Les glycoprotéines d'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) sont impliquées dans une étape importante du cycle de réplication, l’entrée virale. La liaison de la glycoprotéine gp120 à CD4 contribue à la fixation du virus à la cellule cible et déclenche des changements conformationnels dans celle-ci afin de permettre à la gp120 se lier au récepteur de chimiokine CCR5 ou CXCR4. Contrairement à tous les enveloppes du groupe phylogénétique M, qui possède une sérine à la position 375, ceux du clade CRF01_AE possèdent une histidine. Ce résidu fait partie d'une cavité "Phe43" dans laquelle le résidu 43 de CD4 fait contact avec la gp120. Ici, nous avons évalué les conséquences fonctionnelles du résidu 375 en le remplaçant par une serine dans deux enveloppes CRF01_AE (CM244 et 92TH023), la sérine étant présente dans tous les autres clades du groupe M. Nous avons observé que la réversion de l'acide aminé 375 vers une sérine entraine une perte de fonctions des deux Envs CRF-AE tel que mesuré par une perte de l'infectivité et leur capacité à médier la fusion cellule à cellule. Le phénotype observé était la conséquence d’une très faible interaction avec CD4, qui n’était pas le résultat d’une enveloppe défectueuse ou instable. Par conséquent, la modification de l’acide aminé en position 375 a aussi altéré la sensibilité de neutralisation du virus par sCD4, qui en était diminuée. De plus, on a observé que certaines mutations des couches topologiques du domaine interne de la gp120 ont permis un rétablissement partiel de la fonctionnalité en restaurant l’interaction avec CD4. Les niveaux d’infectivité et de fusion des mutants des couches topologiques se rapprochant des enveloppes sauvages de CRF01_AE suggèrent une coévolution entre la cavité phe43 et les résidus du domaine interne de la gp120. Une compréhension des différences qui existent entre les enveloppes de CRF01_AE et les enveloppes de virus du groupe M, permettra d’avoir une idée sur la fonctionnalité des glycoprotéines d'enveloppe. Il serait possible de mettre en évidence des mécanismes impliqués dans les changements conformationnels des Envs qui permettent l’évasion des anticorps dirigés contre elle. De plus, ces possibles différences dans les enveloppes de CRF01_AE pourraient être exploitées pour le développement des différentes approches vaccinales. / The envelope glycoproteins (Env) from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) mediate viral entry. The binding of the HIV-1 gp120 glycoprotein to CD4 contributes to the attachment of the virus to the target cell and triggers conformational changes in gp120 that allow high-affinity binding to the chemokine receptor CCR5 ou CXCR4. Contrary to all other Envs from the same phylogenetic group M, which possess a serine at position 375, the majority of CRF01_AE strains possess a histidine. This residue is part of the “Phe43” cavity, where residue 43 of CD4 engages with the gp120. Here we evaluated the functional consequences of replacing this residue in two CRF01_AE Envs (CM244 and 92TH023) by a serine, present in all the other clades from group M. We observed that reversion of the 375 amino acid to a serine resulted in a loss of functionality of both CRF_AE Envs, as measured by a loss in infectivity and their ability to mediate cell-to-cell fusion. The observed phenotype was the result of a weak interaction with CD4, which was not due to defective processing or trimer stability of these Envs. Therefore, modification of the amino acid at position 375 has also altered the sensitivity of virus neutralization by sCD4, which was reduced. Importantly, mutation of certain residues of the gp120 inner domain layers were able to partially restore wild-type levels of infectivity and cell-to-cell fusion to both CRF01-AE H375S Envs, suggesting a co-evolution of the Phe43 cavity and the gp120 inner domain. An understanding of the differences between the CRF01_AE envelopes and envelopes from group M presenting a serine at position 375 will provide a better knowledge about the functionality of the envelope glycoproteins. Among other things, it would be possible to identify the mechanisms involved in conformational changes of glycoproteins as well as those involved in the escape of envelope recognition by Env specific antibodies. Moreover, these possible differences in CRF01_AE envelopes could be exploited for the development of different vaccine approaches.

