Nesse trabalho avaliamos a sensibilidade a drogas in vitro de alguns isolados obtidos de pacientes brasileiros com leishmaniose cutânea. O microteste de MTT modificado mostrou-se eficaz para avaliação da sensibilidade in vitro de promastigotas de Leishmania e macrófagos de medula como modelo de infecção por L. (V.) braziliensis. A atividade de tamoxifeno e anfotericina B foi similar entre os isolados de Leishmania avaliados. Foi observada uma variação maior da sensibilidade ao Glucantime®, sendo que os isolados de L. (V.) braziliensis apresentaram maior sensibilidade a essa droga. Não foi observada correlação da resposta clínica dos pacientes ao tratamento com a atividade in vitro. Avaliamos também a eficácia de tamoxifeno no tratamento de camundongos BALB/c infectados com L. (V.) braziliensis. Observamos que 20 ou 30 mg/kg/dia de tamoxifeno por 15 dias resultou em redução no tamanho das lesões e carga parasitária em comparação com animais controle.Um isolado apresentou morfologia flagelar distinta daquela observada em promastigotas típicos de Leishmania. / In this work we evaluated the in vitro sensitivity to drugs of some isolates from Brazilian patients with cutaneous leishmaniasis. The modified MTT microtest was effective for evaluation of in vitro sensitivity of Leishmania promastigotes and macrophages from bone marrow as a model of infection by L. (V.) braziliensis. The activity of tamoxifen and amphotericin B was similar among isolates of Leishmania evaluated. Sensitivity to Glucantime®, was more variable with isolates of L. (V.) braziliensis presenting higher sensitivity to the drug. There was no correlation between clinical response to treatment with in vitro activity. We have also evaluated the effectiveness of tamoxifen in the treatment of BALB/c mice infected with L. (V.) braziliensis and observed that 20 or 30 mg/kg/day of tamoxifen for 15 days resulted in reduction in the size of lesions and parasite load when compared with control animals. One of the isolates presented atypical flagellar morphology.

A leishmaniose é uma doença negligenciada causada por protozoários parasitos do gênero Leishmania sp. e transmitida por vetores. Esta doença pode apresentar formas clínicas que variam de lesões cutâneas simples que podem desaparecer espontaneamente até a forma visceral, a qual acomete órgãos como baço, fígado, medula óssea e linfonodos, e pode levar a morte se não tratada corretamente. Além disso, de acordo com a Organização Mundial da Saúde as leishmanioses são endêmicas em 98 países. O tratamento ainda é feita principalmente com dois medicamentos, os antimoniais pentavalentes e anfotericina B, os quais causam uma série de efeitos secundários, além disso, relatos de resistência a esses fármacos têm sido publicados. Além disso, medicamentos alternativos aprovados para uso, como a miltefosina e pentamidina, também possuem sérios efeitos colaterais e nem sempre são efetivos para todas as espécies do parasito e/ou formas clínicas. Estes fatos demonstram que é necessário o desenvolvimento de fármacos alternativos para a quimioterapia das leishmanioses. Nesse sentido, o reposicionamento de fármacos se mostra como uma importante estratégia para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para a leishmaniose, pois fármacos já liberados para o uso em humanos podem ser reutilizados, diminuindo o tempo de desenvolvimento e custos empregados para o desenvolvimento de novos fármacos. Leishmania sp. possui como um dos principais lipídios o ergosterol, cuja rota metabólica é complexa e envolve uma série de enzimas, as quais, se corretamente bloqueadas poderão suprimir a produção do ergosterol e, portanto, a viabilidade de parasitos. Considerando estes aspectos, o presente estudo objetivou investigar a ação leishmanicida de fármacos que possuem ação inibitória em enzimas da via de esteróis como o fármaco anti-hiperlipidêmico rosuvastatina (inibidor da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase) e, os antifúngicos voriconazol, tiaconazol, fenticonazol (inibidores da enzima 14 alfa-metilesterol 14-demetilase), naftifina e tolnaftato (inibidores da enzima esqualeno epoxidase), e por fim a nistatina que age diretamente sobre ergosterol. O potencial contra formas promastigotas e amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum e L. (V.) braziliensis foram avaliados, e então foram investigadas possíveis alterações ultraestruturais, fisiológicas em promastigotas de L. (L.) amazonensis (formação de poros de membrana, e alteração do potencial de membrana mitocondrial) ou nas células hospedeiras (produção de óxido nítrico, peróxido de hidrogênio, e mudanças no pH intracelular). O fenticonazol, tioconazol, nistatina e o tolnaftato foram capazes de eliminar as formas promastigotas e amastigotas intracelulares, sendo a nistatina, o tolnaftato e o fenticonazol os mais seletivos para amastigotas das três espécies de parasitos estudados. Por outro lado, rosuvastatina, voriconazol e a naftifina não apresentaram ação contra formas amastigotas intracelulares. Além disso, os fármacos com atividade leishmanicida alteraram morfologicamente e fisiologicamente a mitocôndria do parasito. Apesar de não haver estímulo da produção de H2O2 ou NO por parte dos fármacos analisados, o fenticonazol foi capaz de alcalinizar macrófagos hospedeiros infectados. Considerando que estes fármacos foram capazes de inibir o crescimento de multi-espécies do parasito no interior dos macrófagos, esses resultados sugerem que medicamentos antifúngicos podem ser interessantes alvos para reposicionamento da quimioterapia das leishmanioses tegumentar e visceral / Leishmaniosis is a neglected disease caused by parasitic protozoa belonging to the genus Leishmania sp. and transmitted by vectors. This disease presents different clinical forms ranging from single lesion, that can heal spontaneously, to the visceral form, that affects the spleen, liver, bone marrow and lymph nodes, and may lead to death if not properly treated. Additionally, according to the World Health Organization, leishmaniosis is endemic to 98 countries. The treatment is still carried out with two main drugs, antimonials and amphotericin B that induce side effects; in addition, reports about the emergence of parasite resistance have been published. Besides, alternative drugs such as miltefosine and pentamidine still have serious side effects and are not always effective to treat all Leishmania species and/or clinical form. In this regard, drug repurposing has been considered an important strategy to develop new therapeutic alternatives to