Les résultats des études cliniques récentes évaluant l'impact de l'augmentation du HDL-C sur la survenue des maladies cardiovasculaires n'ont pas permis de démontrer une efficacité significative de cette stratégie thérapeutique ciblée sur le HDL-C. L'évaluation de la fonctionnalité des particules HDL dans sa capacité à assurer le retour du cholestérol des tissus périphériques au foie s'avère plus importante que la simple mesure du HDL-C. L'objectif de mes travaux de recherche a été d'évaluer la fonctionnalité des particules HDL en fonction du contexte métabolique, inflammatoire et génétique de chaque individu. Mes travaux de recherche ont démontré que la niacine réduit l'athérogénicité des lipoprotéines durant la période postprandiale modulant par conséquent la fonctionnalité des particules HDL dans la voie du transport inverse de cholestérol. J'ai également montré que certaines pathologies infectieuses associées à des taux bas de HDL-C, entrainent une baisse de la capacité des particules HDL à stimuler l'efflux de cholestérol à travers le macrophage humain. En revanche, j'ai montré que des variations génétiques entrainant des taux élevés de HDL-C ne sont pas associées à une dysfonction des particules HDL dans la voie du transport inverse de cholestérol. Mes travaux soulignent l'importance de considérer que la fonctionnalité des particules HDL est modulée in vivo par des contraintes métaboliques inflammatoires et génétiques d'où il est nécessaire que les thérapies en cours de développement visant à augmenter la fonction des HDL soient résistantes aux modifications métaboliques et inflammatoires afin d'assurer une athéroprotection efficace. / HDL cholesterol as a therapeutic target has been the focus over the past 20 years mainly because its plasma concentrations are inversely correlated with the risk of coronary events. However, recent clinical trials involved the addition of niacin or CETP inhibitors to a statin in patients with CHD who had well controlled LDL-C levels have failed to show evidence of a significant reduction in cardiovascular events. Studies on the capacity of HDL to promote reverse cholesterol transport pathway have suggested that this is a better predictor of prevalent atherosclerotic disease than HDL-C itself. The main purpose of my project was to evaluate the impact of metabolic context, inflammation and genetics on modulation of HDL functionality. I have shown that extended release niacin/laropiprant treatment reduces atherogenic postprandial lipoproteins in patients with metabolic disorders stabilized by statins, having consequences on reverse cholesterol transport pathway and HDL functionality. Moreover, I have shown that infectious diseases such as HIV, induce an alteration in the capacity of HDL particles to stimulate cholesterol efflux from human macrophages. I have also shown that mutations causing high levels of HDL-C, are characterized by the presence of functional HDL in their capacity to stimulate reverse cholesterol pathway. However such patients are not systematically protected against cardiovascular disease highlighting the complex relationship between cholesterol efflux and the prediction of cardiovascular events. Those results point out the relevance of developing therapeutic approaches targeting HDL function and reverse cholesterol transport pathway.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les maladies cardiovasculaires (CV) représentent la première cause de mortalité lors de l'insuffisance rénale chronique (IRC). Cette morbidité apparat précocement lors de l'IRC et ne peut être explique par les facteurs de risque traditionnels. Le stress oxydant (SO), composante du cortège métabolique de l'IRC, représente un facteur de risque non traditionnel intriqué avec l'inflammation et la malnutrition. Le but de ce travail a été d'étudier la place du SO dans la survenue des complications CV au cours de l'IRC sur modale animal, puis de comparer le profil protéomique et la fonctionnalité des HDL in vitro entre sujets hémodialysés (HD) et témoins. Le SO au niveau CV a été étudié dans un modèle animal (adénine) d'IRC associé à la malnutrition. L'activité de la NADPH oxydase cardiaque est triple, alors que les activités des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale et de la SOD sont normales. Cette surproduction d'anion super oxyde est associé à une surexpression de l'ostéopontine et du pro-collagène de type I. L'étude protéomique des HDL de sujets HD et témoins a permis de préciser les anomalies qualitatives associées à la baisse des HDL induite par l'IRC. Les propriétés anti-oxydantes des HDL de ces mêmes sujets ont été étudiées in