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Herstellung porenüberspannender Lipidmembranen auf Basis poröser Aluminate und deren Charakterisierung mittels elektrischer ImpedanzspektroskopieDrexler, Janine. Unknown Date (has links) (PDF)
Universiẗat, Diss., 2003--Regensburg.
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Bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide zur Evaluierung von Lipiddynamiken \(in\) \(vivo\) / Bioorthogonal functionalized sphingolipids for evaluation of lipid dynamics \(in\) \(vivo\)Walter, Tim January 2018 (has links) (PDF)
In der Kontrolle von viralen oder bakteriellen Infektionen spielen Sphingolipide eine essentielle Rolle[335-336], weshalb sich inzwischen die Forschung vermehrt an Sphingolipiden und -analoga als Wirkstoffen gegen die verschiedensten Erreger beschäftigt.[9] Dabei finden in der Synthese und Identifikation potentieller Wirkstoffe auch clickchemiebasierte Ansätze Anwendung.[224] Allerdings ist die Wirkweise von sphingolipidbasierten Pharmaka auch in viraler und mikrobieller Pathogenese bisher ungeklärt.
Mit der Entdeckung der CuAAC[112-113] sowie deren modernen Varianten und Alternativen, die gemeinsam unter dem Begriff Clickchemie zusammengefasst werden, ist es möglich, die strukturellen Änderungen von Biomolekülen klein zu halten und durch spätere Konjugation mit Farbstoffen Fluoreszenspektroskopie zu ermöglichen.[339-340] Während in den letzten Jahren die Clickchemie breite Anwendung zur Modifikation von Proteinen[130], Kohlenhydraten[341] und DNA[340] gefunden hat blieben Lipide lange unbeachtet[342], was vor allem auch für Sphingolipide gilt.
In dieser Arbeit werden bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide und -analoga vorgestellt, um die Vielseitigkeit der Clickchemie auf das Feld der Sphingolipide zu übertragen. Die clickfähigen Lipidanaloga ermöglichen detaillierte Einblicke in die dynamische Organisation von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und ihr Einsatz als therapeutische Wirkstoffe oder zur Generierung von antibakteriellen Oberflächenbeschichtungen wurden untersucht.
Die dargestellten azidmodifizierten Sphingolipide und –analoga konnten in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern, bezüglich ihrer Verwendung in Visualisierungsexperimenten und antibakteriellen Eigenschaften untersucht werden.
Die Ceramidderivate konnten genutzt werden, um den Einfluss von Kettenlänge und Position des Azides der acylierten Säure auf die in vivo-Konjugation mit dem Fluoreszenzfarbstoff DBCO-Sulfo-Cy5 in Jurkatzellen genauer zu untersuchen.[211]
Auch konnten azidfunktionalisierte Ceramide auf ihre Eignung zur Visualisierung von Ceramiddynamiken während T-Stimulation untersucht werden.[205] In diesem Zusammenhang sind visualisierbare Ceramide von besonderer Bedeutung, da die T-Zellstimulation die ASM-Aktivierung zur Folge hat, die wiederum Ceramide freisetzt.
Mit dem azidmodifizierten Phytosphingosinderivat gelang es erstmals ein azidmodifiziertes Sphingolipid nach Inkubation von Arabidopsis thaliana Setzlingen mittels CuAAC mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu konjugieren.[258]
Des Weiteren konnten die azidfunktionalisierten N-Oleoylserinole in verschiedenen Zelltypten erfolgreich eingebaut und selektiv mit Fluoreszenzfarbstoff visualisiert werden. Kofärbungen mit GFP-PKCζ und Antikörpermarkierungen von Ceramid sowie PKCζ zeigten, dass es sich bei den Enantiomeren um ceramidimitierende Lipidanaloga handelt. Somit eignen sich diese N-Oleoylserinolanaloga, um die Interaktion von Ceramiden mit der Proteinkinase Cζ zu untersuchen.