Vaincre efficacement l’infection par le VIH nécessite non seulement de raffiner davantage les traitements antirétroviraux, mais aussi de déployer des moyens de prévention à large échelle afin de stopper la propagation de la maladie. Il s’agit en effet de pouvoir développer un vaccin préventif ou thérapeutique à large spectre. L’atteindre de cet objectif requiert une meilleure compréhension des événements précoces médiés par les glycoprotéines d'enveloppe des virus transmis/fondateurs du VIH développés durant la primo-infection. Pendant que les efforts de la communauté scientifique se concentrent à trouver ce vaccin, il est également nécessaire de limiter le taux des nouvelles infections dans la population. Les résultats de nos travaux présentés dans cette thèse s’inscrivent dans cette optique de prévention des infections à VIH par l’étude de la dynamique de transmission de la maladie. Le premier volet de nos travaux dont les résultats sont consignés dans ce document et publiés dans le journal « PLOS ONE » (Chapitre III. Article 1) porte le titre : « Identification des nouvelles infections par le VIH-1 en utilisant des mesures de la diversité génétique des séquences de l’enveloppe ». L’objectif de cette étude était d’évaluer et de déterminer quelle méthode moléculaire parmi les mesures de diversité génétique de la séquence de l'enveloppe est capable de définir l’infection par le VIH-1 temporellement (récente versus chronique). Quatre mesures de diversité génétique des séquences virales de courts segments de l’enveloppe du VIH-1 ont été évaluées pour définir l’infection par le VIH-1 temporellement à savoir: le pourcentage de complexité, le pourcentage de diversité, le nombre d’haplotypes et l’entropie de Shannon. Nous avons identifié l'entropie de Shannon comme l'une des meilleures de ces quatre mesures de diversité qui associée à trois courts segments (≤100 paires de bases) de la séquence de l'enveloppe du VIH-1 est capable de prédire efficacement la période récente de l’infection par le VIH-1. L’indice de performance de l’entropie de Shannon (Aire sous la courbe (AUC) des trois segments de l’enveloppe du VIH-1 que sont : (1) région constante C2 segment 1 (C2_1), (2) région constante C2 segment 3 (C2_3) et (3) boucle V3 de la gp120 est respectivement de 0.806, 0.805 et 0.812. La capacité de différencier une infection récente d'une infection ancienne est importante en santé publique. En effet, les personnes nouvellement infectées sont les plus infectieuses et capables de propager rapidement la maladie dans la population. Puisque ces personnes ignorent leur statut sérologique, elles peuvent avoir plus de comportements à risque alors qu’elles ont une charge virale sanguine élevée d’un virus avec une capacité réplicative assez importante (fitness). Pouvoir identifier le plus tôt possible ces individus permettrait de limiter et de prévenir les nouvelles transmissions. Le deuxième volet de nos travaux consignés dans cette thèse (Chapitre III, Article 2) a été publié dans le journal « AIDS Research and Human Retroviruses » avec pour titre : « Analyses phylogénétiques des séquences du gène de l’enveloppe du VIH-1 pour l’évaluation et la construction à court terme des réseaux naissants de la transmission de l’infection par le VIH-1 ». Cette étude a consisté à identifier les liens phylogénétiques ou clusters qui existent entre les séquences virales de l’enveloppe du VIH-1 de patients nouvellement diagnostiqués au Québec. La formation de clusters entre les séquences virales de plusieurs individus pourrait refléter l'appartenance de ces personnes à un même réseau ou chaine de transmission. Ces personnes pourraient aussi partager des caractéristiques ou facteurs de risques communs au groupe. Les résultats de cette étude ont permis d’identifier 15 chaines ou réseaux de transmission mineurs (2-5 individus par réseau) de l’infection par le VIH-1 entre ces individus. Nous avons également évalué et comparé la capacité d’un fragment d’une séquence nucléotidique plus large de l’enveloppe du VIH-1 à celui de la boucle V3 beaucoup plus courte à pouvoir prédire et identifier de façon indépendante les individus qui pourraient être inclus dans un réseau ou grappe de transmission. Les résultats de nos analyses ont démontré une concordance modérée en se basant sur le coefficient kappa (k=0.59) entre les deux fragments de l'enveloppe virale utilisés. L’utilisation des séquences de la boucle V3 a en effet permis de confirmer 66.70% (10/15) des clusters identifiés avec un fragment plus long de la séquence de l’enveloppe du VIH-1. Le nombre de personnes infectées ayant accès aux tests de génotypage qui utilisent les séquences de la V3 pour déterminer le tropisme viral en pratique clinique courante est limité à l’échelle mondiale. Cependant, les séquences de l’enveloppe virale et particulièrement celles de la boucle V3 pourraient facilement être intégrées dans un programme de santé publique là où elles sont disponibles en complément de celles du gène pol (disponibles dans les laboratoires cliniques dans le cadre