leishmaniasis chemotherapy, since drugs already approved to human use may be reused, decreasing time and costs needed for the research of new drugs. Leishmania sp. possesses ergosterol as the main membrane lipid, and the metabolic pathway to produce this lipid is complex and involves different enzymes, which if correctly inhibited may suppress ergosterol production and, therefore, parasite viability. Considering these aspects, the aims of this study is to investigate the leishmanicidal potential of drugs who inhibit enzymes of the ergosterol pathway, such as the anti-hyperlipidemic drug rosuvastatin (inhibitor of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase), the antifungals voriconazole, tioconazole, fenticonazole, (inhibitors of the 14 Alpha-methylsterol 14-demethylase), naftifine and tolnaftate (inhibitors of squalene epoxidase), and nystatin, that acts directly on ergosterol. The anti-promastigote and anti-amastigote potentials of drugs against L. (L.) amazonensis, L. (L.) infantum and L. (V.) braziliensis were evaluated; ultrastructural and physiological alterations of L. (L.) amazonensis promastigotes (membrane pore formation and mitochondrion membrane potential alterations) and host macrophages (nitric oxide and hydrogen peroxide productions and changes to intracellular pH) were investigated. Fenticonazole, tioconazole, nystatin and tolnaftate were capable to eliminate promastigote and amastigotes, being the most selective drugs nystatin, tolnaftate and fenticonazole to all studied species amastigotes. Rosuvastatin, voriconazole and naftifine were unable to eliminate amastigote forms. Furthermore, the drugs that possess leishmanicidal effects affected parasite mitochondrion. Although these drugs did not trigger the production of H2O2 or NO, fenticonazole was able to alkalinize host infected macrophages. Considering these drugs were able to inhibit multiple species of the parasite growth in macrophages, these results suggest that antifungal drugs can be interesting targets to be repurposed in the cutaneous and visceral leishmaniasis

INTRODUÇÃO: A leishmaniose tegumentar americana (LT) é uma doença infecciosa, não contagiosa, de transmissão vetorial com ciclo heteroxênico causada por parasitos do gênero Leishmania. É considerada uma enfermidade polimórfica que acomete pele e mucosas. Os medicamentos atualmente disponíveis para o tratamento da doença são insatisfatórios devido à sua eficácia limitada e seus efeitos colaterais, além do alto custo e a resistência que os protozoários acumulam contra essas drogas. O aumento da tolerabilidade é fundamental para o êxito global do tratamento. As formulações lipídicas comerciais da anfotericina B (AB), Ambisome®, Abelcet®e Amphocil®, apresentaram-se como um avanço no tratamento da (LT). Sistemas de nanoemulsões lipídicas reduzem a toxicidade de quimioterápicos e, ao mesmo tempo, aumentam sua ação farmacológica. Emulsões lipídicas com composição semelhante aos quilomícrons tem potencial aplicabilidade para vetorização de AB. OBJETIVO: Avaliar a citotoxicidade in vitro da anfotericina B desoxicolato (AB) e sua associação à nanoemulsão lipídica, o quilomícron artificial (QMA-AB), e in vivo, a tolerabilidade e eficácia terapêutica no tratamento da leishmaniose tegumentar em camundongos BALB/c. MÉTODOS: Para os testes in vitro, foi determinada a concentração inibitória (IC50) em formas promastigotas, a concentração citotóxica (CC50) em macrófagos sem infecção e a taxa de macrófagos infectados quando tratados com as formulações QMA, AB e QMA-AB. Já para os testes in vivo, camundongos BALB/c foram infectados com L. amazonensis e tratados com 2,5 mg/kg/dia de AB e 17,5 mg/kg/dia de QMA-AB e QMA. Durante o tratamento os animais foram monitorados semanalmente acerca do peso corporal e do diâmetro das patas. Ao término do tratamento os camundongos foram eutanasiados e amostras de sangue e tecido foram coletadas para análises bioquímicas, hematológicas, histopatológicas e quantificação da carga parasitária por método molecular qPCR. A análise estatística foi realizada com teste ANOVA seguido de Bonferroni ou Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. As variáveis categóricas foram reportadas em tabelas de contingência (teste exato de Fisher). As análises foram consideradas estatisticamente significantes com p < 0,05. RESULTADOS: A formulação QMA-AB foi mais efetiva contra formas promastigotas apresentando IC50 em torno de 0,012 micro g/mL, enquanto que o IC50 de AB foi de 0,023 micro g/mL. AB foi mais tóxica para os macrófagos J744 com baixa concentração, 2,324 micro g/mL. QMA-AB foi menos tóxica para os macrófagos com CC50 de 8,106 micro g/mL, superior à AB, e apresentou alto índice de seletividade (IS=675,5). A formulação QMA-AB diminuiu a taxa de infecção em macrófagos, foi menos tóxica, mais eficaz no tratamento dos animais infectados e reduziu em torno de 60% o tamanho do diâmetro das lesões em relação à AB e 95% da carga parasitária. CONCLUSÕES: A associação QMA-AB apresentou-se como uma alternativa em potencial no tratamento da LT na busca de uma preparação de alta eficácia terapêutica, baixa toxicidade e baixo custo para o Sistema Único de Saúde / INTRODUCTION: American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an infectious, non-contagious, vector-borne disease with heteroxenic cycle caused by parasites of the genus Leishmania. It is considered a polymorphic disease that affects skin and mucous membranes. Medications currently available for the treatment of the disease are unsatisfactory because of their limited effectiveness and side effects, and the high cost and resistance that protozoa accumulate against these drugs. Increased tolerability is critical to the overall success of treatment. The commercial lipid formulations of amphotericin B (AB), Ambisome®, Abelcet® and Amphocil®, presented as an advance in the treatment of (ATL). Lipid nanoemulsion systems reduce the toxicity of chemotherapeutics and, at the same time, increase their pharmacological action. Lipid emulsions with composition similar to chylomicrons have potential applicability for vectorization of AB. OBJECTIVE: This study evaluated the in vitro cytotoxicity of amphotericin B deoxycholate (AB) and its association with lipid nanoemulsion, artificial chylomicron (ACM), and in vivo, the tolerability and therapeutic efficacy in the treatment of cutaneous leishmaniasis in BALB/c. METHODS: For in vitro tests, the inhibitory concentration (IC50) in promastigote forms, the cytotoxic concentration (CC50) in non-infected macrophages and the rate of infected