Da viele natürliche Sphingolipide antibakterielle Eigenschaften aufweisen, konnte in Kooperation mit Jérôme Becam der Einsatz azidmodifizierter Ceramide als Wirkstoff gegen Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus untersucht werden. ωN3-C6-Cer zeigt gute bakterizide Eigenschaften gegen Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, ohne dabei toxisch gegenüber den Wirtszellen zu sein. Die Ceramidanaloga αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer und ωN3-C16-Cer weisen keine antibakteriellen Eigenschaften auf, aber sie wurden effizient in die Membran der Neisseriae eingebaut und konnten ebenfalls erfolgreich bioorthogonal markiert werden. Des Weiteren zeigten hochauflösende dSTORM-Aufnahmen der Bakterien, im Gegensatz zu Humanzellen, eine homologe Verteilung der konjugierten Ceramide. Da Ceramide eine wichtige Rolle in der Infektionsbekämpfung spielen, sind die in dieser Arbeit synthetisierten azidmodifizierten Ceramide wertvolle Werkzeuge, um die Interaktion von Bakterien mit Humanzellen zu untersuchen.
Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich eine innovative Methode entwickelt werden, um alkinpräsentierende Linker auf die Oberfläche von Nunc Covalink 96 Microtiterplatten kovalent zu binden und die Alkine konnten anschließend mittels CuAAC mit den in dieser Arbeit synthetisierten azidfunktionalisierten Lipiden zu konjugiert werden. Ziel der Methode war es potentielle Moleküle für bakterizide Oberflächenmodifikationen zu identifizieren. Mittels solcher Oberflächenmodifikationen soll die Biofilmbildung in Endotrachealtuben verhindert, und damit die Entstehung von beatmungsassozierten Pneumonien unterbunden werden. Die lipidmodifizierten Microtiterplatten sollen zukünftig auch genutzt werden, um sphingolpidaffine Proteine aus Zelllysaten zu identifizieren. / Sphingolipids play an essential role in the control of viral and bacterial infections[335-336], therefore sphingolipids and analogues shift into the focus of pharmaceutical research as active ingredients against various pathogens.[9] Also click chemistry is used for synthesis and screening of potential drugs.[224] The mode of action of sphingolipid based pharmaceuticals in viral and microbial pathogenesis is not yet fully understood.
By using CuAAC[112-113] and their modern variants and alternatives – summarized in the term click chemistry – it is possible to minimise the structural alterations of biomolecules and still use them in fluorescence spectroscopy after labeling. [339-340] While modification of proteins[130], carbohydrates[341] and DNA[340] via click chemistry has been widely used in recent years, lipids have remained unaffected for a long time, especially sphingolipids.[342]
In this Work biorthogonal functionalised sphingolipids and analogues are presented, that transfer the versatility of the click chemistry to the field of sphingolipids. Furthermore, the clickable lipid analogues allow a detailed view into the dynamic organisation of sphingolipids in infection processes and in addition their use as therapeutic agents or for the generation of antibacterial surface coatings were investigated.
The synthesized azide modified sphingolipids and analogues were evaluated for the use in visualisation experiments and their antibacterial properties were evaluated within several cooperation projects.
The ceramide derivatives were used to evaluate the influence of acylated chain length and azide position in regard to in vivo labeling with the fluorescence dye DBCO-Sulfo-Cy5 in jurkat cells.[211]
Furthermore, ceramide dynamics during T-cell stimulation were investigated by labeling azide functionalised ceramides.[205] In this context visualisable ceramides are of particular interest due T-cell stimulation results in ASM-activation, which again releases ceramides.
With the azide modified phytosphingosine derivative, an azide modified sphingolipid was labelled via CuAAC after incubation of arabidoopsis thailana seedlings for the first time[258]
Furthermore, azide functionalised N-Oleoyl serinols were successfully incorporated within different cell types and selectively visualised by labelling. Colocalization studies with GFP-PKCζ and anti body labeling of ceramide as well as PKCζ proved to be ceramide mimicking lipid analogues
Many natural sphingolipids show antibacterial behaviour, therefore the use of azide modified ceramides as active ingredients against Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus were investigated in cooperation with Jérôme Becam ωN3-C6-Cer shows good bactericidal properties against Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae without being toxic against host cells. The ceramide analogues αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer and ωN3-C16-Cer show no antibacterial properties, but they were also efficiently incorporated into the membrane of Neisseriae and can be used biorthogonal labelling. Furthermore, in contrast to human cells high resolution dSTORM-images show an evenly distribution of labelled ceramides in bacteria cells. Since ceramides play an important role in the fight against infections the ceramides synthesised in this work are valuable tools to investigate the interaction of bacteria with human cells.
