Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-25T21:03:51Z No. of bitstreams: 1 Cristiane Santos Nascimento Uso de método de biologia molecular....pdf: 1323686 bytes, checksum: caf3acf13d85858d02cc05e45a821e9c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T21:03:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Santos Nascimento Uso de método de biologia molecular....pdf: 1323686 bytes, checksum: caf3acf13d85858d02cc05e45a821e9c (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral humana (LVH) é uma importante causa de morbidade e mortalidade no Brasil. Apesar dos avanços no conhecimento da epidemiologia da LVH, ainda existem lacunas importantes nas informações sobre os principais reservatórios desta zoonose. A técnica validada para avaliação da infectividade de reservatórios, xenodiagnóstico, é um método laborioso, demorado e difícil de executar, portanto, inapropriado para a triagem de grande número de animais. A padronização de método capaz de quantificar a carga parasitária presente em diferentes tecidos pode oferecer respostas importantes sobre a epidemiologia e a prevenção da LVH. OBJETIVO: Avaliar a carga parasitária em diferentes amostras biológicas de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi, utilizando método de biologia molecular quantitativo, PCR real-time (qPCR). MÉTODOS:Entre nov/2004 e abr/2007, foram realizados seis inquéritos soro-epidemiológicos em duas áreas endêmicas para LVH. Os cães soropositivos foram eutanasiados e submetidos a: exame de cultura, parasitológico direto e exame histológico para confirmação da infecção. Amostras de sangue periférico e fragmento de pele foram coletadas em todos os animais para determinação da carga parasitária. Adicionalmente, coletou-se também swab da conjuntiva, aspirado de medula óssea e linfonodo para realização do teste de qPCR nos cães incluídos no último inquérito (abr/2007). A técnica de qPCR foi padronizada utilizando um par de primers LEIF e LEIR e sonda LEIP selecionados no gene SSu rRNA. A seleção dos primers e sonda foi realizada utilizando o programa Primer Express (Perkin-Elmer-Applied Biosystems). A sonda fluorogênica foi sintetizada utilizando uma molécula FAM ligada na extremidade 5‟ e TAMRA ligada à extremidade 3‟(Perkin-Elmer -Applied Biosystems). Para determinar a carga parasitária foi realizada curva padrão com o DNA obtido da cultura de L. chagasi em concentrações variando de 101 a 107 parasitas/ml. Cada ponto da curva foi testado em triplicata. RESULTADOS: Dos 98 cães soropositivos identificados, foi detectado DNA de Leishmania em 57% das amostras de sangue total, em 56% das amostras de pele e em 100% das amostras de medula óssea, linfonodos e swab da conjuntiva. A carga parasitária em sangue periférico e swab da conjuntiva não ultrapassou 103 parasitas/ml sendo mais comumente detectado 1 a 10 parasitas/ml. Por outro lado, em pele, medula óssea e linfonodos a carga parasitária passou de 104 parasitas/ml, além disso, as quantidades de DNA detectadas se distribuíram com maior freqüência na categoria acima de 104 parasitas/ml, notadamente em amostras de linfonodos. CONCLUSÕES: O qPCR apresentou alta sensibilidade nas amostras biológicas estudadas, particularmente em linfonodos , medula óssea e pele. Nossos resultados indicam que o qPCR pode ser utilizado numa variedade de amostras biológicas para a quantificação da carga parasitária de cães naturalmente infectados por Leishmania sp. Estudos de validação do qPCR para avaliar a capacidade de reservatórios da LV, em lugar do xenodiagnóstico, e para investigar o papel do qPCR na triagem de cães em programas de controle/prevenção da LV devem ser conduzidos. / INTRODUCTION: Human visceral leishmaniasis (LVH) is an important cause of morbidity and mortality in Brazil. Despite advances in knowledge of the epidemiology of LVH, there are still important gaps in information on the main reservoirs of this zoonotic disease. The validated technique for assessing the infectivity of reservoirs, xenodiagnosis, is laborious, time consuming and difficult to implement, therefore, inappropriate for screening large numbers of animals. A standardized method to quantify the parasite load present in different tissues may provide important answers on the epidemiology and prevention of LVH. OBJECTIVE: To assess the parasite load in different biological samples from dogs naturally infected by Leishmania chagasi using a molecular biology quantitative method, real-time PCR (qPCR). METHODS: From nov/2004 to apr/2007, six seroepidemiological surveys were conducted in two endemic areas for LVH. The seropositive dogs were euthanized and submitted to: culture, direct parasitological and histological examination to confirm infection. Blood samples and skin fragments were collected in all animals to determine the parasite load. Additionally, conjuntival swabs, bone marrow and lymph node aspirates were also collected to do qPCR in dogs included in the last survey (apr/2007). The qPCR technique was standardized using a pair of primers and probe and LEIF /LEIR and LEIP selected in the SSU rRNA gene. The selection of primers and probe was performed using the program Primer Express (Perkin-Elmer-Applied Biosystems). The fluorogenic probe was synthesized using a FAM molecule attached at the 5 'end and TAMRA linked to the 3' end (Perkin-Elmer-Applied Biosystems). In order to determine the parasite load a DNA standard curve was plotted with DNA obtained from L. chagasi culture in concentrations ranging from 101 to 107 parasites/ ml. Each point on the curve was tested in triplicate. RESULTS: Of the 98 seropositive dogs identified Leishmania DNA was detected in 57% of the whole blood samples, 56% of the skin samples and 100% of bone marrow, lymph nodes and conjuntival swabs samples. The parasite load in peripheral blood and conjuntival swab did not exceed 103 parasites/ml, and was more commonly in the range of 1-10 parasites /ml. On the other hand, skin, bone marrow and lymphnode parasite burden exceeded 104 parasites / ml, in addition, the quantities of DNA detected were distributed more frequently in the category above 104 parasites/ml, especially in lymphnodes samples. CONCLUSIONS: qPCR showed high sensitivity in biological samples studied, particularly in lymphnodes, bone marrow and skin. Our results indicate that qPCR could be used in a variety of biological samples to quantify the parasite load in dogs naturally infected by Leishmania sp. qPCR validation studies to assess potential reservoirs for VL (replacing xenodiagnosis), and to investigate the role of qPCR in dog screening programs for the control/prevention of LV should be conducted.

