowie die Konzentrationen in ausgewählten Zonen bestimmt. Ergänzend wurde mit STIM die Dichteverteilung im Knorpel untersucht. Es gelang auch mit STIM, erstmalig kollagene Fasern in ihrer, bis auf den Wasserentzug natürlichen, Umgebung im Knorpel und damit unverändert in ihrer Anordnung sichtbar zu machen (keine chemische Demaskierung nötig). Die Ergebnisse wurden mit NMR- und polarisationsmikroskopischen Untersuchungen verglichen und in ihrem Zusammenhang mit den histologischen Knorpelzonen diskutiert. In den NMR-hypointensen Zonen fanden sich eine erhöhte Chlorkonzentration und punktförmige Calciumanreicherungen. Diese Zonen waren (im gefriergetrockneten Zustand) durch eine, bis zu einem Faktor vier höhere Dichte gekennzeichnet, die im maximalen Gehalt der Matrixelemente, H, C, N, O, (höchste Kollagendichte) begründet liegt. Im tibialen Knorpel konnten in der NMR-hypointensen Zone radial verlaufende einzelne Kollagenfasern nachgewiesen werden. Im femoralen Knorpel wurden in dieser Zone keine Einzelfasern nachgewiesen. Es deutete sich eine tubuläre Anordnung der Kollagenfasern an. In der hypertrophen Zone zeigten sich hohe Konzentrationen an Phosphor (Zellorganellen), Schwefel (Proteoglykane), Kalium (alkalisches Milieu) und Calcium (Vorstufe der Kalzifizierung). Die Chlorkonzentration hatte dort ihr Minimum. In dieser Zone verlaufen die Kollagenfasern radial und münden senkrecht in den Kalkknorpel. In der Tangentialfaserschicht wurde eine erhöhte Konzentration an Calcium und Phosphor beobachtet (Einlagerung von Calciumphosphaten). In dieser Zone wurden tangential verlaufende Kollagenfasern und ihr Übergang zur stärkeren Vernetzung mit teilweise arkadenförmiger Überstruktur sichtbar gemacht. Zur genaueren Aufklärung der dreidimensionalen Anordnung der Kollagenen Strukturen wurden erste Experimente zur STIM-Tomographie durchgeführt.

Single cell migration in artificial collagen gels as an in vitro model system in the context of cancer are studied. Cell and matrix mechanical properties are determined using atomic force microscopy and an advanced analysis method. Matrix pore-size is studied using a novel approach and analysis method. A novel, minimally invasive approach to determine the amount of displacement of the cell microenvironment due to force generation of single cells during migration in artificial 3D collagen gels is introduced. An automated analysis and user friendly software to analyze high-throughput cell invasion is introduced. These methods are used to study cell migration and mechanical properties of the breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7 and the influence of cell nuclear elasticity is investigated. Using mouse embryonic fibroblasts, the role of focal adhesion kinase (FAK) during cell migration is studied using FAK deficient knock-out cell lines FAK-/- and control FAK+/+ as well as kinase-dead mutants FAKR454/R454 and control FAKWT/WT.:Abstract i Acknowledgements iii 1 Introduction 1 2 Background 5 2.1 Cancer — An ever-changing Disease 5 2.1.1 Carcinogenesis and Neoplasm 6 2.1.2 Hallmarks of Cancer 7 2.1.3 Metastasis— The malignant Progression of Cancer 7 2.1.4 Metastatic Cascade 9 2.2 The Cell— Where it begins 10 2.2.1 Actomyosin Complex 12 2.2.1.1 Actin Monomer 12 2.2.1.2 Polymerization 12 2.2.1.3 Structures 14 2.2.1.4 Actin Cortex 15 2.2.1.5 Filopodia 16 2.2.1.6 Lamellipodium 16 2.2.1.7 