des tests de résistance aux traitements antirétroviraux) pour l’identification et la surveillance des réseaux de transmission du VIH-1 dans la population. Nous avons inclus les caractéristiques des sujets (données sociodémographiques, cliniques et facteurs de risque) dans un modèle d’analyse de régression logistique avec comme variable réponse (outcome) la formation de clusters de transmission. Les résultats de l'analyse démontrent que dans la population étudiée, l'âge moyen (<38.8 versus ≥38.8 ans) et le sous-type viral (sous type B versus non-B) sont deux facteurs significativement associés à la formation des clusters ou réseaux. L’identification des chaines de transmission du VIH-1 dans un échantillon de la population infectée par le VIH-1 au Québec et les facteurs de risques communs à ces personnes devraient permettre de mieux implanter les stratégies de prévention dans les groupes cibles. Les résultats de la troisième et dernière partie de nos travaux présentée dans cette thèse (Chapitre III, Article 3) ont été publiés dans le Journal « VIRUSES » sous le titre : « Identification de signatures génétiques au niveau de la glycoprotéine de l’enveloppe du VIH-1 associées aux virus transmis/fondateurs et récents de sous-types B ». Cette étude a consisté à identifier des signatures génétiques au niveau des séquences virales de l’enveloppe des premiers variants du VIH-1 appelés virus transmis/fondateurs ou « Transmitted/Founder viruses ». Ces variants constituent ceux qui sont capables d’établir une infection productive au moment de l'infection. Ils sont en effet sélectionnés parmi une multitude de quasi-espèces virales exposées au cours de la transmission du virus. Ils détiennent ainsi toutes les propriétés phénotypiques et ou fonctionnelles nécessaires à l’établissement de l’infection. L’identification de signatures génétiques observées précocement au niveau de la glycoprotéine de l’enveloppe du VIH-1 au cours de l’infection pourrait informer la conception de nouveaux inhibiteurs d’entrée immunologiques ou chimiques, mais aussi servir de repère pour le design d’un vaccin anti-VIH-1. Nos travaux ont permis d’identifier quelques signatures génétiques, mais une consistant en une mutation/substitution de l'Arginine (R) par une Isoleucine (I) associée au virus TF semble être particulièrement prononcée. Cette mutation est localisée à la position 841 (R841I) spécifiquement dans le domaine cytoplasmique de la GP41 notamment dans le segment 1 des peptides lytiques de lentivirus (LLP-1). L’isoleucine est sélectionnée (I) à plus de 33% par les virus TF comparativement aux virus d’infections chroniques (9%) et la différence est statistiquement significative, OR=0.2, 95% IC [0.09, 0.44], P= 0.00001. Le domaine cytoplasmique de la GP41 et spécifiquement le LLP-1 est fortement impliqué dans la réplication virale en intervenant dans le trafic intracellulaire et l’incorporation des glycoprotéines de l'enveloppe dans les virions. Une mutation dans ce domaine pourrait être un mécanisme moléculaire (polymorphisme) nécessaire à l’établissement de la transmission et d’échappement à la réponse immunitaire. / Overcoming HIV infection effectively requires further refinement of antiretroviral therapy as well as intensifying prevention strategies to stop the spread of the disease. It involves the capacity to develop a preventive or therapeutic broad-spectrum vaccine. Reaching this goal requires a better understanding of the acute and early events mediated by HIV founder viruses’ envelope glycoproteins during primary infection. While efforts of the scientific community are focused on finding a preventive vaccine, it is also necessary to limit the rate of new infections in the population. This thesis contributes to the efforts focusing on HIV prevention by studying the transmission dynamics of disease transmission and progression. The first part of my work is detailed in Chapter III and presented in a manuscript published in the journal “PLOS ONE” bears the title: « HIV-1 envelope sequence-based measures for identifying recent infections » (Article 1). The objective of this study was to evaluate and determine which molecular method, among envelope genetic diversity measures, can qualify the current status of HIV-1 infection. Four genetic diversity measures of short segments of HIV-1 envelope sequences were evaluated for their efficacy to characterize infection recency. They included i) the percent complexity, ii) the percent of diversity, iii) the number of haplotypes and iv), the Shannon entropy. We have identified Shannon entropy as the best diversity measure which can effectively predict the recency of HIV-1 infection when associated to three short segments (less than 100 base pairs) of the