Made available in DSpace on 2012-09-05T18:24:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 65.pdf: 2874138 bytes, checksum: 504f025a2851709cdc9daea0f331ea38 (MD5) Previous issue date: 2000 / Desde 1900 a 1995, cuatro fueron las razones que justificaban la defensa de la antigüedad de Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA) en el Perú: 1) la existencia de ciertas piezas de cerámica antropomórfica Mochica, o huacos, con mutilaciones principalmente de los labios superiores y de la nariz; 2) las breves referencias proporcionads por algunos cronistas de la época de la conquista y del primer período de la colonia; 3) la existencia de determinados términos quechuas, que indicaríam ideas asimilables a la de la uta; y 4) el área de distribución epidemiológica actual bien definida y fija através del tiempo. Sin embargo, todas eran evidencias debiles e indirectas, y sin contexto arqueológico. Objetiva la búsqueda de material humano paleopatológico, que al mismo tiempo constituya evidencia directa que pueda contribuir para la solución definitiva de esa cuestión que ya dura aproximadamente un siglo. La evidencia paleopatólogica de alteración mucoso deformante en poblaciones humanas del antiguo Perú sugiere la presencia de LTA en una posible población agrícola que vivió próximo al área actualmente endémico de leishmaniasis, entre los siglos XIV-XVI. Las ppoblaciones oriundas del Perú que habitan determinadas regiones de esta endemia "aparentemente" no son afectadas por esta patología, probablemente por la antigüedad de la misma en esa región. La metodología es concerniente a la anatomia patológica, pasando por 2 etapas: primero fue definir el patrón patológico de LTA de forma mucosa en el cráneo humano, seleccionando pacientes en tratamiento del Centro de Pesquisa Hospital Evandro Chagas (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, con historia clínica y destrucción del macizo facial, principalmente la cavidad oro-nasal. Segundo, la búsqueda de un material arqueológico que se prestase a esta comparación. Así, revisamos 241 cráneos procedente del cementerio Inca de Makat-tampu, valle de Rímac, Lima, Perú. La tasa de 2,07 por dento de lesione mucosas compatibles con LTA puede sugerir que la prevalencia era alta en tiempos prehisplánicos y confirman la hipótesis y los antecedentes indirectos. Este estudio paleopatológico tiene por base el enfoque biocultural que permitió aproximarnos a la reconstrucción histórica de la vida cotidiana de los hombres agrícolas del valle de Rimac, durante la ocupación Incaica entre los siglos XIV y XVI después de Cristo.

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:11:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 931.pdf: 2559338 bytes, checksum: 81765c5f9e4ac09d7a50eca0857f5995 (MD5) Previous issue date: 2006 / Esse é um estudo descritivo que tem como objetivo avaliar a possibilidade de utilização das várias bases de dados disponíveis nos serviços de saúde para caracterizar o padrão de distribuição espaço temporal da leishmaniose tegumentar. Como estudo de caso, para analisar a adequação dos dados e dos instrumentos, foi selecionada uma região de alta endemicidade da Mata Atlântica no Estado do Rio de Janeiro, no período de 1990 à 2004. Procurando assim contribuir para a construção de um sistema de informação orientado para a vigilância e o controle do processo de transmissão no nível de localidade. (...) Essa base territorial possibilitou a sobreposição das informações e a sua comparação em diferentes períodos, permitindo analisar o sistema de informação em nível sub-municipal. A análise dos dados evidenciou a falta de sincronicidade na produção de casos nas diversas unidades territoriais envolvidas no processo endêmico epidêmico, nos diferentes níveis de análise considerados, mostrando que esse processo está em constante movimento. Os dados mostram também que a dinâmica da transmissão da leishmaniose tegumentar na Região da Baía da Ilha Grande não dependeu de deslocamentos populacionais importantes, podendo ocorrer tanto em áreas com crescimento como em áreas com decremento populacional. No nível local, observou-se que os dados do sistema de informação permitiram a identificação e caracterização adequada do local de residência, possibilitando a identificação de características relevantes do lugar de transmissão, como sendo autolimitados no tempo e não associados a desmatamentos recentes. Isto apóia a hipótese de que o processo de transmissão esteja mais ligado à presença e circulação de roedores que estejam se deslocando de forma continuada na região do que da densidade local de vetores ou da permanência de cães infectados no domicílio, levantando a possibilidade de novas estratégias de controle orientadas para os focos de transmissão.