Invadopodium 17 2.2.1.8 Stress Fibers 17 2.2.1.9 Actin in Cancer and Metastasis 17 2.2.1.10 Myosin and Actin 18 2.2.2 Focal Adhesions 19 2.2.3 Microtubules 20 2.2.4 Intermediate Filaments 21 2.2.5 Cellular Stiffness 22 2.2.6 Nuclear Deformability 23 2.3 The Extracellular Matrix— Where it happens 24 2.3.1 Components and Structure 25 2.3.2 Collagen as a Model System 26 2.3.2.1 Collagen I Fibril Formation 27 2.3.2.2 The Rat/Bovine-Collagen-Mix Model System 28 2.4 Single Cell Migration— Why it spreads 29 3 Materials and Methods 31 3.1 Cell Culture 31 3.1.1 Cancer Cells 31 3.1.2 Mouse fibroblasts 32 3.1.3 Pharmacological treatment 34 3.2 Collagen matrices 34 3.3 Cell Elasticity 36 3.3.1 Atomic Force Microscopy 36 3.3.2 Preparation 37 3.3.3 Data Aquisition 38 3.3.4 Data Analysis 38 3.4 Matrix Stiffness 40 3.4.1 Preparation 40 3.4.2 Data Aquisition 41 3.4.3 Data Analysis 41 3.5 Invasion Assay 42 3.5.1 Preparation 42 3.5.2 Data aquisition 44 3.5.3 Data Analysis 44 3.6 Matrix Topology 48 3.6.1 Preparation 49 3.6.2 Data Acquisition 50 3.6.3 Data Analysis 51 3.6.3.1 Binarization 51 3.6.3.2 Pore-Size 53 3.6.3.3 Fiber Thickness 54 3.7 Fiber Displacement 55 3.7.1 Preparation 56 3.7.2 Data Aquisition 56 3.7.3 Data analysis 57 3.7.3.1 Fiber Displacement 59 3.7.3.2 Cell Segmentation 60 3.7.3.3 Shell Analysis 61 3.8 A toolset to understand Single Cell Migration and what influences it 62 4 Results 65 4.1 Cell Elasticity 65 4.1.1 Example Force-Distance Curves 66 4.1.2 Single Cell Elasticity 67 4.2 Matrix Stiffness 69 4.3 Invasion 71 4.4 Matrix Topology 75 4.5 Influence of Cell Nucleus on Cell Migration 79 4.5.1 Cellular Elasticity 79 4.5.2 Invasion 81 4.6 Fiber Displacement 89 4.7 Effect of FAK on Cell Invasion and Fiber Displacement 93 4.7.1 FAK Knock-Out 93 4.7.2 Kinase-dead FAK Mutant 96 5 Discussion 103 References 107 / Die Einzelzellmigration in künstlichen Kollagennetzwerken als ein in vitro Modellsystem im Kontext von Krebs wurde studiert. Mechanische Eigenschaften von Zellen und der verwendeten Kollagennetzwerke wurden mithilfe der Atomic Force Microscopy (AFM) und weiterentwickelten Analysemethoden bestimmt. Die Porengröße der verwendeten Kollagennetzwerke wurde mit einer neuentwickelten Auswertemethode analysiert. Eine neuartige, minimal-invasive Methode zur Bestimmung der Verformung der Mikroumgebung von Zellen während der Migration verursacht durch Kräftegenerierung der Zelle wird beschrieben. Die Analyse des Invasions-Assays wurde automatisiert und eine nutzerfreundliche Software entwickelt, mit der große Datenmengen ausgewertet werden können. Diese Methoden wurden verwendet, um mechanische Eigenschaften und Migration der humanen Brustkrebszellinien MDA-MB-231 und MCF-7 zu studieren. Die Rolle der focal adhesion kinase (FAK) wurde mithilfe von embryonalen Maus-Fibroblasten studiert. Sowohl eine FAK knock-out Zellinie FAK-/- und Kontrolle FAK+/+, als auch eine kinase-dead Mutante FAKR454/R454 und Kontrolle FAKWT/WT wurden hinsichtlich ihrer Invasion und Verformung der Mikroumgebung analysiert.:Abstract i Acknowledgements iii 1 Introduction 1 2 Background 5 2.1 Cancer — An ever-changing Disease 5 2.1.1 Carcinogenesis and Neoplasm 6 2.1.2 Hallmarks of Cancer 7 2.1.3 Metastasis— The malignant Progression of Cancer 7 2.1.4 Metastatic Cascade 9 2.2 The Cell— Where it begins 10 2.2.1 Actomyosin Complex 12 2.2.1.1 Actin Monomer 12 2.2.1.2 Polymerization 