HIV-1 envelope gp120 C2 segments 1 and 3 and the V3 loop as envelopes sequenced based diversity measure (s) and segments. The performance index of Shannon entropy for these 3 segments: gp120 C2 segment 1; C2 segment 3; V3 loop was 0,806, 0, 0805, and 0,812 respectively. It could serve as a molecular biomarker for identifying new infections in newly diagnosed HIV-1-positive patients. The ability to differentiate recent infections from established (chronic) infections is important for public health. In fact, newly infected people are the most infectious and able to spread the disease quickly in the population. Since these people are usually unaware of their HIV status, they may engage in risky behaviours. This population generally has a high viral load with a relatively high-replicating capacity (fitness) that accelerates HIV-1 forward transmission. Being able to identify these individuals as soon as possible could limit and prevent new transmissions. Our work demonstrated that Shannon entropy measuring of these nucleic sequences can identify new infections. The second part of my work is reported in Chapter III and published in the journal « AIDS Research and Human Retroviruses » entitled: « A short-term assessment of HIV-1 transmission dynamics among newly diagnosed individuals using envelope sequence-based phylogenetic clustering » (Article 2). This study consists of identifying the phylogenetic links or clusters that exist between the viral sequences of the HIV-1 envelope of newly diagnosed patients in Québec. The formation of clusters between the viral sequences of several individuals could reflect the relationship of transmitted viruses between individuals who might share characteristics or commons risk factors. The results of this study identified 15 minor transmission clusters (2-5 individuals per cluster) between study participants. We also assessed and compared the ability of a fragment of a larger nucleotide sequence of the HIV-1 envelope to that of the much shorter V3 loop to independently predict and identify individuals that might be included in a transmission cluster. They demonstrated a moderate agreement based on the kappa coefficient (k= 0.59) between the two fragments of the viral envelope used. The use of the V3 loop sequences indeed confirmed 66.70% (10/15) of the identified clusters with a longer fragment of the HIV-1 envelope sequence. The number of infected individuals accessing genotyping tests that use V3 sequence to determine viral tropism in routine clinical practice is globally limited. However, the sequences of the viral envelope and particularly those of the V3 loop could easily be integrated into a public health program where they could be available in addition to those of the pol genes (available in clinical laboratories for antiretroviral resistance testing). We also included the characteristics of the subjects (sociodemographic, clinical and risk factors) in a logistic regression analysis model with cluster formation as an outcome). The results of the analysis demonstrate that in the study population, the average age (<38.8 versus>38.8 years) and the viral subtype (subtype B versus non-B) are two factors significantly associated with HIV transmission clustering among participants. Underlying HIV-1 transmission chains among HIV-1+ individuals in Québec and identifying the common risk factors should help the efforts to implement better prevention strategies in the target groups. The results of the third and last part of this work reported in this thesis (Chapter III, Article 3), were published in « VIRUSES » journal entitled: « HIV-1 Envelope Glycoprotein Amino Acids Signatures Associated with Clade B Transmitted/Founder and Recent Viruses ». It consists in identifying genetic signatures in the viral envelope sequences of the first HIV-1 variants called Transmitted/Founder (TF) viruses selected during the acute stage of infection. These variants can establish a productive infection at the time of infection in the new host. They are indeed selected among a multitude of viral quasi-species exposed during virus transmission. They may possess molecular and phenotypic properties that may govern their functions of the successful establishment of infection. Identifying such early HIV-1 genetic signatures may inform the design of novel immunologic or chemical inhibitors and serve as a benchmark for designing an effective HIV-1 vaccine. This study identified a few genetic signatures among HIV-1 TF viruses’ envelope amino acid sequences. One of these signatures consisting of a mutation/substitution of an arginine (R) by an isoleucine (I) associated with TF virus seems to be particularly important. This mutation is located at position 841 (R841I) specifically in the cytoplasmic domain of gp41 in segment 1 of lentivirus lytic peptides (LLP-1). The isoleucine is selected at more than 33% by TF viruses compared to chronic infection viruses (9%). The difference of selected amino acid between the two types of infectious viruses is statistically significant, OR = 0.2, 95% CI [0.09, 0.44], p = 0.00001. The cytoplasmic domain of GP41 and specifically the LLP-1 is strongly implicated in viral replication by mediating intracellular trafficking and the envelope incorporation into virions. A mutation in this area may suggest a molecular mechanism (polymorphism) contributing to HIV-1 transmission and/or viral escape from immune response.