macrophages when treated with the ACM, AB and ACM-AB formulations were determined. For the in vivo tests, BALB/c mice were infected with L. amazonensis and treated with 2,5 mg/kg/day of AB and 17,5 mg/kg/day of ACM-AB and ACM. During the treatment the animals were monitored weekly about body weight and leg diameter. At the end of the treatment the mice were euthanized and blood and tissue samples were collected for biochemical, hematological, histopathological and quantitative analysis of the parasite load. Statistical analysis was performed using ANOVA followed by Bonferroni or Kruskal-Wallis with Dunn post-test. Categorical variables were reported in contingency tables (Fisher\'s exact test). The analyzes were considered statistically significant at p < 0.05. RESULTS: The ACM-AB formulation was more effective against promastigote forms exhibiting IC50 around 0,012 Micro g/mL, while the IC50 of AB was 0,023 Micro g/mL. AB was more toxic to J744 macrophages with low concentration, 2,324 Micro g/mL. ACM-AB was less toxic to macrophages with CC50 of 8,106 Micro g/mL, higher than AB, and presented a high selectivity index (IS = 675.5). The ACM-AB formulation decreased the rate of macrophages infected, was less toxic, more effective in the treatment of infected animals and reduced the size of the lesion diameter by about 60% in relation to AB and 95% of the parasite load. CONCLUSIONS: The ACM-AB association was presented as a potential alternative in the treatment of ATL in the search for a high therapeutic efficacy, low toxicity and low cost preparation for the Unified Health System

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa, crônica, não contagiosa, causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. A interação entre a espécie de Leishmania e os mecanismos da resposta imune do hospedeiro resulta em um amplo espectro de manifestações clínicas, histopatológicas e imunopatológicas na infecção humana. No Brasil, esta endemia representa um sério problema de saúde pública, sendo o estado do Maranhão responsável por 13% da casuística nacional. O objetivo deste estudo foi caracterizar o perfil imunopatológico de lesões cutâneas de 22 pacientes com LTA, causada por Leishmania (Viannia) sp, oriundos do estado do Maranhão. A reação de imunoistoquímica em biópsias de pele foi realizada empregando os anticorpos monoclonais anti-humano CD68, CD1a, fator XIIIa, CD4, CD8, IL-10 e IFN-g e os anticorpos policlonais anti-Lisozima, Foxp3 e TGF-b. A análise histológica das lesões demonstrou a presença de intenso infiltrado inflamatório na derme composto de macrófagos, linfócitos e plasmócitos com formação de granuloma na maioria dos casos. Formas sugestivas de Leishmania foram observadas em 90,9% dos casos examinados. A análise imunoistoquímica mostrou densidade superior de macrófagos ativados (4824,0 células/mm²) quando comparados aos não ativados 3458,9 células/mm²). Foi detectada densidade de células de Langerhans (CD1a+) de 310,4 células/mm² na epiderme e células dendríticas dérmicas (fator XIIIa+) de 633,6 células/mm² na derme. Foi verificada ainda, predominância de linfócitos T CD8+ (2374,1células/mm²) em relação a T CD4+ (1267,6 células/mm²). A densidade de células Treg Foxp3+ foi de 301,3 células/mm². A análise de correlação mostrou correlação positiva entre células TGF-b+ e T CD8+ e fator XIIIa+; e uma correlação negativa entre a densidade de células IFN-g+ e TGF-b+. As lesões de pacientes infectados com L. (Viannia) sp, apresentaram maior densidade de células Treg Foxp3+, e IL-10+ e IFN-g+ quando comparadas a de pacientes infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis. A densidade de células TGF-b+ mostrou-se semelhante nos dois grupos de pacientes. A avaliação dos marcadores de acordo com o tempo de evolução da doença, não mostrou diferenças entre as densidades de células imunomarcadas. Esses dados indicam que embora exista um perfil imunopatológico associado ao controle da infecção, a presença de uma resposta regulatória no sítio da lesão pode estar relacionada à persistência parasitária. / American tegumentary leishmaniasis (ATL) is a chronic, non contagious, infectious disease caused by different protozoan parasite species of the genus Leishmania. The interaction between Leishmania species and host response results in a wide spectrum of clinical, histopathological and immunopathological presentations in humans infection. In Brazil, this endemic disease is a serious public health problem and Maranhão State is responsible for 13% of Brazilian cases. The aim of this study was to characterize the immunopathology of lesions from 22 biopsies of patients with ATL, caused by Leishmania (Viannia) sp, from Maranhão State. Immunohistochemistry was carried out by incubating skin biopsies with monoclonal mouse anti- human CD68, CD1a, XIIIa factor, CD4, CD8, IL-10 and IFN-g and polyclonal rabbit\'s anti- human lysozyme, Foxp3 and TGF-b. Analysis of skin biopsies demonstrated a dense inflammatory infiltrate in the dermis, characterized by the presence of mononuclear cells, mainly lymphocytes, macrophages, plasma cells and granulomas in most samples. Suggestive forms of amastigotes were detected in 90.9% samples observed. Immunohistochemistry showed high levels of activated macrophages (4824.0 cell/mm²) when compared to inactive macrophages (3458.9 cells/mm²). In the epidermis, the densities of Langerhans Cells (CD1a+) were 310.4 cells/mm², while in the dermis the densities of dermal dendritic cells (factor XIIIa+) were 633,6 cells/mm². High density of CD8 T+ lymphocytes (2374.1 cell/mm²) has been found compared to CD4+ T lymphocytes (1267.6 cell/mm²). The cellular density of Treg (Foxp3+) was 301 cells/mm². Among cell markers there were positive correlations between TGF-b-producing cells and CD8+ T lymphocytes and between TGF-b-producing cells and dendritic dermal cells, as well as a negative correlation between TGF-b-producing cells and IFN-g-producing cells. Patients infected with L. (Viannia) sp. presented increased densities of Treg cells and IL-10 and IFN-g- producing cells compared to Leishmania (Viannia) braziliensis infected patients. The density TGF-b+ producing cells was similar in both groups of patients. Evaluation of Immunological markers according time of infection showed no differences in the densities of immunostain cell. Results suggest that the profile of immunopathological response is associated to the control of infection, although the presence of a regulatory response at the site of infection can be responsible to the persistence of parasite in skin.