Also an innovative method was established within this thesis to modify the surface of Nunc Covalink 96 Wellplates with alkyne presenting linkers followed by the conjugation of the azide modified lipids presented in this work via CuAAC. This method is intended to be used for screening of potential molecules for antibacterial surface modifications. In the future this kind of surface modifications are expected to prevent the biofilm formation in endotracheal tubes and prohibit the formation of ventilator-associated pneumonia. In Addition the lipid modified microtiter plates are also intended to be used to identify sphingolipid affine proteins from cell lysate.
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Channel Formation, Binding and Translocation Properties of Anthrax, CDT and Related Toxins of the AB7 type / Kanalbilidung, Bindungs- und Translokationseigenschaften des Anthrax, CDT und verwandten Toxinen des AB7-ToxintypsKronhardt, Angelika January 2012 (has links) (PDF)
The ability to produce toxins is spread among a huge variety of bacterial strains. A very prominent class of bacterial protein toxins is the family of binary AB toxins sharing a common mode of intoxication. A pore forming component B binds and translocates an enzymatic component A into the cytosol of target cells exhibiting a fatal mode of action. These components are supposed to be not toxic themselves but both required for cell toxicity. Anthrax toxin produced by the Gram-positive bacteria Bacillus anthracis is the best studied binary toxin especially since its use as a biological weapon in the context of the attacks of 9/11 in 2001. In contrast to other binary toxins, Anthrax toxin possesses two different enzymatic components, edema factor (EF), a calcium- and calmodulin-dependent adenylat-cyclase and lethal factor (LF), a zinc-dependent metalloprotease. Protective antigen (PA) is the pore-forming component responsible for binding and translocation. Clostridium botulinum possesses in addition to the well known botulinum toxin (Botox) a variety of other toxins, such as the binary C2 toxin. C2 toxin is composed of the binding and translocation moiety C2II and the enzymatic moiety C2I acting as an actin-ADP-ribosyltransferase. In this study, the mode of translocation and the binding kinetics to the enzymatic component were studied in a biophysical experimental setup. In chapter 2, the binding of the N-terminal fractions EFN and LFN to the PA channel are analyzed in artificial bilayer membranes revealing lower binding affinity compared to full-length EF and LF. Other biophysical properties like voltage-dependency and ionic-strength dependency are not influenced. The results suggest that additional forces are involved in the binding process, than those concerning the N-terminus exclusively, as it was supposed previously. As the treatment of an Anthrax infection with antibiotics is often medicated very late due to the lack of early symptoms, tools to prevent intoxication are required. 4-aminoquinolones like chloroquine are known to block the PA channel, thereby inhibiting intoxication but they also lead to severe side-effects. In chapter 3 new promising agents are described that bind to PA in artificial bilayer systems, elucidating common motives and features which are necessary for binding to PA in general. The possible interaction of Anthrax and C2 toxin is investigated by measuring the binding of one enzymatic component to the respective other toxin’s pore (chapter 4). Interestingly, in vitro experiments using the black lipid bilayer assay show that PA is able to bind to C2I resulting in half saturation constants in the nanomolar range. Furthermore, in vivo this combination of toxin components exhibits cell toxicity in human cell lines. This is first-time evidence that a heterologous toxin combination is functional in in vitro and in vivo systems. In contrast, C2II is able to bind to EF as well as to LF in vitro, whereas in in vivo studies almost no toxic effect is detected. In the case of PA, an N-terminal His6-tag attached to the enzymatic subunit increased the binding affinity (chapter 5). A His6-tag attached to not related proteins also led to high binding affinities, providing the possibility to establish PA as a general cargo protein. In chapter 6 a set of different molecules and proteins is summarized, which are either related or not related to binary toxins, PA is able to bind. In first line, the presence of