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:11:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 889.pdf: 11030552 bytes, checksum: 5dc0c575c22ba65b615af1b315fa94bb (MD5) Previous issue date: 2006 / (...) O objetivo deste estudo foi descrever a situação epidemiológica da LV no município de Palmas e analisar sua distribuição espacial na cidade no período de 1995 a 2004. Foram analisados os casos notificados no SINAN, na FUNASA, no SIM e na Secretaria Municipal de Saúde de Palmas, considerando-se apenas pacientes residentes em Palmas, cujas fichas de investigação apresentavam campo da classificação final confirmado para a LV.(...) O primeiro registro de caso de LV em Palmas data de 1990, ano de implantação da cidade. De lá para cá a doença se disseminou por varias regiões da capital, e hoje é encontrada em grande parte das quadras/loteamentos. A LV em Palmas se caracteriza como uma doença de transmissão claramente urbana, pois quase a totalidade dos casos (98 por cento) procedia de ambiente urbano. (...) A transmissão da LV em Palmas apresentou um comportamento claramente cíclico, com picos em 1996, 1999, 2001 e 2003. Ademais, evidenciou-se um aumento crescente dos picos ao longo dos anos, acompanhando o crescimento populacional e a ocorrência de importantes modificações ambientais, como a formação do lago da UHE Lajeado. A permanência de fragmentos vegetais entremeados por quadras habitadas e consolidadas, as constantes migrações, os desmatamentos (conseqüente da formação do reservatório da UHE Lajeado, da expansão urbana e da constante roçagem de lotes baldios, logradouros e áreas verdes), além da carência de infra-estrutura básica na área de saneamento, em especial nas áreas periféricas, são condições que possivelmente contribui para a manutenção do ciclo de transmissão da doença em Palmas.

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:11:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 173.pdf: 2208383 bytes, checksum: 635f306a24f3f4622676b8f32494f657 (MD5) Previous issue date: 2000 / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa de evoluçao crônica, causada por protozoários do gênero Leishmania, que pode acometer pele e mucosas do nariz, boca, faringe e laringe, isoladamente ou nao. E uma zoonose transmitida por insetos, genericamente conhecidos como flebotomíneos, popularmente chamados de mosquito palha, cangalhinha, tatuquira, etc. A Organizaçao Mundial da Saúde (OMS) inclui a LTA entre as seis doenças infecciosas e parasitárias prioritárias para açoes de controle, pelo seu potencial epidêmico. Com o objetivo de tentar melhor compreender a epidemiologia da Leishmaniose Tegumentar Americana no Estado do Espírito Santo, realizou-se um estudo do numero de casos acontecidos no período de 1989 a 1998 por município, utilizando-se Sistemas de Informaçao Geográfica-SIG. Foram calculadas as taxas de incidência por município, considerando os limites administrativos de 1991, tomando-se por base os dados como sao registrados pela Fundaçao Nacional de Saúde (Regional Espírito Santo) e a populaçao fornecida pelo IBGE. Foi feita a regularizaçao da série temporal através de Médias Móveis de 5 meses, para diminuir a flutuaçao dos dados, e feito também a modelagem da tendência através de polinômio de terceiro grau. Utilizando-se alguns tipos de análise, fizeram-se as projeçoes em mapas, ano a ano categorizando de acordo com os parâmetros utilizados pela FNS para classificar Taxas Baixas, Médias, Altas e Muito Altas e estudar o comportamento espacial da Leishmaniose Tegumentar Americana por município. Para análise espacial considerando o número de casos, as respectivas taxas de incidência e suas relaçoes com as variáveis ambientais, utilizou-se o SIG Arc-View, através de mapas coropléticos com sobreposiçao de camadas, além do software S-Plus para utilizar-se o Estimador de Kernel para alisamento dos dados no sentido de se determinar as "Areas Quentes" e verificar a intensidade do evento em relaçao a área estudada.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-09-11T14:49:08Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Carolina Cunha Monteiro.pdf: 2690341 bytes, checksum: c13f5fff0318498b18aff1d8e3e2f76e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-11T14:49:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Carolina Cunha Monteiro.pdf: 2690341 bytes, checksum: c13f5fff0318498b18aff1d8e3e2f76e (MD5) / FAPEMIG CNPq CAPES Fundação Oswaldo Cruz / As Leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitidas pela picada dos flebotomíneos. A doença apresenta diferentes manifestações clínicas, como a leishmaniose visceral (LV). No Brasil a LV é causada pela subespécie Leishmania (L.) infantum chagasi e transmitida principalmente pelo vetor Lutzomyia longipalpis e nos últimos dez anos, a média anual de novos casos foi de 3.379. O flebotomíneo, durante o repasto sanguíneo, pode ingerir o parasito que é direcionado ao intestino médio do inseto, onde entra em contato com a microbiota. In vitro a ação dessa microbiota sobre o parasito foi avaliada demonstrando a lise na parede celular de Leishmania (L.)infantum chagasi e Leishmania (V.) braziliensis causada por Serratia marcescens, porém ainda não esta claro o seu papel no vetor. Neste trabalho foi feita a identificação por sequenciamento de DNA de isolados bacterianos do intestino médio de L. longipalpis de duas localidades brasileiras. Nas fêmeas de flebotomíeneos da Gruta da Lapinha foi encontrada pela primeira vez a bactéria da família Enterobactereaceae, Providencia sp. Nas fêmeas de Jacobina a bactéria encontrada foi a espécie Acinetobacter soli. As duas localidades apresentaram maior número de bactérias do tipo bacilos Gram negativos. Os machos de Jacobina não apresentaram crescimento bacteriano, diferentemente dos machos da Gruta da Lapinha. Para análise da influência das bactérias no desenvolvimento do parasito, Fêmeas de L. longipalpis foram infectadas com Leishmania (L.) infantum chagasi e tratadas com dois antibióticos de ação principal sobre bactérias Gram negativas, carbenicilina e gentamicina. Os parasitos do grupo tratado com carbenicilina, além de serem capazes de se estabelecer no flebotomíneos após a digestão, tiveram um aumento no seu número. O grupo tratado com gentamicina apresentou uma queda já no segundo dia pós-infecção, tendo um aumento no quinto dia. Ao incubar as bactérias identificadas no intestino médio com L. (L.) infantum chagasi in vitro, foi possível ver que as bactérias interferem no crescimento do parasito. Analisamos também a expressão de peptídeos antimicrobianos. Gambicina e defensina apresentaram diferença de expressão entre os grupos Não alimentados e Pós Digestão, sendo que a expressão foi maior em Não alimentados. No processo de interação, estabelecemos no laboratório a transmissão de L.