12 2.2.1.3 Structures 14 2.2.1.4 Actin Cortex 15 2.2.1.5 Filopodia 16 2.2.1.6 Lamellipodium 16 2.2.1.7 Invadopodium 17 2.2.1.8 Stress Fibers 17 2.2.1.9 Actin in Cancer and Metastasis 17 2.2.1.10 Myosin and Actin 18 2.2.2 Focal Adhesions 19 2.2.3 Microtubules 20 2.2.4 Intermediate Filaments 21 2.2.5 Cellular Stiffness 22 2.2.6 Nuclear Deformability 23 2.3 The Extracellular Matrix— Where it happens 24 2.3.1 Components and Structure 25 2.3.2 Collagen as a Model System 26 2.3.2.1 Collagen I Fibril Formation 27 2.3.2.2 The Rat/Bovine-Collagen-Mix Model System 28 2.4 Single Cell Migration— Why it spreads 29 3 Materials and Methods 31 3.1 Cell Culture 31 3.1.1 Cancer Cells 31 3.1.2 Mouse fibroblasts 32 3.1.3 Pharmacological treatment 34 3.2 Collagen matrices 34 3.3 Cell Elasticity 36 3.3.1 Atomic Force Microscopy 36 3.3.2 Preparation 37 3.3.3 Data Aquisition 38 3.3.4 Data Analysis 38 3.4 Matrix Stiffness 40 3.4.1 Preparation 40 3.4.2 Data Aquisition 41 3.4.3 Data Analysis 41 3.5 Invasion Assay 42 3.5.1 Preparation 42 3.5.2 Data aquisition 44 3.5.3 Data Analysis 44 3.6 Matrix Topology 48 3.6.1 Preparation 49 3.6.2 Data Acquisition 50 3.6.3 Data Analysis 51 3.6.3.1 Binarization 51 3.6.3.2 Pore-Size 53 3.6.3.3 Fiber Thickness 54 3.7 Fiber Displacement 55 3.7.1 Preparation 56 3.7.2 Data Aquisition 56 3.7.3 Data analysis 57 3.7.3.1 Fiber Displacement 59 3.7.3.2 Cell Segmentation 60 3.7.3.3 Shell Analysis 61 3.8 A toolset to understand Single Cell Migration and what influences it 62 4 Results 65 4.1 Cell Elasticity 65 4.1.1 Example Force-Distance Curves 66 4.1.2 Single Cell Elasticity 67 4.2 Matrix Stiffness 69 4.3 Invasion 71 4.4 Matrix Topology 75 4.5 Influence of Cell Nucleus on Cell Migration 79 4.5.1 Cellular Elasticity 79 4.5.2 Invasion 81 4.6 Fiber Displacement 89 4.7 Effect of FAK on Cell Invasion and Fiber Displacement 93 4.7.1 FAK Knock-Out 93 4.7.2 Kinase-dead FAK Mutant 96 5 Discussion 103 References 107

Advanced glycation end products (AGEs) irreversibly cross-link proteins with sugars and accumulate at a higher age and in diabetes, processes which can interfere with the integration of implants into the tissue. Glyoxal is a highly reactive glycating agent involved in the formation of AGEs and is known to induce apoptosis, as revealed by the upregulation of caspase-3 and fractin (caspase-3 being a key enzyme activated during the late stage of apoptosis and fractin being a caspase-cleaved actin fragment). In this study, we investigated the influence of collagen type I coating on the cytotoxic effect of glyoxal on rat calvarial osteoblastic cells and on human osteosarcoma cells (Saos-2) grown on titanium alloy, Ti6Al4V. Activation of caspase-3 and fractin was measured by counting immunohistochemically stained cells and by flow cytometry with propidium iodide (detection of the apoptosis indicating a sub-G1 peak). Our results showed an increased number of apoptotic osteoblasts after incubation with glyoxal on Ti6Al4V discs. However, the number of apoptotic cells on collagen-coated titanium was significantly smaller than on uncoated titanium after the same treatment. The present findings demonstrate that osteoblasts treated with glyoxal undergo apoptosis, whereas collagen type I coating of titanium alloys (used for implants) has an antiapoptotic function. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