vitro sur un modèle d'oxydation des LDL au cuivre et sur un modèle cellulaire d'activation de la NADPH oxydase. En comparaison aux témoins, les HDL des sujets HD perdent leur capacité de protection des LDL contre l'oxydation. Par contre, la modulation de la NADPH oxydase sur modèle cellulaire est conservée avec les HDL de sujets HD mais serait moindre en présence d'une forte inflammation systémique. Ces résultats suggèrent que le SO est au cœur des complications cardiaques au cours de l'IRC. Parmi les mécanismes de défense endogènes, les propriétés anti-oxydantes des HDL sont en partie altérées chez le sujet HD. / Cardiovascular (CV) diseases are the first cause of mortality during chronic kidney disease (CKD) and cannot only be explained by traditional risk factors (age, gender, dyslipidemia, hypertension). Oxidative stress, which has been associated with CKD, appears as a non-traditional risk factor closely interconnected with inflammation and malnutrition.This study aimed at investigating oxidative stress in CV complications in uremic rats. Then, HDL proteomic profile and in vitro functionality of HDL were compared between hemodialyzed (HD) patients and control subjects.First, an animal model of CKD associated with malnutrition, the adenine-fed rats, was set up in order to study CV oxidative stress. NADPH oxidase activity was increased three-fold, but the maximal activity of mitochondrial respiratory chain complexes and SOD were not different between groups. Superoxide anion output was associated with accumulation of osteopontin and of pro-collagen type I. In a second part, HDL proteomic study from HD and control subjects was performed to characterize qualitative modifications associated with the decrease in HDL observed in CKD. HDL anti-oxidative activities from these subjects were studied in vitro in a model of copper-induced LDL oxidation and in a cellular model of NADPH oxidase activation. Compared to control, HDL from HD patients failed to protect LDL oxidation. By contrast, HDL modulation of NADPH activity is maintained in HD patients but could be impaired by elevated inflammation.These results suggest that oxidative stress is a key event in cardiac complications during CKD. Among protective endogenous mechanisms, HDL anti-oxidative properties could be impaired in HD patients.

Studies were funded by Colegio de Postgraduados, México. CONACyT, México. SRE, México. Ministère de l’Éducation du Québec, University of Montreal and an Operating Grant to B.D. Murphy from the Canadian Institutes of Health Research. / Résumé L’approvisionnement en cholestérol est un facteur limitant la stéroïdogenèse ovarienne. Pour cette raison, la majorité du cholestérol requis pour la synthèse des stéroïdes est importé de la circulation via les récepteurs des lipoprotéines de haute (HDL) et de basse densité (LDL) nommés scavenger receptor (SR-BI) et low-density lipoprotein receptor (LDLr). L’ARN messager de SR-BI est exprimé dans les ovaires de porcs durant toutes les étapes de la folliculogenèse ainsi que dans le corps jaune (CL). L’expression de la protéine SR-BI a également été détectée dans les follicules de souris lors du cycle œstral. Chez les deux espèces, l’expression est concentrée dans le cytoplasme et en périphérie des cellules du follicule. Les gonadotrophines induisent l'expression de SR-BI dans les cellules de la granulosa porcines, avec une expression cytoplasmique qui augmente durant la période périovulatoire, et avec une migration aux périphéries cellulaires durant la maturation du CL. Une conformation de 82 kDa de SR-BI est fortement exprimée dans le CL porcin, avec une conformation moins abondante de 57 kDa. Les différences entre les conformations sont attribuables à la glycosylation. La culture in vitro de follicules porcins avec des gonatrophines chorioniques humaines (hCG) a induit une hausse de régulation dépendante du temps du SR-BI de 82 kDa dans les cellules du granulosa. SR-BI et LDLr ont été exprimés réciproquement, avec LDLr étant le plus élévé dans les cellules folliculaires du granulosa et diminuant précipitamment avec la formation du CL. Pour explorer plus en détail les mécanismes d’approvisionnement en cholestérol de la stéroïdogenèse ovarienne, nous avons examiné des souris soumis à un traitement de désaccouplement de l'ovulation, et des souris portant la mutation nulle du gène Scarb1 (SR-BI-/-). Les résultats ont démontré que des ovocytes enfermés dans des structures lutéinisées expriment SR-BI. Les souris SR-BI-/ - présentaient de petits CLs, et de large follicules avec des cellules de thèque hypertrophiées et des kystes folliculaires avec des cavités remplies