(L.) infantum chagasi diretamente via picada do flebotomíneo a hamsters e camundongos. Os dois modelos apresentaram uma variação de 4 a 15 mil parasitos inoculados na orelha dos vertebrados. / Leishmaniasis are diseases caused by protozoa of the genus Leishmania and they are transmitted by the bite of sandflies. The disease presents different clinical manifestations, such as visceral leishmaniasis (VL). In Brazil, VL is caused by Leishmania (L.) infantum chagasi and it is transmitted by the vector bite Lutzomyia longipalpis and during the last ten years the annual new cases average of VL was 3.379. The sandfly is able to ingest the parasite during the blood meal which is directed to the insect midgut where it gets in contacts with the microbiota. The microbiota activity over the parasite was evaluated in vitro demonstrating cell walls lysis of Leishmania (L.) infantum chagasi and L. braziliensis caused by Serratia marcescens but their role in the vector is not clear yet. This work identified bacterial isolates from the L. longipalpis midgut from two deferent places in Brazil by sequencing DNA. Lapinha Cave females showed for the first time in sandflies a bacteria from the Enterobactereaceae family, Providence sp. Jacobina females’ insects presented Acinetobacter soli as a midgut bacteria. The insects from both sites showed a majority of Gram negative rods. Males from Jacobina showed no bacterial growth, unlike the Lapinha Cave ones. In order to analyze the influence of bacteria on the development of the parasite, L. longipalpis females were infected with L. (L.) infantum chagasi and treated with two difenrets antibiotics for Gram negative bacterias, carbenicillin and gentamicin. Carbenicillin treated group parasites were able to establish infection in sand flies after digestion increasing the number of parasites. The gentamicin treated group featured a parasite drop since the second day postinfection, having an increasing on the fifth day. Incubating in vitro those bacterias identified in the midgut with L. (L.) infantum chagasi, could be seen that bacteria interfere on parasite growth. We also analyzed the antimicrobial peptides expression in the insects. Gambicina and defensin expression differ between groups; Not Fed and Post Digestion. The expression was higher in Not Fed one. In the interaction process, we established the laboratory transmission of L. (L.) infantum chagasi directly by the sandfly bite on hamsters and mice. Both models showed a range 4 to 15 million parasites inoculated into the vertebrates’ ear.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-15T17:01:51Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Izabela Coimbra Ibraim.pdf: 3600819 bytes, checksum: 7dc73c7a016be4f2bdca2b741e85a75e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-15T17:01:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Izabela Coimbra Ibraim.pdf: 3600819 bytes, checksum: 7dc73c7a016be4f2bdca2b741e85a75e (MD5) Previous issue date: 2012 / O LPG apresenta variações estruturais que são importantes para os diferentes estágios de desenvolvimento do parasito. Nas formas procíclicas, o LPG de L. braziliensis (cepa M2903), não apresenta cadeias laterais enquanto um a dois resíduos de β-glicose podem aparecer nas unidades repetitivas da forma metacíclica. O LPG de L. infantum (cepa BH46), apresenta até três cadeias laterais de glicoses nas unidades repetitivas da forma procíclica e ainda não foi caracterizado nas formas metacíclicas. Esses polimorfismos nas unidades repetitivas do LPG e seu papel na interação com o hospedeiro vertebrado e invertebrado já foram amplamente estudados, sobretudo, para as espécies do Velho Mundo. Entretanto, para a maioria das espécies do Novo Mundo, o papel desses polimorfismos no perfil imunopatológico da doença é ainda desconhecido. Este projeto teve como objetivo avaliar o estudo da interação entre os LPGs de duas espécies epidemiologicamente importantes no Brasil e macrófagos murinos. Estas incluem L. braziliensis e L. infantum, responsáveis pela forma cutânea e visceral, respectivamente. Neste estudo, os macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, C57BL/6 e C57BL/6 knock-out (TLR2 -/- e TLR4 -/-), foram primados com IFN- e estimulados com LPG de ambas as espécies. A produção de citocinas (IL-1β, IL-2; IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN- e TNF-α) foi determinada por citometria de fluxo e a concentração de nitrito pelo método de Griess. A ativação de ERK e p38 foi avaliada por Western blot. Os macrófagos estimulados com LPG de L. braziliensis, apresentaram uma maior produção de TNF-α, IL-1β, IL-6 e NO em comparação aos estimulados com LPG de L. infantum. Também foi observada uma cinética de ativação diferencial das MAPK entre os LPGs. Leishmania infantum apresentou uma ativação constante até 45 minutos após estimulação, enquanto L. braziliensis apresentou um único pico de ativação após 15 minutos. Estes dados sugerem que variações interespecíficas no LPG de Leishmania podem ter um papel importante nos eventos iniciais do compartimento imune inato do hospedeiro. / The structural variations observed on LPG are important for the different parasite developmental stages. The procyclic form of L. braziliensis LPG (strain M2903), is devoid of side chains, while one to two β-glucose