Travaux de recherche effectués sous la supervision de la docteure Marylise Duperthuy (directrice) et de la docteure Catherine Paradis-Bleau (codirectrice). / L’augmentation de l’incidence des infections bactériennes par des souches résistantes, multirésistantes, voire même ultrarésistantes, aux antibiotiques, combinés à la crise de découverte de nouvelles molécules depuis les années 1960 et du sous-investissement chronique de certains états dans la recherche publique, pourrait coûter la vie à 10 millions d’êtres humains par an d’ici 2050. L’écrasante majorité des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont des bactéries à Gram négatif. Ceci est notamment dû à la composition intrinsèque de leur enveloppe, leur permettant d’être insensibles à de nombreuses molécules pourtant létales pour d’autres types de bactéries. L’étude des composants et des mécanismes de biosynthèse de l’enveloppe, qui sont essentiels au maintien de l'intégrité des bactéries et peuvent être impliqués dans leur virulence, devrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le premier chapitre, nous allons tout d’abord faire un tour d’horizon des éléments composant l’enveloppe des bactéries à Gram négatif, des mécanismes de résistance aux antibiotiques et du danger que représentent les bactéries à Gram négatif. Mes résultats de recherches, présentés sous forme de quatre articles aux chapitres deux à cinq, sont précédés d’une mise en contexte des recherches propres aux deux laboratoires, portant d’une part sur les biofilms et la mobilité de Vibrio cholerae et d’autre part sur l’enveloppe de Escherichia coli. Dans le premier article, nous avons déterminé par quel mécanisme la polymyxine B en concentration sous-inhibitrice affecte la formation de biofilm chez Vibrio cholerae. Nous avons observé que la polymyxine B affecte principalement le flagelle par une action mécanique. La formation de biofilm nécessitant le flagelle dans ses premières étapes de formation, nous avons conclu que l’action de la polymyxine B prévenait ce changement d’état. Dans le second article, nous avons conçu un protocole d’évolution expérimentale qui nous a permis d’identifier des mutations dans différents gènes permettant à Vibrio cholerae de se déplacer plus rapidement en présence de concentration sous-inhibitrice de polymyxine B. Nous avons alors identifié chez plusieurs souches différentes mutations ayant probablement réduit ou anéanti la fonction des protéines IhfA, DacB, VacJ (MlaA) et MlaF. En nous basant sur la littérature, nous proposons que la perte de fonction de ces 5 protéines induisant l’augmentation de la mobilité en présence de polymyxine B puisse s’expliquer selon trois mécanismes, impliquant la stabilité de l’enveloppe, la sécrétion de vésicules de membrane ou une altération de l’expression de différents gènes. Dans le troisième article, nous avons étudié l’implication du stress oxydatif dans l’arrêt de la synthèse de la paroi qui est fatal au mutant ∆elyC de Escherichia coli. Nous avons alors démontré que la lyse du mutant ∆elyC est causée par la surproduction de radicaux hydroxyles dans son enveloppe. Cette molécule cause des dommages dans l’enveloppe suffisamment importants pour provoquer l’arrêt de synthèse de la paroi. Le mécanisme provoquant cette surproduction de radicaux toxiques reste encore à déterminer. Par le biais de l’étude de la fonction du facteur ElyC, nous avons découvert une nouvelle vulnérabilité dans l’homéostasie de l’enveloppe qu’il nous tarde de pouvoir exploiter. Dans le dernier article, nous avons étudié l’importance de la voie de synthèse de l’antigène commun aux entérobactéries dans le processus létal apparaissant en l’absence du facteur ElyC. Nous avons découvert que le mutant ∆elyC accumule un élément commun aux voies de synthèse de la paroi et de l’antigène commun aux entérobactéries, l’undécaprényl pyrophosphate. Nous avons également découvert que l’augmentation du recyclage de cette dernière via la surexpression du gène codant pour la protéine PgpB permettait de prévenir la lyse du mutant. Notre