positive charges is found to be responsible for binding to PA which is in accordance to the fact that PA is highly cation selective. Furthermore, we present evidence that different cationic electrolytes serve as a binding partner to the PA channel. In the last decade another toxin has aroused public attention as it was found to be responsible for a rising number of nosocomial infections: Clostridium difficile CDT toxin. The mode of action of the enzymatic subunit CDTa is similar to C2I of C2 toxin, acting as an ADP-ribosylating toxin. The channel forming and binding properties of CDT toxin are studied in artificial bilayer membranes (chapter 7). We found that two different types of channels are formed by the B component CDTb. The first channel is similar to that of iota toxin’s Ib of Clostridium perfringens with comparable single channel conductance, selectivity and binding properties to the enzymatic subunit CDTa. The formation of this type of channel is cholesterol-dependent, whereas in the absence of cholesterol another kind of channel is observed. This channel has a single channel conductance which is rather high compared to all other binary toxin channels known so far, it is anion selective and does not show any binding affinity to the enzymatic component CDTa. The results reveal completely new insights in channel formation properties and the flexibility of a pore-forming component. Additionally, these findings suggest further possibilities of toxicity of the pore forming component itself which is not known for any other binary toxin yet. Therefore, the pathogenic role of this feature has to be studied in detail. / Die Fähigkeit, Toxine zu produzieren, ist unter verschiedensten Bakterienstämmen sehr verbreitet. Zu diesen Toxinen zählt auch die Familie der binären AB-Toxine, die hauptsächlich von Bakterien der Gattung Bacillus und Clostridium gebildet werden. Charakteristisch für diese bakteriellen Proteintoxine ist der Wirkungsmechanismus der Zellintoxikation. Eine porenformende Untereinheit B bindet eine enzymatische Untereinheit A und transportiert diese in das Zytosol von Zielzellen, die dort tödliche Wirkung entfalten. Es wird angenommen, dass die einzelnen Komponenten an sich nicht toxisch sind, sondern nur in Kombination Zellvergiftung auslösen. Anthrax-Toxin, das von dem Gram-positiven Bakterium Bacillus anthracis produziert wird, ist das bekannteste und am besten untersuchte binäre Toxin, besonders seit es im Jahr 2001 als Biowaffe eingesetzt wurde. Im Gegensatz zu anderen binären Toxinen besitzt das Anthrax-Toxin zwei enzymatische Komponenten: Edema Factor (EF), eine kalzium- und calmodulinabhängige Adenylatzyklase, und Lethal Factor (LF), eine zinkabhängige Metalloprotease. Protective Antigen (PA) ist die porenformende Komponente, die für die Binding und die Translokation der enzymatischen Untereinheiten verantwortlich ist. Clostridium botulinum produziert neben dem bekannten Botulinumtoxin (Botox) eine Reihe weiterer Toxine, unter anderem das binäre C2 Toxin. Dieses besteht aus der Binde- und Translokationskomponente C2II und der enzymatischen Komponente C2I, die als ADP-Ribosyltransferase fungiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden der Translokationsmechanismus und die kinetischen Bindeeigenschaften dieser Toxine biophysikalisch untersucht. In Kapitel 2 wird die Bindung der N-terminalen Fragmente EFN und LFN an den PA-Kanal in künstlichen Lipidmembranen analysiert. Obwohl die Spannungs- und Ionenstärkeabhängigkeit unverändert sind, weisen die verkürzten Proteine deutlich geringe Bindeaffinitäten zu PA im Vergleich zu den vollständigen Proteinen auf. Die Ergebnisse zeigen, dass, anders als bisher angenommen, weitere Kräfte als die zwischen dem N-Terminus und dem PA-Kanal eine Rolle für die Bindung der enzymatischen Komponente spielen. Da bei einer Anthraxinfektion häufig keine frühen Symptome sichtbar sind, erfolgt die Behandlung mit Antibiotika in der Regel relativ spät. Daher werden neue Wirkstoffe benötigt, um einer Intoxikation vorzubeugen. Es ist bekannt, dass 4-Aminoquinolone, wie zum Beispiel Chloroquin, in der Lage sind, die PA-Pore zu blockieren und somit eine Zellvergiftung zu verhindern, allerdings haben diese Wirkstoffe starke Nebenwirkungen. In Kapitel 3 werden neue, vielversprechende Wirkstoffe beschrieben, die an PA binden können und Aufklärung darüber geben, welche Eigenschaften für die Bindung an PA im Allgemeinen verantwortlich sind. Des