side chains are added in the repeat units of the metacyclic LPG. The L. infantum LPG has with up to 3 glucoses residues in the repeat units in the procyclic parasites, while those structures are not known in the metacyclic stage. Those polymorphisms in the composition and sequence of the sugars branching off the repeat units of the LPG have been assessed in the interaction with vertebrate and invertebrate hosts, especially for the Old World Leishmania species. However, for most of New World species of Leishmania, the role of those polymorphisms in the mmunopathology of the disease is still unknown. This study aimed to evaluate the interaction between the LPGs of two epidemiologically important Brazilian species and murine macrophages. Those include L. braziliensis and L. infantum, causative agents of cutaneous and visceral leishmaniasis, respectivelly. Mice peritoneal macrophages from BALB/c, C57BL/6, and C57BL/6 knock-out (TLR2 -/- e TLR4 -/-) lineages were primed with IFN- and stimulated with LPG from both species. Cytokine production (IL-1β, IL-2; IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IFN- and TNF-α) and nitrite concentration were determined by flow cytometry and Griess reaction, respectivelly. Western blot was performed to evaluate the activation of the MAPKs ERK and p38. Macrophages stimulated with L. braziliensis LPG, had a higher TNF-α, IL-1β, IL-6 e NO production than those stimulated with L. infantum’s. A different MAPK activation kinetics between the two species was detected. Leishmania infantum LPG exhibited a gradual activation profile until 45 min after stimulation, whereas L. braziliensis LPG showed an activation peak at 15 min. These data suggest that interpecies variations in Leishmania LPG may have an important role during initial steps of infection in the host’s innate imune system.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-05-24T13:07:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Nascimento.pdf: 2690979 bytes, checksum: 8895b1e7cb440d8618cfcad07cc3cb46 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-24T13:07:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Nascimento.pdf: 2690979 bytes, checksum: 8895b1e7cb440d8618cfcad07cc3cb46 (MD5) Previous issue date: 2013 / A transmissão das espécies de Leishmania aos hospedeiros vertebrados envolve várias espécies de flebotomíneos no Brasil. Um estudo sobre a composição da fauna de flebotomíneos foi realizado no município de Divinópolis, Minas Gerais, Brasil, área endêmica para leishmaniose tegumentar (LT), e de transmissão moderada para leishmaniose visceral (LV). Foram realizadas coletas sistematizadas mensais para captura de flebotomíneos durante um ano, de setembro de 2010 a agosto de 2011, com armadilhas luminosas HP instaladas em área urbana, em 15 peridomicílios de casas onde se registrou pelo menos um caso de LT ou LV, e em 5 fragmentos de mata. Também foram realizadas coletas não sistematizadas utilizando armadilhas de Shannon nos fragmentos de mata. A detecção de DNA de Leishmania sp. nos espécimes de flebotomíneos foi realizada por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e para a identificação da amostra positiva foi utilizada a técnica de sequenciamento genético de fragmentos de DNA. Um total de 1.088 espécimes de flebotomíneos foram coletados pertencentes ao gênero Brumptomyia e Lutzomyia, e 18 espécies. Lutzomyia longipalpis, o principal vetor da Leishmania infatum no Brasil, foi a espécie mais freqüente, sendo encontrada em 14 das 20 localidades. As espécies Lu. longipalpis e Lu. whitmani foram as únicas coletadas em todos os meses de estudo. Nenhuma das espécies foi encontrada em todas as localidades de estudo. As cinco espécies mais frequentes foram: Lu. longipalpis (76,9%), Lu. lenti (8,3%), Lu. whitmani (5,0%), Lu. sallesi (2,8%) e Lu. aragaoi (2,2%). Não foi observada correlação estatisticamente significativa entre densidade total de flebotomíneos e variáveis climáticas durante o período de estudo. As análises moleculares detectaram DNA de Leishmania infantum em um exemplar de Lu. longipalpis. Os dados apontam para a necessidade de medidas de controle da população de flebotomíneos no município de Divinópolis e adoção de estratégias de vigilância entomológica. / The transmission of Leishmania species to vertebrate hosts involves several species of sand flies in Brazil. A study of the sand flies fauna composition was carried out in the city of Divinópolis, Minas Gerais state, Brazil, an endemic area for cutaneous leishmaniasis (CL), and of moderated transmission of visceral leishmaniasis (VL). Monthly systematic collections were made during one year, from September 2010 to August 2011. The HP light traps were installed inperidomicile of 15 houses where at least one case of CL or VL has been recorded and in five forested areas. Systematized collections were carried out using Shannon traps. The detection of DNA of Leishmania sp. in the sand fly specimens was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) and the technique for identification of positive samples genetic sequencing of DNA fragments technique. A total of 1,088 specimens of sand flies were collected, belonging to the genera Brumptomyia e Lutzomyia and 18 species. Lutzomyia longipalpis, the main vector of Leishmania infatum in Brazil, was the most frequent species, being collected in 14 of the 20 locations. The species Lu. longipalpis and Lu. whitmani were the only ones collected in every month studied. None of the collected species were found in all localities sampled. The five most abundant species were: Lu. longipalpis (76.9%), Lu. lenti (8.3%), Lu. whitmani (5.0%), Lu. sallesi (2.8%) and Lu. aragaoi (2.2%). No significant statistical correlation between the total sand fly density and the climatic variables was found. Molecular analysis identified natural infection by Leishmania infantum in one specimen of Lu. longipalpis. The data points to for measures to control the sand fly populations and adoption of strategies for entomological surveillance in Divinópolis municipality.