hypothèse est que l’absence de ElyC induit une mauvaise répartition de l’undécaprényl phosphate entre les voies de synthèse de la paroi et de l’antigène commun aux entérobactéries. La suractivité de la voie de synthèse de l’antigène commun aux entérobactéries induirait l’accumulation d’undécaprényl pyrophosphate provoquant l’inhibition de Pbp1b, empêchant l’ajout de nouvelles sous-unités à la paroi conduisant ainsi à la lyse du mutant ∆elyC. Ainsi l’ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre et d’identifier des vulnérabilités de l’enveloppe de Vibrio cholerae et Escherichia coli, de préciser certains mécanismes ainsi que d’entrevoir le rôle de divers facteurs impliqués dans l’homéostasie de leur enveloppe. / The increased incidence of bacterial infections by resistant, multiresistant and even extensively drug-resistant strain, combined with the crisis of new molecules discovery since the 1960s and the chronic underinvestment of certain states in public research, could cost 10 million human lives per year by 2050. The overwhelming majority of resistant bacteria are the Gram-negative one. This is mainly due to the intrinsic composition of their envelope, allowing them to be insensitive to many molecules yet lethal for other types of bacteria. The study of envelope components and biosynthetic mechanisms, which are essential for the maintenance of bacterial integrity and could be involved in their virulence, should lead to the identification of new therapeutic targets. The first chapter gave an overview of the different elements composing Gram-negative bacteria envelope, mechanisms of resistance and the threat that Gram-negative bacteria represent. The presentation of my work, divided in four articles from chapter two to chapter five, was preceded by a contextualization of the research projects specific to both laboratories, on biofilm and motility of Vibrio cholerae on one hand and on Escherichia coli envelope from the other hand. In the first paper, we determined the mechanism by which a sub-inhibitory concentration of polymyxin B affects biofilm formation in Vibrio cholerae. We observed that polymyxin B mainly affected the flagellum by a mechanical action. Since biofilm formation requires the flagellum in the early stages of its formation, we concluded that the action of polymyxin B prevented this change in Vibrio cholerae lifestyle. In the second paper, we designed an experimental evolution protocol which allowed us to identify mutations in different genes that increase Vibrio cholerae motility in the presence of sub-inhibitory concentration of polymyxin B. We then identified that different mutations had altered ihfA, dacB, vacJ (mlaA) and mlaF genes in different mutants. These mutations have probably induced reduction or loss of function of the proteins for which they respectively code. Based on literature, we hypothesize that the loss function of these proteins inducing increase in mobility in the presence of polymyxin B could be explained by three 7 mechanisms involving envelope stability, secretion of membrane vesicles or altered expression of various genes. In the third paper, we investigated the involvement of oxidative stress in the fatal peptidoglycan synthesis arrest occurring in the ∆elyC mutant of Escherichia coli. We then demonstrated that lysis of the ∆elyC mutant is caused by the overproduction of hydroxyl radicals in its envelope. This molecule causes multiple and sufficiently important damages in the envelope to stop the synthesis of the wall. The mechanism causing this overproduction of toxic radicals has yet to be determined. By studying the function of the ElyC factor, we have discovered a new weakness in envelope homeostasis that we are eager to exploit. In the last paper, based on a previously formulated hypothesis, we investigated the importance of the enterobacterial common antigen synthesis pathway in the lethal process occurring in the absence of ElyC. We found that the ∆elyC mutant accumulates common element to the cell wall and enterobacterial common antigen synthesis pathways, undecaprenyl pyrophosphate. We also observed that the ∆elyC mutant lysis phenotype could be suppressed by increasing undecaprenyl pyrophosphate recycling via the overexpression of the gene coding for the phosphatase PgpB. We propose that the absence of ElyC induces a misallocation of undecaprenyl phosphate between the cell wall and enterobacterial common antigen synthesis pathways, in favors the latter pathway. Overactivation of the enterobacterial common antigen pathway would induce undecaprenyl phosphate accumulation, causing inhibition of Pbp1b, thus blocking addition of new subunits to the cell wall and leading to its lysis. Ultimately, all the