In der Arbeit wurde der Einfluss des Einsatzes ethoxylierter Sulfosuccinate auf die Weichheit kollagener Substrate untersucht. Als kollagene Substrate dienen chromiertes Hautpulver und chromgegerbte Leder (Wet-blue). Speziell dem Einfluss der Kettenlänge der Sulfosuccinate, dem Angebot und den Applikationsbedingungen auf die Isolierung der Fibrillen des Kollagens (durch REM-Aufnahme belegt) wurde dabei besondere Aufmerksamkeit gewidmet und das C14-ethoxylierte Sulfosuccinat als am geeignetsten erkannt. Anhand der Berechnung der Fettbedeckung der Kollagen-Strukturelemente, der kritischen Mizellbildungskonzentration der Sulfosuccinatlösungen sowie der Veränderung des isoelektrischen Punktes des Kollagens wurde die Ablagerung der Fettmoleküle diskutiert und das Auftreten von ionischen und hydrophoben Wechselwirkungen nachgewiesen. Die Ergebnisse sind ein Beitrag zur Theorie der Fettung von Kollagen und zur Optimierung der Lederfettung.

Die enormen Fortschritte und Erkenntnisse der Medizin und der damit einhergehenden gestiegenen mittleren globalen Lebenserwartung von indes knapp 75 Jahren fußen auch auf den medizinischen Entwicklungen des 20. Jahrhunderts, da durch diese z. B. infektiöse und onkologische Erkrankungen, Diabetes, Bluthochdruck, Herzinsuffizienz, Magengeschwüre, Depressionen, Hämophilie und andere Krankheiten erfolgreich therapiert werden können. Die entwickelten Therapiemethoden beruhten im Wesentlichen auf chirurgischen und intensivmedizinischen Neuerungen, chemischen Wirkstoffen, belastungsfähigen Implantaten und extrakorporalen Systemen. Im 21. Jahrhundert hingegen sind medizinische Neuerungen im molekularbiologischen Bereich zu erwarten, wie beispielsweise in der Zellbiologie, DNA-Analyse und -Transfer oder in der regenerativen Medizin. In Letzterer werden autologe regenerative Mechanismen als therapeutisches Prinzip genutzt, um funktionsgestörte Zellen, Gewebe und Organe entweder durch den biologischen Ersatz oder durch die Anregung körpereigener Regenerations- und Reparaturprozesse zu erhalten bzw. wiederherzustellen.

Dynamic alterations of composition and mechanics of the extracellular matrix (ECM) are suggested to modulate cellular behavior including plasticity of macrophages (MPhs) during wound healing. In this study, engineered 3D fibrillar matrices based on naturally occurring biopolymers (collagen I, glycosaminoglycans (GAGs)) were used to mimic matrix stiffening as well as modification by sulfated and non-sulfated GAGs at different stages of wound healing. Human MPhs were found to sensitively respond to these microenvironmental cues in terms of polarization towards pro-inflammatory or wound healing phenotypes over 6 days in vitro. MPhs exhibited a wound healing phenotype in stiffer matrices as determined by protein and gene expression of relevant cytokines (IL10, IL12, TNF). Presence of sulfated and non-sulfated GAGs inhibited this polarization effect. Furthermore, control experiments on 2D matrices stressed the relevance of using stiffness-controlled 3D matrices, as MPhs showed a reciprocal polarization behavior depending on GAG presence. Hence, the results indicate a strong influence of dimensionality, stiffness, and GAG presence of the biomaterial scaffold on MPh polarization and emphasize the need for matrices closely mimicking the 3D in vivo context with a variable stiffness and GAG composition in in vitro studies.