Made available in DSpace on 2014-07-22T17:02:52Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 68700.pdf: 2578722 bytes, checksum: 8c5310d6fb306ce43d34892517750ffc (MD5) 68700.pdf.txt: 211841 bytes, checksum: cb3a25da2d45d4cf6b421b83c876f820 (MD5) 68700.pdf.jpg: 1263 bytes, checksum: 09883dde54f8c4065ee9c8c3e8f0cb35 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é causada no Brasil pela Leishmania (Leishmania) infantum. A fase ativa da LV é caracterizada por uma imunossupressão parasito-específica acompanhada de baixos níveis de células T CD4+. Apesar disso, uma intensa ativação celular e resposta pró-inflamatória são observadas. Em outras doenças deficientes de célula T, tais como o HIV-1/AIDS, o lipopolissacarídeo (LPS), provavelmente oriundos da translocação microbiana são um componente crucial na ativação imune. Resultados recentes do nosso grupo mostraram que o LPS, juntamente com os antígenos parasitários, estão envolvidos na ativação das células T e na produção de citocinas pró-inflamatórias nos pacientes com LV. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar os níveis plasmáticos de LPS na LV experimental, assim como a influência do tratamento específico anti-Leishmania e/ou o tratamento com antibiótico para bactérias Gram-negativas na evolução clínica desses animais e nos níveis do LPS plasmático. Além disso, avaliou-se a ocorrência da ativação celular e o desenvolvimento da resposta humoral ao longo do acompanhamento e dos diferentes tratamentos. Para isso, foram utilizados 117 golden hamsters (Mesocricetus auratus), que foram divididos em oito grupos: sem infecção (G1), infectado com L. infantum (G2), infectado e tratado com o antimonial pentavalente e/ou com o antibiótico amicacina (G3, G4 e G5, respectivamente). Três grupos sem infecção tratados com os fármacos propostos também foram incluídos (G6, G7 e G8) Na avaliação clínica realizou-se a pesagem dos animais, bem como do fígado e do baço. Os aspectos físicos dos animais infectados e as alterações macroscópicas do intestino delgado também foram avaliados. A carga parasitária esplênica também foi quantificada pelo imprint. Os níveis plasmáticos do LPS foram avaliados através de um kit comercial. As dosagens do anticorpo IgG total anti- Leishmania foram realizada no soro dos animais pela técnica de ELISA. A avaliação do grau de comprometimento do sistema imune dos hamsters foi feita através da quantificação do percentual de células T CD4+ e o grau de ativação celular pela molécula CD25, através da citometria de fluxo. Os hamsters com LV apresentaram parâmetros laboratoriais e imunológicos similares aos da LV humana, exceto pela ausência de sinais clínicos visíveis característicos dessa infecção. Os animais apresentaram um aumento de peso progressivo ao longo dos 101 dias pós-infecção (dpi), mas este foi condizente com seu crescimento e idade. Os tratamentos propostos não influenciaram no peso dos animais avaliados. O fígado e o baço dos hamsters apresentaram também um aumento de peso condizente com seu crescimento, entretanto foram observadas alterações macroscópicas em momentos tardios da infecção pelo parasito, que coincidiram com o aumento da carga parasitária esplênica desses animais. O intestino delgado dos animais infectados mostraram-se mais friáveis à manipulação e observou-se uma diminuição significativa do número de placas de Peyer em toda sua superfície quando comparados ao grupo não-infectado Elevados níveis de LPS plasmático foram observados nos animais infectados a partir de 15 dpi, como já foi descrito na LV humana. Uma intensa ativação celular foi observada nos animais infectados, tanto através da molécula CD25 nos linfócitos T CD4+ quanto pelos níveis de anticorpos IgG total anti-Leishmania, ambos aumentaram com o tempo de infecção. Os níveis de LPS se correlacionaram positivamente com a ativação das células T quando todos os animais infectados tratados ou não foram avaliados, sugerindo que o LPS pode contribuir para a ativação já descrita na LV humana. De modo geral, verificou-se nesse trabalho que o tratamento concomitante com o antimonial pentavalente e o antibiótico amicacina foram benéficos em diversos aspectos, como na recuperação do aspecto acroscópico dos órgãos, na diminuição da carga parasitária esplênica e imunológica (redução dos níveis de ativação) nos hamsters com LV, inferindo um possível sinergismo terapêutico entre esses fármacos. Esses resultados permitem sugerir a elegibilidade dessa estratégia terapêutica para o tratamento da LV humana / Visceral leishmaniasis (VL) is caused in Brazil by Leishmania (Leishmania) infantum. The active phase of VL is characterized by parasite-specific immunosuppression along with low levels of CD4+T cells. Despite this, an intense cellular activation and pro-inflammatory cytokine response is observed. In other T-cell deficient diseases such as HIV-1/AIDS, the lipopolisaccharide (LPS) probably from gut microbial translocation has a crucial role on immune activation. Our recent results showed that LPS along with parasite antigens are implicated in T-cell activation and