original data generated by my research project has led to a better understanding of envelope vulnerabilities of Vibrio cholerae and Escherichia coli, to clarify certain mechanisms but also to glimpse the role of various factors involved in the homeostasis of their envelope. / L'aumento dell’incidenza delle infezioni da batteri resistenti, multi-resistenti e anche estremamente resistenti agli antibiotici, combinata con la rarefazione della scoperta di nuove molecole fra gli anni 1960 e il sotto investimento cronico di certe nazioni nella ricerca pubblica, potrebbe costare la vita a 10 milioni di essere umano all'anno nel 2050. La stragrande maggioranza delle specie resistenti agli antibiotici sono batteri Gram- negativi. Questo è dovuto principalmente alla composizione intrinseca dei loro involucri che permette loro di essere insensibili a molte molecole che sono letali per altri tipi di batteri. Lo studio delle componenti e i meccanismi di sintesi dell’incurvo, che sono essenziali nell’integrità dei batteri e che possono essere coinvolti nella loro virulenza, dovrebbe permettere l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici. Nel primo capitolo, avremo una panoramica dei diversi elementi che compongono l'involucro dei batteri Gram-negativi, dei meccanismi di resistenza e della minaccia che i batteri Gram-negativi rappresentano. La presentazione del mio lavoro, diviso in quattro articoli dal capitolo due a cinque, sarà preceduta da una contestualizzazione dei progetti di ricerca specifici di ciascuno dei due laboratori, sul biofilm e la motilità di Vibrio cholerae da un lato e sull'involucro di Escherichia coli dall'altro. Nel primo articolo, abbiamo determinato il meccanismo con cui la polimixina B in concentrazione sub-inibitoria influenza la formazione de biofilm in Vibrio cholerae. Abbiamo osservato che la polimixina B danneggia principalmente il flagello attraverso un'azione meccanica. Poiché la formazione del biofilm richiede il flagello nelle prime fasi della sua formazione, abbiamo concluso che l'azione della polimixina B ha impedito questo cambiamento nello stile di vita di Vibrio cholerae. Nel secondo articolo, abbiamo messo a punto un protocollo di evoluzione sperimentale che ci ha permesso di identificare diversi geni che aumentano la motilità di Vibrio cholerae in presenza di una concentrazione sub-inibitoria di polimixina B. Abbiamo quindi identificato vari mutazioni in diversi varianti che hanno probabilmente provocato la riduzione o il soppresso della funzione delle proteine IhfA, DacB, VacJ (MlaA) e MlaF. Sulla base della letteratura, proponiamo che la perdita di funzione di queste proteine inducendo un aumento della 9 mobilità in presenza di polimixina B può essere spiegato attraverso tre meccanismi coinvolgendo la stabilità dell'involucro, la secrezione di vescicole di membrana o l’alterazione dell’espressione di diversi geni. Nel terzo articolo, abbiamo studiato il coinvolgimento dello stress ossidativo nell'arresto della sintesi del peptidoglicano che è fatale al mutante ∆elyC di Escherichia coli. Abbiamo poi dimostrato con numerosi esperimenti che la lisi del mutante ∆elyC è causata dalla sovrapproduzione di radicali idrossilici nel suo involucro. Questa molecola causa importanti danni nell’involucro provocando l’inibendo della sintesi del peptidoglicano. Il meccanismo che causa questa sovrapproduzione di radicali tossici deve ancora essere determinato. Studiando la funzione del fattore ElyC, abbiamo scoperto una nuova vulnerabilità nell'omeostasi dell’involucro che siamo in fretta di sfruttare. Nel nostro ultimo articolo, basandoci su un'ipotesi precedentemente formulata, abbiamo studiato l'importanza della via di sintesi dell'antigene comune agli enterobatteri nel processo letale che si svolge in assenza di ElyC. Abbiamo scoperto che il mutante ∆elyC accumula un elemento comune alle vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri, l'undecaprenil pirofosfato. Abbiamo anche scoperto che l'aumento del riciclaggio di quest'ultimo attraverso la sovraespressione del gene pgpB previene la lisi del mutante. Proponiamo che l'assenza di ElyC induce una allocazione diffetosa del undecaprenil fosfato tra le vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri. L'iperattivazione della via dell'antigene comune agli enterobatteri provoca l'accumulo di undecaprenil pirofosfato, causando l'inibizione di Pbp1b e dunque dell’aggiunta di nuove unità al peptidoglicano, provocandone quindi la lisi. Quindi, questo lavoro ha portato a una migliore comprensione o identificazione delle vulnerabilità dell'involucro di Vibrio cholerae ed Escherichia coli, a chiarire certi meccanismi essenziali ma anche a intravedere il ruolo di vari fattori coinvolti nell'omeostasi del loro involucro.