O conhecimento a respeito de mecanismos de reprodução e geração de diversidade genética de organismos do gênero Leishmania vem sendo alterado com o advento de novas tecnologias. Estudos de laboratório demonstraram ocorrência de reprodução sexuada experimentalmente em organismos do gênero Leishmania. Relatos na literatura mostram a ocorrência de híbridos no ambiente natural, associada a casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA). A partir da caracterização fenotípica realizada utilizando anticorpos monoclonais e eletroforese de isoenzimas em linhagens isoladas de pacientes com LTA na região Amazônica do Brasil, sete isolados (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 e M19697) apresentaram um padrão intermediário entre as espécies L. (V.) shawi shawi e L. (V.) guyanensis. O presente estudo visou realizar a confirmação da identidade híbrida desses parasitas através da clonagem dos isolados, seguida da análise do polimorfismo pela clivagem do produto da reação em cadeia da polimerase (PCR RFLP) tendo como alvo a enzima de choque térmico de 70 quilodaltons (hsp70). O hsp70 PCR RFLP também foi utilizado para análise comparativa da intensidade dos produtos de digestão, para estimar a ploidia dos híbridos e a proporção da herança dos alelos de hsp70. Foi realizada ainda, avaliação do comportamento biológico in vitro e experimental in vivo desses parasitas. A curva de crescimento foi realizada na 4° e 12° passagem após isolamento do parasita. Infecções experimentais de BALB/c foram realizadas para avaliação da evolução da infecção causada pelo isolado híbrido selvagem M19672 e sua comparação com as cepas parentais L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi. Foi determinada a carga parasitaria em pele, linfonodo e baço dos animais infectados e análise histopatológica das lesões. Os resultados obtidos a partir da clonagem dos isolados demonstraram que se tratavam de populações homogêneas de parasitas. Três isolados apresentaram padrão heterozigoto de L. (V.) guyanensis/L. (V.) s. shawi e quatro isolados apresentaram padrão homozigoto, apresentando somente os alelos de L. (V.) s. shawi. O ensaio de clivagem de sequências polimórficas amplificadas (SNP-CAPS) mostrou que os homozigotos apresentaram o mesmo número de cópias de hsp70 de L. (V.) s. shawi, enquanto que nos heterozigotos os alelos de L. (V.) guyanensis são mais representativos. Os parasitas híbridos apresentaram uma maior plasticidade fenotípica no crescimento in vitro. A infeção de BALB/c pelos parasitas híbridos apresentou uma evolução rápida tendo seu maior pico entre 14 e 28 dias pós-infecção, com regressão posterior da lesão. Esse período foi acompanhado da maior carga parasitária na pele e linfonodo. A infecção causada pelas cepas parentais mostrou aumento progressivo da lesão a partir do 21° dia de infecção para L. (V.) guyanensis e 35° dia para L. (V.) s.shawi. As alterações histopatológicas da lesão causada pelo híbrido apresentaram um padrão intermediário entre as de L. (V.) s. shawi e L. (V.) guyanensis, guardando, no entanto, mais características desta última. Nossos achados confirmam que as cepas analisadas são híbridas entre L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi da região do Baixo Amazonas, estado do Pará, área com alta ocorrência de casos de LTA na Brasil e grande diversidade de espécies do parasita, vetores e reservatórios / Knowledge about the mechanisms of reproduction and generation of genetic diversity of the genus Leishmania organisms has been changed with the advent of new technologies for it studies. Laboratory researches have shown the occurrence of experimentally sexual reproduction in the genus Leishmania. Reports in the literature shows the occurrence of hybrids in the natural environment, associated with cases of american cutaneous leishmaniasis (ACL). From the phenotypic characterization performed using monoclonal antibodies and isozymes in strains isolated from patients with ACL in the Amazon region of Brazil, seven isolates (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 and M19697) showed an intermediate pattern between species L. (V.) shawi shawi and L. (V.) guyanensis. This study aimed to perform the confirmation of the hybrid identity of these parasites by performing cloning of the isolated, followed by analysis of polymorphism by cleavage of the polymerase chain reaction product (PCR RFLP) targeting heat shock enzyme 70 kilodaltons (hsp70). The hsp70 PCR RFLP was also used for comparative analysis of the intensity of the digestion products to estimate the ploidy of the hybrids and the proportion of the inheritance of hsp70 alleles. It was also observed in this study the biological in vitro behavior of these parasites. The growth curve in vitro was held at 4° and 12° passage after the isolation of mammalian host. Experimental infections of BALB /c mice were carried out to evaluate the evolution of the infection caused by the hybrid wild strain M19672 compared to the parental strains L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi. The parasitic load was determined on the skin, lymph nodes and spleen of infected animals and histopathology of the lesions. The results from the cloning of the isolates showed that these are homogeneous populations of parasites. Three isolates presented heterozygous L.(V.) guyanensis/ L.(V.) s. shawi pattern and four presented homozygous pattern with only the L.(V.) s. shawi alleles. The cleavage amplified polymorphic sequences assay (SNP-CAPS) showed that the homozygous had the same number of copies of hsp70 L. (V.) s. shawi, whereas in the heterozygous alleles L. (V.) guyanensis are more representative. Hybrid parasites demonstrated a higher phenotypic plasticity growth in vitro. BALB /c infection by M19762 hybrids showed a rapid evolution with a peak between 14 and 28 days post-infection, with subsequent lesion regression. The period of greatest development of the lesion was accompanied by higher parasite burden in the skin and lymph nodes. The infection caused by parental strains showed a progressive increase in the lesion from the 21th day of infection for L. (V.) guyanensis, and day 35 PI for L. (V.) s. shawi The alteration in the histopathological lesions caused by the hybrid strain showed an intermediate pattern between those of L. (V.) s. shawi and L. (V.) guyanensis, keeping, however, more characteristics of the latter. Our findings confirm that the strains analyzed are true hybrids between L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi from Amazon region, Pará state, an area with high occurrence of ACL in Brazil and diversity of parasite species, vectors and reservoirs