Surfactant-Proteine (SP) sind von kritischer Bedeutung für die physiologische Atmung und besitzen vielfältige Verknüpfungen zur Genese pulmonaler Pathologien. Dagegen ist das Wissen über die Rolle von SP bei Erkrankungen des Gehirns begrenzt. Surfactant-Protein-G (SP-G) als zuletzt bekanntgewordener Vertreter der SP-Familie wird vermutlich als hirneigenes und rheologisch aktives Protein in räumlicher Nähe zur Blut-Hirn-Schranke (BHS) exprimiert. Im Rahmen verschiedener akuter und chronischer zerebraler Pathologien werden die Bedeutung von SP-G-Profilveränderungen und seine möglichen regulatorischen Aufgaben in der zerebralen Flüssigkeitshomöostase bereits vielfältig diskutiert. Naheliegend ist eine räumliche und pathophysiologische Beziehung von SP-G zu Komponenten der Neurovaskulären Einheit (NVU) und zum glymphatischen System (GS) auch bei der fokalen zerebralen Ischämie. Dabei ist die Entwicklung neuer therapeutischer Angriffspunkte und die Überwindung des „translational roadblock“ gerade bei dieser Erkrankung von entscheidender Bedeutung für eine zukünftig bessere klinische Versorgung von Schlaganfall-Patient:innen. Diese Studie stellt die erste räumliche und zeitliche Charakterisierung von SP-G zusammen mit vaskulären, glialen und neuronalen Komponenten der NVU nach fokaler zerebraler, Ischämie in verschiedenen Modellen in Maus, Ratte und Schaf dar. Im Zentrum der Untersuchungen standen immunfluoreszenzbasierte qualitative und quantitative Analysen ischämiebedingter Veränderungen von SP-G und dessen regionale Assoziationen zu Elementen der NVU an unterschiedlichen Zeitpunkten nach zerebraler Ischämie. Mit dem Ziel einer verbesserten Übertragbarkeit wurden mehrere Spezies und Modelle berücksichtigt: ein Filamentmodell in der Maus, ein thromboembolisches Modell in der Ratte und ein koagulationsbasiertes Großtiermodell im Schaf. Um mögliche zeitabhängige Prozesse zu berücksichtigen, wurden mehrere postischämische Beobachtungspunkte gewählt mit einer Spannbreite von 4 h bis 72 h für die Nagermodelle und 14 d für das Schafmodell. Qualitative Dreifach-Fluoreszenzfärbungen kortikaler und subkortikaler Hirnregionen zeigten SP-G als sensitiven Marker der Ischämie mit einem Verlust der Signalintensität sowie charakteristischen morphologischen Signalveränderungen über alle Zeitpunkte, Tiermodelle und Hirnregionen hinweg – in enger Assoziation zu ischämisch veränderten NVU-Elementen und Gefäßen. Bildgestützte quantitative statistische Analysen der inter-hemisphäriellen, im Zusammenhang mit der Ischämie stehenden, Veränderungen der Fluoreszenzsignale von SP-G und dem ischämiesensitiven Basalmembranbestandteil Kollagen IV zu verschiedenen Zeitpunkten untersuchten die zeitliche Dynamik der qualitativen Signalveränderungen von SP-G eingehender. Im Mausmodell zeigte sich eine statistisch signifikante, verminderte SP-G-Immunreaktivität (Ir) in von der Ischämie betroffenen neo- und subkortikalen Hirnregionen, mit einem maximalen Verlust der Signalintensität im Infarktkern 4 h und 24 h nach fokaler zerebraler Ischämie. Beginnend in der ischämischen Grenzzone zeigte sich entlang des Neokortex ein gradueller Verlust der SP-G-Ir, bereits 4 h nach Insult mit zunehmender Effektstärke bei länger andauernder Ischämie von 24 h. SP-G-Ir zeigte zwar keine direkte Überlappung mit dem Gefäßsystem, jedoch