Weiteren wird untersucht, ob eine Kreuzreaktion zwischen den Komponenten des Anthrax- und C2-Toxins möglich ist (Kapitel 4). Dazu wird die Bindung einer enzymatischen Komponente an die Pore des entsprechenden anderen Toxins gemessen. Interessanterweise ergeben in vitro Experimente an künstlichen Lipidmembranen, dass PA an C2I bindet und in vivo Vergiftungen an humanen Zelllinien auslöst. Damit wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine heterologe Toxinkombination sowohl in vitro als auch in vivo funktionell ist. C2II hingegen ist zwar in der Lage, EF und LF zu binden, die Transportrate in Zielzellen ist jedoch sehr gering. Im Fall von PA bewirkt ein N-terminaler His6-tag, der an die enzymtischen Einheiten gekoppelt ist, eine Erhöhung der Bindeaffinität, beschrieben in Kapitel 5. Dies ist sowohl für nah verwandte Proteine der Fall als auch für Proteine, die nicht im Zusammenhang mit binären Toxinen stehen. Somit eröffnet sich die Möglichkeit, PA als universelles Transportprotein zu nutzen. In Kapitel 6 werden verschiedene Moleküle und Proteine beschrieben, die in der Lage sind, an PA zu binden. Vor allem positive Ladungen scheinen für die Bindung an PA-Kanäle verantwortlich zu sein, was mit der Tatsache, dass PA stark kationenselektiv ist, im Einklang steht. Des Weiteren wird zum ersten Mal beschrieben, dass verschiedene Kationen selbst als Bindepartner fungieren können. Seit einigen Jahren ist ein weiteres Toxin in den Fokus der Öffentlichkeit gerückt, da es zunehmend für nosokomiale Infektionen verantwortlich gemacht wird: CDT-Toxin von Clostridium difficile. Wie das C2-Toxin besitzt CDT-Toxin ADP-Ribosyltransferaseaktivität, was zu irreversiblen Schäden des Aktin- Zytoskeletts und somit zum Zelltod führt. Die biophysikalischen Eigenschaften, betreffend Porenbildung und Bindeaffinität des CDT-Toxins werden in Kapitel 7 beschrieben. Wir zeigen, dass die B Komponente CDTb fähig ist, zwei unterschiedliche Kanäle zu bilden. Einer dieser Kanäle ist dem des Iota-Toxins von Clostridium perfringens ähnlich, die Einzelkanalleitfähigkeit, Selektivität und Bindeeigenschaften sind vergleichbar. Die Bildung dieses Kanals ist abhängig von Cholesterin, wohingegen in Abwesenheit von Cholesterin überwiegend ein anderer Kanal geformt wird. Dieser zeigt eine für einen binären Toxinkanal ungewöhnlich hohe Einzelkanalleitfähigkeit, der Kanal ist anionselektiv und weist keinerlei Bindeaffinität zu der enzymatischen Komponente CDTa auf. Die Ergebnisse offenbaren neue Einblicke in die Formierung von Toxinkanälen und deuten darauf hin, dass dieses Toxin durch die Flexibilität der Kanalbildung möglicherweise zusätzliche Fähigkeiten besitzt, Zellintoxikation auszulösen. Dennoch ist die physiologische und pathogene Rolle dieser Eigenschaft noch weitestgehend ungeklärt und bedarf intensiver Untersuchung.
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Translational and rotational diffusion of micrometer-sized solid domains in lipid membranesPetrov, Eugene P., Petrosyan, Rafayel, Schwille, Petra 07 April 2014 (has links) (PDF)
We use simultaneous observation of translational and rotational Brownian motion of domains in lipid membranes to test the hydrodynamics-based theory for the viscous drag on the membrane inclusion. We find that translational and rotational diffusion coefficients of micrometer-sized solid (gel-phase) domains in giant unilamellar vesicles showing fluid–gel phase coexistence are in excellent agreement with the theoretical predictions. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.
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Ion binding to polymers and lipid membranes in aqueous solutionsSinn, Cornelia G. Unknown Date (has links)
University, Diss., 2004--Potsdam.
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Translational and rotational diffusion of micrometer-sized solid domains in lipid membranesPetrov, Eugene P., Petrosyan, Rafayel, Schwille, Petra January 2012 (has links)
We use simultaneous observation of translational and rotational Brownian motion of domains in lipid membranes to test the hydrodynamics-based theory for the viscous drag on the membrane inclusion. We find that translational and rotational diffusion coefficients of micrometer-sized solid (gel-phase) domains in giant unilamellar vesicles showing fluid–gel phase coexistence are in excellent agreement with the theoretical predictions. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.