La qualité de l’enseignement primaire en Côte d’Ivoire s’est fortement dégradée au cours de ces trois dernières décennies. Cette situation est la résultante d’une gestion approximative du système éducatif, qui se caractérise par une insuffisance de support pédagogique, une mauvaise allocation des ressources, un encombrement des salles de classe (42 élèves par enseignants au primaire) et un déficit d’enseignants qualifiés et bien formés. En outre, le conflit militaro-politique de septembre 2002 n’a guère amélioré cet état de choses, bien au contraire, il n’a fait que détériorer davantage la situation. Ainsi, la présente thèse s’est fixée comme objectifs d’analyser, d’une part l’influence des dotations en ressources sur l’efficacité des écoles primaires en Côte d’Ivoire sur la base d’une enquête sur les compétences réalisée par le Ministère de l’Education Nationale et d’autre part, d’examiner l’impact du conflit militaro-politique de septembre 2002 sur la demande d’éducation en s’appuyant sur les données des enquêtes MICS-2000 et 2006 réalisées auprès des ménages. Pour ce faire, une classification des écoles selon leur dotation en ressources s’est faite, ensuite, au moyen de la méthode de l’enveloppe des données (DEA, méthode non paramétrique), une frontière d’efficience est construite pour mettre en exergue les spécificités des écoles et enfin une estimation économétrique (modèle Tobit sur les données censurées) est mise en œuvre pour déceler les facteurs influençant la formation des scores d’efficacité. Il ressort des analyses qu’une augmentation de la quantité des ressources allouées à une école n’est pas gage de sa performance car les facteurs d’efficacités ne résident pas dans les dotations en quantité, mais plutôt dans les dotations en qualité c'est-à-dire les valeurs et caractéristiques intrinsèques aux personnes et matériaux mises à la disposition des écoles, ceci fait dans un souci d’adéquation aux besoins spécifiques des écoles et d’équité. Par ailleurs, à partir d’une méthodologie combinant à la fois l’estimation par les doubles différences, l’estimation par les triples différences et la correction par les contrôles de robustesse, elle aboutit aux résultats selon lesquels, les taux d’accès et d’achèvement aux grades un à six du primaire ont baissé du fait de la crise. En effet, les proportions d’enfants qui achèvent les grades 1 et 2 ont baissé de 25 % et celles des enfants qui achèvent les grades 3, 4 et 5 ont diminué respectivement de 22 %, 16 % et 4 %. / The quality of primary education in Côte d'Ivoire has deteriorated sharply over the past three decades. This situation is the result of an approximate management of the education system, which is characterized by a lack of educational support, a misallocation of resources, a congestion of classrooms (42 students for a teacher in primary school) and a lack of skilled and well trained teachers. In addition, the military-political conflict in September 2002 did not allow to improve this situation; on the contrary, it has further deteriorated the situation. Thus, the aim of this thesis is first to analyze the influence of resource endowments on the effectiveness of primary schools in Cote d'Ivoire on the basis of a survey on the competence conducted by the Ministry of Education. Secondly, it examines the impact of military-political conflict in September 2002 on the demand for education based on data from the MICS-2000 and 2006 household surveys. To do this, a classification of schools according to their resource endowment was made, then, using the method of data envelopment analysis (DEA nonparametric method), an efficiency frontier is constructed to highlight the specificities of schools and finally an econometric estimation (Tobit model censored data) is implemented to identify factors influencing the formation of effectiveness scores. The analysis shows that increasing the amount of resources allocated to a school does not guarantee its performance as the efficiency factors are not resident in endowment quantity, but rather in the endowment quality, that is the values and characteristics intrinsic to people and materials available to schools, this fact in order to fit the specific needs of schools and fairness. Furthermore, using a methodology combining both double differences estimation, the triple differences estimation and correction by the robustness checks, we find that the rate of access and completed grades of primary school s one to six of primary school declined because of the crisis. Indeed, the proportions of children completing levels 1 and 2 have fallen by 25% and those of children completing levels 3, 4 and 5 have decreased by 22%, 16% and 4% respectively.