eine signifikante negative Korrelation zur invers erhöhten Kollagen IV-Ir in der Ischämie, die analog zu SP-G mit einem Maximum der Signalveränderungen im ischämischen Kerngebiet und gradueller Zunahme der Immunsignale über den Neokortex reagierte. Besonders für die ischämische Grenzzone präsentierte sich SP-G als frühzeitiger sensitiver Marker mit einem signifikanten Verlust der Immunmarkierung noch vor der Demarkierung des Infarkts durch erhöhte Kollagen IV-Ir ischämisch geschädigter Gefäße. Auch für subkortikale Regionen bestätigte sich die statistisch signifikante, negative Korrelation beider Marker in vergleichbarem Ausmaß. SP-G zeigte im nicht von der Ischämie betroffenen Gewebe eine ausgeprägte peri-nukleäre neuronale Zellassoziation und homogene Expression im Neuropil der untersuchten Vorderhirne von Mäusen und Ratten. Im Zusammenhang mit dem ischämischen Insult resultierten zuverlässig Signalveränderungen von SP-G-Ir entlang der subkortikalen ischämischen Grenzzone. Auch war ein Verlust der parenchymatösen Neuropil-Färbung sowie der auffälligen peri-nukleären SP-G-Markierung in allen analysierten ischämischen Hirnregionen erkennbar. Ischämiebedingte Veränderungen der SP-G-Ir gingen einher mit einer Störung der Permeabilitätsbarriere der BHS, bei der SP-G in enger räumlicher Beziehung zu extravasalem Serumalbumin detektiert wurde. Weitere Assoziation zu Komponenten der NVU zeigten sich im ischämiebedingten Signalverlust von SP-G bei gleichzeitigem Anstieg der CNP-Ir von Oligodendrozyten ebenso wie mit gemeinsamen ischämisch-morphologischen Veränderungen von Mikro- und Astroglia (visualisiert durch Iba- bzw. GFAP-Ir). Veränderungen von Aquaporin 4- und SP-G-Ir markierten in gleicher Weise die ischämische Grenzzone, von der aus sich ein Verlust der Fluoreszenzsignale beider Marker in der von maximaler Ischämie betroffenen Zone anschloss. Die ermittelten ischämisch-morphologischen Signalveränderungen der NVU-Marker stimmten mit Beobachtungen früherer Untersuchungen überein. Trotz der engen räumlichen Assoziationen konnte eine sichere Ko-Expression von SP-G mit glialen oder Gefäß-Markern jedoch in keinem Tiermodell gezeigt werden – ein Aspekt, der durch Laserscanning-Mikroskopie verifiziert wurde. Die charakteristischen SP-G-Signalalterationen und ischämiebedingten Veränderungen der NVU im Filamentmodell der Maus bestätigten sich im thromboembolischen Modell der Ratte weitgehend. Untersuchungen im Großtiermodell des Schafs zeigten den Verlust der SP-G-Ir im Infarkt auch 14 d nach koagulationsbedingter Ischämieinduktion und verifizierten SP-G als Marker der Ischämie über einen langen post-ischämischen Zeitraum. Kombinierte Immunmarkierungen von SP-G und Fibronektin zeigten eine regionale Assoziation ischämischer Veränderungen beider Marker und deuteten auf mögliche Verbindungen von SP-G zum extrazellulären Raum auch über klassische NVU-Komponenten hinaus. Die mutmaßlichen rheologischen Eigenschaften von SP-G, seine in früheren Untersuchungen gezeigte Präsenz in perivaskulären bzw. glymphatischen Räumen und bekannte Verknüpfungen zu pathologischen Veränderungen des Liquorsystems suggerierten im Vorfeld mögliche Verknüpfungen von SP-G und flüssigkeitsregulatorischen Systemen im Gehirn. Die beobachteten ischämischen Veränderungen von SP-G sowie seine Assoziation