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas resultante da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos de resposta imune do hospedeiro. Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis são as espécies de maior potencial patogênico para o homem e de importância médica no Brasil. As células TCD4, quando ativadas por antígenos via MHC II podem se diferenciar em linhagens de células efetoras como Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg). IL-23 é indispensável para as funções efetoras e manutenção de células Th17. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de Foxp3, IL-17 e IL-23 em lesões cutâneas de pacientes com diferentes formas clínicas da LTA. Biópsias parafinadas de 44 pacientes foram submetidas à imunoistoquímica, sendo 6 casos de leishmaniose cutânea anérgica difusa (LCADIDRM-) e leishmaniose cutânea disseminada borderline (LCDBIDRM-), ambas causadas por L.(L) amazonensis e 16 casos de leishmaniose cutânea localizada (LCLIDRM+) também causada por L.(L.) amazonensis; 9 casos de LCLIDRM+, 2 casos de LCDBIDRM- e 5 casos de leishmaniose cutâneo-mucosa (LCMIDRM+), todos causados por L.(V.) braziliensis. A densidade de células Tregs Foxp3+ no espectro clínico da LTA mostrou um aumento progressivo partindo das formas centrais LCL causadas por L.(V.) braziliensis (170mm2) e L.(L) amazonensis (140mm2) para as formas polares, LCADIDRM- (289mm2) e LCDBIDRM- (183mm2) causada por L.(L) amazonensis, LCDBIDRM- (189mm2) e LCMIDRM+, causadas por L.(V.) braziliensis (158mm2). A comparação entre as densidades de células IL-17+ nas diferentes formas clínicas da LTA mostrou um perfil semelhante também com um aumento progressivo da expressão de IL-17 partindo das formas centrais LCLIDRM+ causadas por L.(V.) braziliensis (232mm2) e L.(L) amazonensis (197mm2) em direção as formas polares, LCADIDRM- (470mm2) e LCDBIDRM- (340mm2) causada por L.(L.) amazonensis, LCDBIDRM- (431mm2) e LCMIDRM+ (372mm2) causada por L.(V.) braziliensis. A densidade de células IL-23+ mostrou perfil similar ao de IL-17 como no espectro de doença causada por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis: LCADIDRM- (687mm2), LCDBIDRM- (518mm2) e LCLIDRM+ (348mm2) por L.(L.) amazonensis, LCLIDRM+ (457mm2), LCDBIDRM- (609mm2) e LCMIDRM+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. Diante dos nossos achados, observa-se que as células Foxp3+, IL-17+ e IL-23+ desempenham um papel importante na imunopatogênese das diferentes formas clínicas da LTA causadas por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis, caracterizada por uma resposta imune polarizada de diferente expressão patológica / The American cutaneous leishmaniasis (ACL) presents a wide spectrum of clinical and immunopathological manifestations resulting from the interaction between the different species of Leishmania and the mechanisms of the host immune response. Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis are the species with the largest pathogenic potential for humans and medical importance in Brazil. The CD4+ T cells can be differentiated into effector cell lines as Th1, Th2, Th17 and regulatory T cells (Treg). IL-23 is essential for effector functions and maintenance of Th17 cells, that produces IL-17. The aim of this study was to evaluate the expression of Foxp3, IL-17 and IL-23 in cutaneous lesions of patients with different clinical forms of ACL. Paraffin embedded biopsies from 44 patients were submitted to immunohistochemistry, there were 6 cases of anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (ADCLDTH-) and borderline disseminated cutaneous leishmaniasis (BDCLDTH-) both caused by L. (L.) amazonensis 16 cases of cutaneous leishmaniasis (LCLDTH+) caused by L. (L.) amazonensis, 9 cases of LCLDTH+, 2 cases of BDCLDTH- and 5 cases of mucocutaneous leishmaniasis (MCLDTH+) all caused by L. (V.) braziliensis. The density of Treg Foxp3+ cells in the clinical spectrum of ACL showed a progressive increase starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (170mm2) and L. (L) amazonensis (140mm2) towards the polar forms ADCLDTH- (289mm2). The intermediate clinical forms BDCLDTH- (183mm2) caused by L. (L) amazonensis and BDCLDTH-(189mm2) by L. (V.) braziliensis as well as, MCLDTH+(158mm2) did not present any significant differences. The comparison between the densities of IL-17+ cells in different clinical forms of ACL showed progressive increasing starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (232mm2) and L. (L) amazonensis (197mm2) towards the polar forms, ADCLDTH-(470mm2) and BDCLDTH-(340mm2) caused by L. (L.) amazonensis BDCLDTH- (431mm2) and MCLDTH+ (372mm2) caused by L. (V.) braziliensis. The density of IL-23+ cells showed a similar profile to that of IL-17 at the disease spectrum caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis: ADCLDTH-(687mm2) BDCLDTH-(518mm2) and LCLDTH+ (348mm2) by L. (L.) amazonensis; LCLDTH+ (457mm2) LCDBDTH-(609mm2) and MCLDTH+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. In view of our findings, we notice that the Foxp3+, IL-17+ and IL-23+ cells play an important role in the immunopathogenesis of different clinical forms of ACL caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis, characterized by an immune polarized response with different pathological expression

O diagnóstico da leishmaniose tegumentar (LT) baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos podendo ser confirmado por exames laboratoriais de rotina como a pesquisa direta do parasito por microscopia e a intradermorreação de Montenegro. Atualmente, os métodos moleculares, principalmente a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido considerados para aplicação em amostras clínicas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Este trabalho teve como objetivo a padronização e validação das técnicas de PCR-RFLP com diferentes iniciadores (kDNA, its1, hsp70 e prp1), visando o diagnóstico e a identificação das espécies de Leishmania presentes em amostras de DNA provenientes de lesões de pele ou mucosa de 140 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar. Para tal, realizamos ensaios de: 1) sensibilidade das PCRs com os diferentes iniciadores, 2) especificidade dos ensaios utilizando DNAs de diferentes espécies de referência de Leishmania, de tripanossomatídeos inferiores e de fungos, 3) validação das técnicas de PCR-RFLP com os iniciadores estudados em amostras de DNA de lesões de pele ou mucosas de pacientes com LT. Os resultados dos ensaios de limiar de detecção das PCR (sensibilidade) mostraram que os quatro iniciadores do estudo foram capazes de detectar o DNA do parasito, porém em quantidades distintas: até 500 fg com os iniciadores para kDNA e its1, até 400 fg com hsp70 e até 5 ng com prp1. Quanto à especificidade dos iniciadores, não houve amplificação dos DNAs fúngicos. Por outro lado, nos ensaios com os iniciadores para kDNA e hsp70, verificamos amplificação do fragmento esperado em amostras de DNA de tripanossomatídeos. Nos ensaios com its1 e prp1, o padrão de amplificação com os DNAs de tripanossomatídeos foi diferente do apresentado pelas espécies de Leishmania. Verificou-se nos ensaios de validação que o PCR-kDNA detectou o parasito em todas as 140 amostras de DNA de pacientes e, assim, foi utilizado como critério de inclusão das amostras. A PCR-its1 apresentou menor sensibilidade, mesmo após a reamplificação com o mesmo iniciador (85,7% ou 120/140 amostras). Para os ensaios da PCR-hsp70, as amostras de DNA foram amplificadas com Repli G, para obter uma sensibilidade de 68,4% (89/140 amostras). A PCR-prp1 não detectou o parasito em amostras de DNA dos pacientes. Quanto aos ensaios para a identificação da espécie presente na lesão, a PCR-kDNA-RFLP-HaeIII e a PCR-its1- RFLP-HaeIII permitem a distinção de L. (L.) amazonensis das outras espécies pertencentes ao subgênero Viannia. A PCR-hsp70-RFLP-HaeIII-BstUI, apesar de potencialmente ser capaz de identificar as seis espécies de Leishmania analisadas, quando utilizada na avaliação das amostras humanas permitiu apenas a identificação de L. (V.) braziliensis. No entanto, é uma técnica com várias etapas e de difícil execução, o que pode inviabilizar o seu uso rotineiro em centros de referência em diagnósticos. Assim, recomendamos o uso dessa metodologia apenas em locais onde várias espécies de Leishmania sejam endêmicas. Finalmente, os resultados indicam que o kDNA-PCR devido à alta sensibilidade apresentada