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Membrane properties of cholesterol analogs with an unbranched aliphatic side chainMeyer, Thomas, Baek, Dong Jae, Bittman, Robert, Haralampiev, Ivan, Müller, Peter, Herrmann, Andreas, Huster, Daniel, Scheidt, Holger A. 07 December 2015 (has links) (PDF)
The interactions between cholesterol and other membrane molecules determine important membrane properties. It was shown that even small changes in the molecular structure of cholesterol have a crucial influence on these interactions. We recently reported that in addition to alterations in the tetracyclic ring structure, the iso-branched side chain of cholesterol also has a significant impact on membrane properties (Scheidt H. et al. 2013 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 12848-12851). Here we used synthetic cholesterol analogs to investigate the influence of an unbranched aliphatic side chain of different length. The 2H NMR order parameter of the phospholipid chains and therefore the molecular packing of the phospholipid molecules shows a significant dependence on the sterol’s alkyl side chain length, while , membrane permeation studied by a dithionite ion permeation assay and lateral diffusion measured by 1H MAS pulsed field gradient NMR are less influenced. To achieve the same molecular packing effect similar to that of an iso-branched aliphatic side chain, a longer unbranched side chain (n-dodecyl instead of n-octyl) at C17 of cholesterol is required. Obviously, sterols having a branched iso- alkyl chain with two terminal methyl groups exhibit altered cholesterol-phospholipid-interactions compared to analogous molecules with a straight unbranched chain.
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The influence of membrane bound proteins on phase separation and coarsening in cell membranesWitkowski, Thomas, Backofen, Rainer, Voigt, Axel 07 April 2014 (has links) (PDF)
A theoretical explanation of the existence of lipid rafts in cell membranes remains a topic of lively debate. Large, micrometer sized rafts are readily observed in artificial membranes and can be explained using thermodynamic models for phase separation and coarsening. In live cells such domains are not observed and various models are proposed to describe why the systems do not coarsen. We review these attempts critically and show within a phase field approach that membrane bound proteins have the potential to explain the different behaviour observed in vitro and in vivo. Large scale simulations are performed to compute scaling laws and size distribution functions under the influence of membrane bound proteins and to observe a significant slow down of the domain coarsening at longer times and a breakdown of the self-similarity of the size-distribution function. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.
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Diffusion and Conformational Dynamics of Semiflexible Macromolecules and Supramolecular Assemblies on Lipid MembranesHerold, Christoph 11 December 2012 (has links) (PDF)
Understanding the interaction of polyelectrolytes with oppositely charged lipid membranes is an important issue of soft matter physics, which provides an insight into mechanisms of interactions between biological macromolecules and cell membranes. Despite the fact that many (bio)macromolecules and filamentous supramolecular assemblies show semiflexible behavior, prior to this work very little was known about the conformational dynamics and Brownian motion of semiflexible particles attached to freestanding lipid membranes. In order to address these issues, diffusion and conformational dynamics of semiflexible DNA molecules and filamentous fd-virus particles electrostatically adsorbed to cationic freestanding lipid membranes were studied on the single particle level by means of optical wide-field fluorescence microscopy. Supergiant unilamellar vesicles (SGUVs) with diameters larger than 100 m represent a perfect model of a freestanding membrane. In this work, a method was developed that enabled the reliable and efficient electroformation of cationic SGUVs on ITO-coated coverslips. The utilization of SGUVs as model freestanding lipid bilayers allowed for determination of the previously unknown surface viscosity of DOPC/DOTAP membranes. In particular, the analysis of the translational diffusion coefficients of small (10, 20, 50 nm) membrane-attached anionic polystyrene beads has shown that the surface viscosity of DOPC/DOTAP membranes with CDOTAP = 1–7 mol% is independent of the DOTAP concentration and equals η = (5.9 ± 0.2) × 10−10 Pa s m.
The fluorescence video-microscopy investigation of single DNA molecules attached to cationic SGUVs revealed a previously unreported conformational transition of a membrane-bound DNA molecule from a 2D random coil, the original conformation in which DNA attaches to the membrane, to a compact globule. This membrane-mediated DNA condensation is favored at high cationic lipid concentrations in the membrane and long DNA contour lengths. The DNA compaction rate in the coil–globule transition is 124 ± 46 kbp/s, and the resulting DNA globule sizes were found to be 250–350 nm at DOPC membranes containing 1 mol% DOTAP and 130–200 nm for 7 mol% DOTAP, indicating a stronger compaction for higher charge densities in the membrane. Additional experiments with freestanding cationic membranes in the gel state and supported cationic lipid membranes with gel–fluid coexistence suggest that the DNA collapse on a freestanding fluid cationic membrane may be initiated by a local lipid segregation in the membrane and is accompanied by local membrane deformations, which eventually stabilize the compact DNA globule.