mit vaskulären und glialen Komponenten der NVU weisen auf eine mögliche Beteiligung von SP-G an regulatorischen Aufgaben in der NVU hin, speziell im Kontext mit vaskulärer Integrität, Schutz des Endothels sowie Erhalt der Barrierefunktion der BHS. Eine Beteiligung von SP-G an der Flüssigkeitshomöostase und der Regulation von Fließeigenschaften scheint auch im ischämischen Parenchym denkbar – mit Implikationen im Hinblick auf das klinisch besonders relevante post-ischämische zerebrale Ödem. Die Assoziation von SP-G mit AQP4, sowie Hinweise auf eine Beteiligung in der Beseitigung von Abfallprodukten und der Regulation von Entzündungsreaktionen weisen auf SP-G als möglichen neuen Angriffspunkt in der Schlaganfalltherapie hin. Allerdings ist die Ableitung funktioneller SP-G-Aspekte aus den größtenteils morphologischen Ergebnissen dieser Studie begrenzt und birgt die Gefahr der Überinterpretation von Daten. Weitere Limitationen sind die vorhandene Datenquantifizierung in nur einem Tiermodell sowie die auf die Immunfluoreszenz-mikroskopie beschränkte Methodik. Zusätzliche Untersuchungen weiterer ischämierelevanter Marker, die Erweiterung von Tier- und Ischämiemodellen, die Untersuchung auch deutlich längerer oder transienter Ischämiezeiten sowie die Analyse humaner Proben werden nötig sein, um die Rolle von SP-G in der zerebralen Ischämie genauer einordnen zu können. Insgesamt bietet die vorliegende Studie eine erste regionale und zeitliche Charakterisierung von SP-G nach experimenteller fokaler zerebraler Ischämie mit Hinweisen auf mögliche regulatorische Funktionen von SP-G im Rahmen der ischämisch veränderten NVU sowie der Flüssigkeitsregulation des Gehirns. Die Ergebnisse geben somit Anlass, SP-G im Kontext des ischämischen Schlaganfalls künftig noch eingehender zu untersuchen.:1 Abkürzungsverzeichnis 1 2 Einführung 3 2.1 Surfactant und Surfactant-Proteine 3 2.2 Surfactant-Proteine im Zentralen Nervensystem 5 2.3 Surfactant-Protein-G (SP-G) 6 2.4 Ischämischer Schlaganfall 8 2.5 Neurovaskuläre Einheit und Blut-Hirn-Schranke 12 2.6 Glymphatisches System und zerebrales Ödem 15 3 Zielsetzung 17 4 Material und Methoden 18 4.1 Material 18 4.1.1 Primärantikörper 18 4.1.2 Versuchstiere 19 4.2 Methoden 19 4.2.1 Ischämieinduktion und Tiermodelle 19 4.2.2 Gewebeaufarbeitung 21 4.2.3 Fluoreszenzmehrfachfärbungen 22 4.2.4 Histologische Kontrollen 24 4.2.5 Fluoreszenzmikroskopie 25 4.2.6 Bildgestützte Analyse und semiquantitative Auswertung 25 5 Ergebnisse 30 5.1 SP-G und Elemente des Gefäßsystems nach Ischämie in der Maus 30 5.1.1 Semiquantitative Analysen ischämischer Veränderungen von SP-G und Kollagen IV 37 5.2 SP-G und Komponenten der Neurovaskulären Einheit (NVU) nach Ischämie in der Maus 41 5.3 SP-G, Elemente des Gefäßsystems und der NVU nach Ischämie in der Ratte 46 5.4 SP-G und Elemente der NVU nach Ischämie im Schaf 51 6 Diskussion 53 6.1 SP-G und das Gefäßsystem in der Ischämie 53 6.2 Störungen der Blut-Hirn-Schranke und zerebrales Ödem 55 6.3 Aquaporin 4 und glymphatisches System 56 6.4 SP-G im Kontext von NVU und extrazellulärer Matrix 58 6.5 SP-G in verschiedenen Ischämiemodellen 60 6.6 Methodenbedingte Limitationen 61 7 Zusammenfassung 63 8 Literaturverzeichnis 67 9 Selbstständigkeitserklärung 79 10 Verzeichnis der wissenschaftlichen Veröffentlichungen 80 11 Danksagung 81