e facilidade de execução pode ser empregada como exame de rotina nos centros de referência, permitindo a confirmação ou exclusão da LT. / The diagnosis of cutaneous leishmaniasis is based on clinical and epidemiological criteria and can be confirmed by routine laboratory tests such as direct detection of parasites by microscopy and by Montenegro skin test. Currently, the molecular methods, especially the polymerase chain reaction (PCR) have been considered for use in clinical samples due to its high sensitivity and specificity. This study aimed to standardize and validate the PCR-RFLP techniques with different primers (kDNA, its1, hsp70 and prp1) for the diagnosis and identification of Leishmania species present in DNA samples from skin or mucosal lesions of 140 patients with suspected cutaneous leishmaniasis. The following assays were performed to evaluate the 1) sensitivity of the PCRs with different pairs of primers, 2) specificity of the markers using DNAs of various species of Leishmania, lower trypanosomatids and fungi, 3) validate the PCR-RFLP techniques with DNA samples from skin or mucosal lesions of patients with LT. The results of the PCR detection threshold tests (sensitivity) showed that the four study pairs of primers were able to detect the DNA of the parasite, but in different quantities: up to 500 fg with kDNA and its1, 400 fg with hsp70 and up to 5 ng with prp1. Regarding the specificity of the primers, no amplification was observed with fungal DNA. On the other hand, the expected fragments for kDNA and hsp70 PCR were amplified with DNA of trypanosomatids. In its1 and prp1- PCR the pattern of amplification with the DNA of trypanosomatids was different of the one observed for species of Leishmania. In validation assays of PCR-kDNA protocol the parasite was detected in all 140 DNA samples from patients and it was used as inclusion criteria of the samples. The its1-PCR showed lower sensitivity even after reamplification (85.7% or 120/140 samples). The hsp70-PCR validation test was done with DNA samples amplified with Repli G, we obtained a sensitivity of 68.4% (89/140 samples). The PCR-prp1 did not detect the parasite in DNA samples from patients. Concern the tests for the identification of species present in the lesion, PCR-RFLP kDNA-HaeIII and PCR-RFLP ITS1-HaeIII enable distinction L. (L.) amazonensis from the other species belonging to the subgenus Viannia. The PCR-RFLP hsp70-BstUI, HaeIII, although potentially able to identify the six species of Leishmania studied, when it was used in the evaluation of only human samples, it identified only L. (V.) braziliensis. However, PCR-RFLP hsp70-BstUI, HaeIII is a technique with several stages and difficult to implement, which can derail your routine use in referral centers for diagnosis. Thus, we recommend using this method only in places where various Leishmania species are endemic. Finally, our results indicate that kDNA-PCR due to the high sensitivity and ease of execution could be used as a routine examination in reference centers, allowing the confirmation or exclusion of LT.

As leishmanioses são doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania e são importante problema de saúde pública. A leishmaniose cutânea americana é considerada doença autóctone do continente americano e se apresenta com diversas formas clínicas, que dependem da espécie que causa a infecção e de outros fatores como virulência e capacidade de evasão do sistema immune. São reconhecidas seis espécies de Leishmania que causam casos humanos de LCA no Brasil, destas, cinco pertencem ao subgênero Viannia e uma ao subgênero Leishmania. Elas são: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) naiffi e a Leishmania (Leishmania) amazonensis. A transmissão da leishmaniose cutânea se mantém na região do Pontal da Paranapanema, com 20 casos notificados em 2006. A Leishmania (V.) braziliensis é a única espécie considerada como agente da doença na região, com identificação dos vetores envolvidos e de possíveis reservatórios silvestres. O objetivo do trabalho é o estudo dos aspectos epidemiológicos, clínicos e histopatológicos da leishmaniose cutânea no Pontal do Paranapanema e a identificação, por métodos moleculares, PCR, do agente etiológico e a caracterização do gênero, subgênero e a espécie de Leishmania presentes na região. A doença foi encontrada em ambos os sexos, predominando no sexo masculino (67,9%), em todas as faixas etárias, mas 70,5% estavam na faixa de 20 a 49 anos de idade. A forma clínica mais encontrada foi a cutânea, com 92,3% dos casos. A pesquisa de parasita na lesão em 78 pacientes que realizaram biópsias foi positiva em 40 amostras (51.3%), em lâminas coradas pela HE; quando se utilizou a IH foi 66,7%. O índice de concordância entre as técnicas da HE e IH foi de 58,97%. Entretanto, 10 casos negativos na IH foram positivos na HE, e de 38 casos negativos na HE, 22 foram positivos na IH. Isto mostra que há necessidade de associação dos dois métodos. A positividade na PCR foi de 53,8%. Avaliando-se os resultados obtidos nesse estudo, podemos verificar que dos 40 casos positivos pela HE, 24 também foram positivos pela PCR; porém, 16 destes, foram negativos pela PCR. Em contrapartida, das 38 amostras negativas na HE, 18 delas foram positivas pela PCR. Pela imunohistoquímica, do total de 26 amostras negativas, apenas 12 permaneceram negativas e 14 foram positivas na PCR; enquanto que, das 52 amostras positivas pela IH, 28 foram positivas e 24 negativas pela PCR. Os níveis de concordância da PCR com HE foram de 56,41% e da PCR com IH de 51,28%. Esses resultados reforçam a idéia da necessidade de se associar os três métodos para o diagnóstico da LC. As características das lesões histopatológicas foram: reação granulomatosa (RG) encontradas em 71,85%, reação granulomatosa com células gigantes (RGCG) em 12,8%, reação granulomatosa com necrose (RGN) em 10,3% e reação granulomatosa com necrose e células gigantes (RGNCG) em 5,1% dos casos. Utilizando-se os primers SSU rDNA S17/S18, foi possível caracterizar, através do seqüenciamento, 27 (34,6%) amostras como sendo do subgênero Viannia e 06 amostras como L. (L.) amazonensis. Este estudo identificou o primeiro caso de L. (L.) amazonensis na região / Leishmaniasis are parasitic diseases caused by protozoans of the Leishmania genus and are important public health problems. American cutaneous leishmaniasis (ACL) is considered an autochthonous disease of the American continent and presents several clinical forms which depend on the causative species of the infection and other factors such as virulence and ability to evade the immune system. Six Leishmania species are recognized to cause human ACL cases in Brazil of which five belong to the Viannia and one to the Leishmania subspecies. They are: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia) naiffi and Leishmania (Leishmania) amazonensis. Cutaneous leishmaniasis transmission is maintained in the Pontal do Paranapanema region, with 20 notified cases in 2006. Leishmania (V.) braziliensis is the only species considered to be the disease agent in the region with identification of the involved vectors and possible wild reservoirs. The aim of this research is the studies of the epidemiological, clinical and histopathological aspects of cutaneous leishmaniasis in the Pontal do Paranapanema and the identification by molecular methods, PCR, of the etiologic agent and characterization of the Leishmania genus, subgenus and species present in the region. The disease was found in both genders, with predominance