Furthermore, in this work single molecule studies of random-coil DNA molecules and filamentous fd-virus particles on a freestanding cationic lipid bilayer with a low charge density were carried out. The experiments revealed that these particles can be described as semiflexible chains in 2D. Taken together, DNA molecules and fd-virus particles cover a broad range of the ratio of contour length and persistence length from 0.4 to 82. The results of this work demonstrate that the mobility of such membrane-attached semiflexible particles is strongly affected by hydrodynamics in the lipid membrane and the surrounding bulk fluid, and can in essence be described using a hydrodynamics-based theory for a disk-shaped solid membrane inclusion with a characteristic size approximately equal to the radii of gyration of the particles.
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Diffusion and Conformational Dynamics of Semiflexible Macromolecules and Supramolecular Assemblies on Lipid MembranesHerold, Christoph 07 November 2012 (has links)
Understanding the interaction of polyelectrolytes with oppositely charged lipid membranes is an important issue of soft matter physics, which provides an insight into mechanisms of interactions between biological macromolecules and cell membranes. Despite the fact that many (bio)macromolecules and filamentous supramolecular assemblies show semiflexible behavior, prior to this work very little was known about the conformational dynamics and Brownian motion of semiflexible particles attached to freestanding lipid membranes. In order to address these issues, diffusion and conformational dynamics of semiflexible DNA molecules and filamentous fd-virus particles electrostatically adsorbed to cationic freestanding lipid membranes were studied on the single particle level by means of optical wide-field fluorescence microscopy. Supergiant unilamellar vesicles (SGUVs) with diameters larger than 100 m represent a perfect model of a freestanding membrane. In this work, a method was developed that enabled the reliable and efficient electroformation of cationic SGUVs on ITO-coated coverslips. The utilization of SGUVs as model freestanding lipid bilayers allowed for determination of the previously unknown surface viscosity of DOPC/DOTAP membranes. In particular, the analysis of the translational diffusion coefficients of small (10, 20, 50 nm) membrane-attached anionic polystyrene beads has shown that the surface viscosity of DOPC/DOTAP membranes with CDOTAP = 1–7 mol% is independent of the DOTAP concentration and equals η = (5.9 ± 0.2) × 10−10 Pa s m.
The fluorescence video-microscopy investigation of single DNA molecules attached to cationic SGUVs revealed a previously unreported conformational transition of a membrane-bound DNA molecule from a 2D random coil, the original conformation in which DNA attaches to the membrane, to a compact globule. This membrane-mediated DNA condensation is favored at high cationic lipid concentrations in the membrane and long DNA contour lengths. The DNA compaction rate in the coil–globule transition is 124 ± 46 kbp/s, and the resulting DNA globule sizes were found to be 250–350 nm at DOPC membranes containing 1 mol% DOTAP and 130–200 nm for 7 mol% DOTAP, indicating a stronger compaction for higher charge densities in the membrane. Additional experiments with freestanding cationic membranes in the gel state and supported cationic lipid membranes with gel–fluid coexistence suggest that the DNA collapse on a freestanding fluid cationic membrane may be initiated by a local lipid segregation in the membrane and is accompanied by local membrane deformations, which eventually stabilize the compact DNA globule.
Furthermore, in this work single molecule studies of random-coil DNA molecules and filamentous fd-virus particles on a freestanding cationic lipid bilayer with a low charge density were carried out. The experiments revealed that these particles can be described as semiflexible chains in 2D. Taken together, DNA molecules and fd-virus particles cover a broad range of the ratio of contour length and persistence length from 0.4 to 82. The results of this work demonstrate that the mobility of such membrane-attached semiflexible particles is strongly affected by hydrodynamics in the lipid membrane and the surrounding bulk fluid, and can in essence be described using a hydrodynamics-based theory for a disk-shaped solid membrane inclusion with a characteristic size approximately equal to the radii of gyration of the particles.
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