pro-inflammatory cytokines in VL patients. In this context, our aim was to evaluate whether plasma LPS levels were increased in experimental VL and the influence of the specific treatment anti-Leishmania and/or the treatment with gram-negative antimicrobial in the clinical evolution of this animals and in the LPS levels. Also, we investigated the occurrence of the cellular activation and the development the humoral response during the follow up and under the different treatments. For this, 117 golden hamsters (Mesocricetus auratus) were divided into eight groups: without infection (G1), infected with L. infantum (G2), infected and treated with anti-leishmanial therapy (antimonial) and/or with antibiotic amikacin (G3, G4 and G5, respectively). Three groups without infection treated with the different drugs were also included (G6, G7 and G8). The clinical evaluation included animal weighting as well as spleen and the liver weight. The physical aspects of infected animals and the macroscopic alterations of the small intestine were also evaluated. Parasite load was quantified by the number of stained amastigotes in the spleen imprint. Plasma LPS levels were measured using a commercial kit. The quantification of serum anti-Leishmania IgG levels was performed by ELISA. The assessment of immune system impairment was done by quantifying the percentage of CD4 + T cells and the degree of cell activation by the CD25 molecule by flow cytometry. The infected hamsters presented laboratory and immunological parameters similar to those of a human VL, except for the absence of visible clinical signs characteristic of this infection. The animals also showed a progressive weight gain over the 101 days post-infection (dpi), but this was consistent with their growth and age. The proposed treatments did not affect the weight of the animals evaluated. The liver and spleen of hamsters also showed an increase in weight consistent with its growth, however anatomical changes were observed at late times of parasite infection, which coincided with the increased splenic parasite load in these animals. In addition, the small intestine of infected animals was more friable to handle and showed a significant decrease in the number of Peyer's patches across its surface compared to uninfected group. Elevated plasma levels of LPS were observed in infected animals from 15 dpi, as previously described in human VL. An intense cellular activation was observed in the infected hamsters using the CD25 molecule on CD4+ T lymphocytes and the total IgG anti-Leishmania levels, both of which increased with time of infection. LPS levels were positively correlated with the activation of T cells when all infected animals treated or not were evaluated, suggesting that LPS may contribute to the activation already described in VL patients. In general, this study showed that concomitant treatment with pentavalent antimony and the antibiotic amikacin were beneficial in many aspects, such as the recovery of macroscopic aspects of the organs, the decrease of splenic parasite load and reduced levels of immune activation in hamsters with VL, suggesting a possible therapeutic synergism between these drugs. These results suggest the eligibility of this therapeutic strategy for the treatment of human VL.

Made available in DSpace on 2014-09-05T18:31:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69296.pdf: 2396150 bytes, checksum: 6453587a423516cefeb368c7db601724 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-05T15:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 isabele_santos_ipec_dout_2011.pdf: 2396150 bytes, checksum: 6453587a423516cefeb368c7db601724 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-09-05 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose é uma doença infecto-parasitária que acomete seres humanos e animais, causada por protozoários do gênero Leishmania. As leishmanioses são importante problema de saúde pública em vários países e estão incluídas entre as seis endemias de maior relevância mundial. Classicamente a leishmaniose visceral canina (LVC) se caracteriza por caquexia progressiva, anemia, febre intermitente, linfadenomegalia generalizada, sinais oculares (conjuntivite, ceratoconjuntivite, uveite) e lesões cutâneas (dermatite exfoliativa, úlceras e alopecia). Para a confirmação do diagnóstico da LVC, é necessária a demonstração do agente etiológico nas amostras biológicas obtidas de lesões, aspirados de fígado, baço, medula óssea, pele íntegra ou de gânglios linfáticos. O presente estudo avaliou os exames citopatológico, histopatológico, imunohistoquímico e imunocitoquímico no diagnóstico da LVC, utilizando como padrão de referência a cultura parasitológica. Oitenta e um cães foram avaliados, foram incluídos no estudo 44 cães com isolamento em cultura parasitológica e caracterização de Leishmania (Leishmania) chagasi, isolada a partir de amostras de pele íntegra da orelha e/ou baço e/ ou lesão cutânea. Os cães foram submetidos à eutanásia e posteriormente a coleta de amostras biológicas para a realização do exame citopatológico (CP), exame histopatológico (HP), reação de imunocitoquímica (ICQ) e reação de imuno-histoquímica (IHQ). A maioria dos cães era do sexo masculino (61,3%; n=27) Treze cães (29,5%) foram provenientes do município do Rio de Janeiro e 70,5% (n=31) do município de Bauru-SP. A maioria dos cães apresentava bom estado geral (47,7%; n=21); 38,6% (n=17) estado geral ruim; 11,3% (n=5) estado geral regular. A presença de lesão cutânea foi observada em 11 (25%) animais. No CP foi possível à visualização de formas amastigotas em 29,5% (n=13) de raspados da escápula, 29,5% (n=13) de raspados da orelha; em 29.5% (n=13) de raspados do focinho; 45,5% (n=20) nos aspirados de medula óssea, 25% (n=11) nos aspirados de linfonodo cervical e 52,7% (n=23) nos aspirados do linfonodo poplíteo. No HP formas amastigotas foram observadas em 45,5% (n=20) de amostras de pele íntegra da escápula, 65,9% (n=29) do focinho e 52,3% (n=23) da orelha. Na ICQ formas amastigotas foram observadas em 47,8% (n=21) das amostras provenientes de pele íntegra da escápula, 68,2% (n=30) pele íntegra do focinho; 56,8% (n=25) pele íntegra da orelha; 63,6% (n=28) nos aspirados de medula óssea, 36,7% (n=16) nos aspirados de linfonodo cervical e 68,2% (n=30) nos aspirados do linfonodo poplíteo. Na IHQ formas amastigotas foram observadas em 52,3% (n=23) das amostras provenientes de pele íntegra da escápula, 88,6% (n=39) do focinho e 72,7% (n=31) da orelha. A IHQ dos fragmentos de pele íntegra do focinho apresentou maior sensibilidade quando comparado com CP e de raspados de pele íntegra da orelha, focinho, escápula e de lesões cutâneas e de aspirados de linfonodos e medula óssea e ao HP dos fragmentos de pele íntegra da escápula, do focinho e da orelha. A boa sensibilidade da IHQ em amostras biológicas obtidas de fragmentos de pele íntegra do focinho sugere a utilização desta técnica no diagnóstico parasitológico da leishmaniose canina, apesar do custo mais elevado, quando comparada ao CP e ao HP / Leishmaniasis is a parasitic infectious disease caused by pr otozoa of the genus Leishmania, that affects humans and animals. In many countries Leishmaniasis are important public health problem and are included among the six world's most significant endemic diseases. According to literature canine visceral leishmaniasis (CVL) is usuall y characterized by progressive emaciation, anemia, intermittent fever, generalized lymphadenopathy, eye signs (conjunctivitis, keratitis, uveitis) and skin lesions (exfoliative dermatitis, alopecia and ulcers). To grant CVL diagnosis, the identification o f the etiologic agent in biological samples obtained from lesions is primal. S ampling can be obtained from aspirates of liver, spleen, bone marrow, intact skin or lymph nodes. The aim of this study was to compare the cytopathological, histopathological, im munohistochemical and immunocytochemical diagnosis of leishmaniasis in dogs, using as reference the standard parasitological culture. Forty - four dogs with parasitological culture isolation and characterization of Leishmania (Leishmania) chagasi isolated an d from samples of intact skin of the ear and / or spleen and / or skin lesion, were included in the study. Subsequently the animals were euthanized and collection of biological samples for citopahatol ogy test (CP), histopathology ( H P ), immunocytochemistry (ICC) and immunohistochemistry (IHC). Most dogs were male (61.3%, n = 27). Thirteen dogs (29.5%) were from Rio de Janeiro and 70.5% (n = 31) from Bauru, Brazil. There were 47.7%, ( n = 21) intact dogs, 38.6% (n = 17) dogs in poor general health condition and 11.3% (n = 5) in regular general health state. S kin lesions were observed in 11 (25%) animals. In the C P was possible to identify the amastigotes in 29.5% (n = 13) from scapula scrapings, 29.5% (n = 13) of ear scrapings, 29.5% (n = 13) from snouts scra pings, 45.5% (n = 20) in bone marrow aspirates, 25% (n = 11) in cervical lymph node aspirates and 52.7% (n = 23) in the popliteal lymph node aspirates. In H P amastigotes were detected in 45.5% (n = 20) samples of shoulders , 65.9% (n = 29) snout and 52.3% ( n = 23) the ear healthy skin. In ICQ amastigotes were observed in 47.8% (n = 21) samples from shoulder intact skin, 68.2% (n = 30) intact snout skin, 56.8% (n = 25) intact ear skin , 63.6% (n = 28) in bone marrow aspirates, 36.7% (n = 16) in cervical lymph node aspirates and 68.2% (n = 30) in the popliteal lymph node aspirates. In IHC amastigotes were placed in 52.3% (n = 23) samples from shoulder healthy skin, 88.6% (n = 39) of snout and 72.7% (n = 31) of the ear. IHC from fragments of intact snout skin sho wed higher sensitivity when compared with CP and shaved intact skin of the ear, nose, scapula and skin lesions and lymph node aspirates and bone mar row and also compared with the H P fragments of intact shoulder skin, muzzle and ear . The good sensitivity o f IHC in biological samples obtained from fragments of intact snout skin suggests the use of this technique in parasitological diagnosis for canine leishmaniasis, despite th e higher cost compared to the CP and HP