of males (67.9%), in all age ranges, but 70.5% were in the range of 20 to 49 years. The cutaneous was the mostly found clinical form with 92.3% of the cases. Search for the parasite in the lesion of 78 patients who underwent biopsies was positive in 40 samples (51.5%), in HE stained slides; when IH was used, 66.7% were positive. Agreement index between the HE and IH techniques were 58.97%. However, 10 negative cases using IH were positive with HE, and of 38 HE negative cases 22 were positive using IH. This shows that association of the two methods is needed. Using PCR, there was a positivity of 53.8%. Evaluating the results obtained in this study, we may observe that of the 40 HE positive cases 24 were also positive on PCR; but 16 of these were PCR negative. Contrariwise, of the 38 HE negative samples 18 were positive PCR. Using immunohistochemistry, of the total of 38 HE negative samples, 18 were positive with PCR; while of the 52 IH positive samples, 28 were positive and 24 negative on PCR. Agreement levels of PCR with HE were 56.41%, and of PCR with IH 51.28%. These results reinforce the idea of the need for association of the three methods for CL diagnosis. Histopathological lesion characteristics were: granulomatous reaction (GR) found in 71.85%, granulomatous reaction with giant cells (GRGC) in 12.8T, granulomatous reaction with necrosis (GRN) in 10.3% and granuloma with necrosis and giant cells (GRNGC) in 5.1% of the cases. Using SSU rDNAS 17/S18 primers it was possible to characterize through sequencing 27 (34.6%) samples as being of the Viannia subgenus and 06 samples of the L. (L.).amazonensis This study identified the first L. (L.) amazonensis case in the region

Em todas as formas clínicas da leishmaniose tegumentar americana os macrófagos são as células efetoras mais importantes na destruição do parasita intracelular. As células dendríticas são células apresentadoras de antígeno localizadas nos sítios de inoculação, como pele e mucosa. Os dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos são células derivadas de linhagem mielomonocítica e consideradas complementares às células de Langerhans no processo de apresentação de antígenos e indução da resposta imune. As células dendríticas plasmocitoides representam um subgrupo de células dendríticas precursoras presentes no sangue periférico e órgãos linfoides. Estas células são identificadas pela alta expressão de receptor da cadeia alfa da interleucina-3 (CD123) e são fortes produtoras de interferon tipo I. Elas são raramente observadas na pele humana normal, e foram demonstradas em dermatoses inflamatórias e virais. O óxido nítrico e seus derivados atuam como moléculas efetoras da citotoxicidade macrofágica contra parasitas. A expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e a geração de óxido nítrico é importante no controle da infecção por diferentes espécies de Leishmania. Cinqüenta e dois espécimes de biópsias cutâneas de pacientes diagnosticados com leishmaniose tegumentar americana foram classificados histologicamente de acordo com o padrão de resposta tecidual, se granulomatoso ou inflamatório difuso não específico. O objetivo deste estudo foi demonstrar e quantificar a presença de células dendríticas plasmocitoides em 36 das biópsias, através de estudo imuno-histoquímico com anticorpo anti-CD123, comparando os achados entre os diferentes tipos de resposta tecidual; verificar a expressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos e comparar com a expressão de iNOS por macrófagos nas lesões cutâneas, através de estudo imuno-histoquímico com dupla marcação pelos anticorpos antiCD68 e antiiNOS em 43 biópsias cutâneas, e pelos anticorpos anti-Fator XIIIa e antiiNOS em 34 amostras, comparando os achados entre os diferentes padrões de resposta tecidual. Foram evidenciadas células dendríticas CD123+ em todos espécimes de lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana estudados. Em 22/36 amostras, as células dendríticas plasmocitoides estavam dispostas isoladamente entre outras células inflamatórias; em 14/36 amostras estavam agrupadas, pelo menos focalmente, principalmente no grupo granulomatoso (13 amostras) e em um caso do grupo não específico; dez amostras exibiram células na junção dermoepidérmica, sendo oito no grupo granulomatoso e duas no grupo não específico. Entretanto, não houve diferença no número de células CD123+/mm2 entre os dois grupos estudados. Esses resultados sugerem que as células dendríticas plasmocitoides participam da resposta imune nas lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana. A expressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos foi evidenciada em todos os espécimes estudados, sendo que a maioria dos macrófagos expressou iNOS. Não houve diferença estatisticamente significativa entre o número de células CD68+/mm2 e CD68+iNOS+/mm2 nos diferentes padrões de resposta tecidual, tampouco no número de células Fator XIIIa+/mm2, mas o número de células FatorXIIIa+iNOS+/mm2 foi maior no grupo granulomatoso. Quando comparadas 34 amostras, todas elas submetidas a estudos com anticorpos anti-Fator XIIIa, anti-CD68, anti- FatorXIIIa/iNOS e anti-CD68/iNOS, foi maior o número total de macrófagos que dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos, expressando ou não iNOS, e a porcentagem de macrófagos coexpressando iNOS foi maior que a coexpressão de iNOS por dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos, mas esta diferença não foi estatisticamente significativa quando comparados os grupos histológicos separadamente. Os resultados demonstram que os dendrócitos dérmicos Fator XIIIa positivos expressam iNOS, menos que os macrófagos, mas proeminentemente no grupo granulomatoso, sugerindo a sua participação na patogênese de lesões cutâneas de leishmaniose tegumentar americana, como células com capacidade leishmanicida e/ou apresentadoras de antígeno / In all forms of American tegumentary leishmaniasis lesions, macrophages are the most important effector cells involved in intracellular parasite destruction. Dendritic cells are antigen-presenting cells that are localized at the entry sites, such as skin and mucosa. Factor XIIIa+ dermal dendrocytes are bone marrow-monocytic lineagederived cells and considered complementary cells to Langerhans cells in the process of antigen presentation and inducing immune response. Plasmacytoid dendritic cells constitute a subset of dendritic cells precursors in peripheral blood and organized lymphoid tissue. These cells are identified by their high levels of interleukin-3 receptor alpha chain (CD123) and are vigorous type I interferon producing cells. They are rarely present in normal human skin, and have been demonstrated in inflammatory and viral dermatoses. Nitric oxide radical and derivatives act as effector molecules of macrophage cytotoxicity against invading parasites. Expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and generation of nitric oxide is important in control of infection in different Leishmania species. Fifty-two samples of skin biopsies obtained from American tegumentary leishmaniasis patients were histologically classified as granulomatous reaction or non specific diffuse inflammatory reaction. The aim of the study was to demonstrate and quantify the presence of plasmacytoid dendritic cells in thirty-six skin biopsies, by immunohistochemistry with anti-CD123, comparing findings in both patterns of tissue response; to verify the expression of iNOS by Factor XIIIa+ dermal dendrocytes and compare to the expression of iNOS by macrophages in cutaneous lesions, by doublestaining technique with antiCD68 and antiiNOS antibodies in forty-three skin biopsies and anti-factor XIIIa and antiiNOS antibodies in thirty-four biopsies, comparing findings between different tissue response patterns. Dendritic CD123+ cells were demonstrated in all specimens of American tegumentary leishmaniasis lesions. The number of CD123+ cells/mm2 in the two groups did not differ. In 22/36 samples, plasmacytoid dendritic cells were intermingled with other inflammatory cells, and were grouped, at least focally, in 14/36 samples. Thirteen cases from the granulomatous group and one non specific case showed clusters of cells in the dermal inflammatory infiltrate. Ten biopsies displayed plasmacytoid dendritic cells at the dermoepidermal junction, two in the non specific group and eight in the granulomatous group. The findings suggest that plasmacytoid dendritic cells participate in the immune response of American tegumentary leishmaniasis skin lesions. Expression of iNOS by Factor XIIIa+ dermal dendrocytes was shown in all specimens, and most of the macrophages expressed iNOS. The total number of CD68+ cells/mm2 and CD68+iNOS+ cells/mm2 in the two groups did not differ, nor the total number of FactorXIIIa+ cells/mm2, but the number of FactorXIIIa+iNOS+ cells/mm2 was higher in the granulomatous group. When comparing thirty-four samples that were all tested to anti-Factor XIIIa, anti-CD68, anti-FactorXIIIa/anti-iNOS and anti-CD68/anti-iNOS, it was higher the total number of macrophages, either non-expressing or expressing iNOS than iNOS-expressing Factor XIIIa+ dermal dendrocytes, and the total percentage of iNOS-expressing macrophages was higher than iNOSexpressing Factor XIIIa+ dermal dendrocytes, but this percentage was not significant when granulomatous and non specific groups were separately analyzed. The results demonstrate that FactorXIIIa+ dermal dendrocytes express iNOS, less than macrophages, but prominently in the granulomatous group, suggesting they play a role in the pathogenesis of American tegumentary leishmaniasis skin lesions as immune effectors and/or antigenpresenting cells

Introdução: ao longo da história da leishmaniose tegumentar (LT), o comprometimento do tecido ósseo foi pouco estudado, principalmente na forma clínica difusa (LCD). Os estudos que abordaram o tema concentraram-se nas observações clínicas, estudos radiográficos e na visão paleopatológica, numa tentativa de explicar as lesões ósseas que alguns indivíduos com LT apresentavam. A literatura sobre infecção óssea cita como agente causador de osteomielite no homem, principalmente, bactérias e fungos. Objetivo: estudar as alterações ósseas na leishmaniose cutânea difusa (LCD), através da cintilografia óssea trifásica, radiografias e histopatológico. Métodos: o presente estudo analisa a associação entre a Leishmania (Leishmania) amazonensis e as alterações ósseas em oito pacientes com LCD, procedentes de diversos pólos de produção da doença (LT) no Estado do Maranhão. Foram realizados, nesta investigação, dois estudos: observacional em humanos, utilizando exames de imagens (cintilografia óssea trifásica e radiografias) e histopatológico do tecido ósseo (Hematoxilina- Eosina, Imunohistoquímica, Ziehl-Neelsen e Gomori-Grocott); e um estudo experimental de infecção óssea crônica produzida pela Leishmania, em camundongos BALB/c, através do histopatológico (Hematoxilina-Eosina). Resultados: a análise clínica mostrou a presença de deformidades nas extremidades distais dos membros superiores e inferiores em 50% dos casos, com limitação funcional associadas às lesões cutâneas. Nos estudos de imagens, a cintilografia mostrou hipercaptação na fase tardia em várias áreas de uma mesma região, caracterizando processos inflamatórios múltiplos no tecido ósseo em todos os pacientes. A radiografia demonstrou características de reabsorção óssea parcial das falanges distais dos dedos das mãos e pés, bilateral em seis pacientes. Revelou, também, lesões líticas nas falanges proximais das mãos em dois pacientes. O exame histopatológico demonstrou a presença de um quadro de osteomielite crônica em quatro pacientes, sendo detectado a Leishmania. Foi realizada pesquisa para micobactérias e fungos no tecido ósseo, que foram negativas. O modelo experimental caracterizou um quadro de infecção óssea crônica, demonstrando o comprometimento do tecido cartilaginoso secundariamente. Conclusões: todos os pacientes apresentaram algum tipo de comprometimento ósseo. As deformidades localizaram-se nas extremidades distais em seis pacientes. A cintilografia óssea e a radiografia foram importantes na localização e no seguimento das lesões ósseas. Através do exame histopatológico ficou evidente a relação entre a L.(L.) amazonensis e infecção óssea, caracterizando um quadro de osteomielite crônica. Portanto, fica a proposta de modificação da classificação etiológica da osteomiielite crônica, incluindo o protozoário, Leishmania (L) amazonensis , como agente causador / Introduction: Since the early history of Cutaneous Leishmaniasis (CL), there are few studies on the bone involvement in CL, mainly related to the Cutaneous Diffuse Leishmaniasis (CDL). The studies were mainly related to the clinical observation, radiographical aspects and the paleopathological view, on the attempt to explain the bone lesions found in some individuals with CL. The literature on bone infection reports the bacteria and fungi as agents of osteomyelitis in man. Objective: to study the bone changes in Cutaneous Diffuse Leishmaniasis (CDL), through the scintilography, radiography and histopatological aspects. Methods: the study analyzed the association of the Leishmania (Leishmania) amazonensis and the bone changes in eight patients with CDL, from eight endemic poles of the disease in the State of Maranhão. Two studies were carried out: human observations using images exams such as scintilography, radiography and histopathology of the bone tissue using the Hematoxilin - Eosine, Ziehl Neelsen and the Gomori-Grocott stain and also by immunohistochemistry. An experimental study of chronic bone infection induced by the Leishmania in BALB/c mice, were carried out analyzed through the histopathology (Hematoxylin-Eosin). Results: the clinical analysis showed deformity in the upper and inferior extremities in 50% of the cases, with functional limitation. On the studies of images, the scintilography showed hipercaptation on the late phase, in different areas of the same region, characterizing multiples inflammation in the bone of all patients. The radiography demonstrated characteristics of bone partial reabsortion of the feet and hands, bilateral in six patients. Lithic changes were also detected in fingers, of two patients. The histopathology showed chronic osteomyelitis in four patients, with detection of the Leishmania ( L.) amazonensis parasite. The research for mycobacteria and fungi in the bone tissue were negatives. The experimental model showed chronic infection of the bone tissue, demonstrating that the cartilage was secondarily involved. Conclusion: all patients presented some type of bone changes. The deformities were located in the extremities in six patients. The scintilography of the bone and radiography were important for localization and follow up of the bone lesions. The histopathological exams showed the relationship between Leishmania (L) amazonensis and bone infection, characterizing chronic osteomyetitis. We proposed that the Leishmania (L) amazonensis should be included as agent of chronic osteomyelitis