de sang et une diminution de 50% du niveau de progestérone dans le sérum. Les souris SR-BI-/ - traitées avec une combinaison de 20 g / g de mevinoline et 100  g / g de chloroquine ont démontré une diminution de 43% du niveau de progestérone sérique chez le type sauvage et de 30% chez les souris SR-BI-/ -. L’expression protéique de l’enzyme limitant pour la synthèse du cholestérol, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGR), a augmenté chez les souris SR-BI-/-. Nous avons présenté des preuves démontrant que les cellules des follicules expriment le SR-BI durant la stéroïdogenèse et que la lutéinisation augmente l’expression de SR-BI. La maturation post-transcriptionelle est caractérisée par la glycosylation. Sous des conditions normales, l’expression de LDLr est arrêtée durant la lutéinisation. Ainsi SR-BI devient le facteur principal pour l’importation du cholestérol extracellulaire. En plus, la perturbation extracellulaire du cholestérol synthétisé de novo et l’absorption par les LDLr chez les souris SR-BI-/- diminuent la fonction lutéal. L’homéostasie du cholestérol ovarien est très importante pour une lutéinisation adéquate et sa perturbation mène à une réduction, mais non à un blocage complet, de la fonction lutéal. En conclusion, l’expression de SR-BI est un facteur important, mais non essentiel, pour maintenir l’homéostasie du cholestérol ovarien et la synthèse des stéroïdes, et la lutéinisation. Un réseau de mécanismes complémentaires et compensatoires d’approvisionnement en cholestérol agit en concert pour assurer la synthèse des stéroïdes ovariens. / Abstract Ovarian cholesterol supply is rate limiting to ovarian steroidogenesis. For this reason, the majority of cholesterol required for steroid synthesis is imported via scavenger receptor-BI (SR-BI) and the low-density lipoprotein (LDL) receptor from circulating HDL and LDL. SR-BI mRNA is expressed in pig ovaries at all stages of folliculogenesis and in the corpus luteum (CL). SR-BI protein expression in mouse ovary during estrous cycle was also detected. In both species, expression is concentrated in cytoplasm and periphery of follicular cells. Gonadotropins induce SR-BI expression in pig granulosa cells, with cytoplasmic expression increasing through the periovulatory period, with migration to the cell periphery as the CL matured. An 82-kDa form of SR-BI is strongly expressed in the pig CL, with the less abundant 57-kDa form, differences between forms are attributable to glycosylation. In vitro culture of pig follicles with human chorionic gonadotropin (hCG) induced time-dependent upregulation of 82-kDa SR-BI in granulosa cells. SR-BI and LDL receptor were reciprocally expressed, with the latter highest in follicular granulosa cells, declining precipitously with CL formation. To further explore mechanisms of cholesterol supply to ovarian steroidogenesis, we examined mice treated to uncouple ovulation and mice bearing null mutation of the Scarb1 gene (SR-BI-/-). Results show entrapped oocytes in luteinized structures expressed SR-BI. SR-BI-/- mice displayed small corpora lutea, large follicles with theca cells hypertrophied, follicular cysts with blood filled cavities and 50% decreased in plasma progesterone. In SR-BI-/- mice, treatment with a combination of 20 g/g of mevinolin and 100 g/g of chloroquine (CHLORO) was employed to disturbed cholesterol sources. Serum progesterone was reduced by 43% in wild type and 30% in SR-BI-/- mice. The protein expression of the rate-limiting enzyme for cholesterol synthesis, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGR) increased in SR-BI-/- mice. It was concluded that follicular cells express SR-BI during follicle development and luteinization causes upregulation of SR-BI expression. Posttranslational maturation is characterized by glycosylation. Under normal conditions expression of the LDLr (low density lipoprotein recepors) is extinguished during luteinization such that SR-BI becomes the principal means of importation of extracellular cholesterol. Further, perturbation of cholesterol de novo synthesis and uptake from LDLr in SR-BI-/- mice leads to a reduction of luteal function. Ovarian cholesterol homeostasis is central to adequate luteinization, and its perturbation leads to reduction, but not to complete impairment, of luteal function. We conclude that SR-BI expression is an important but not essential factor in maintaining ovarian cholesterol homeostasis, steroid synthesis and luteinization. A network of complementary and compensatory cholesterol supply mechanisms act in concert to assure ovarian steroid synthesis.

INTRODUCTION : Il a été démontré que le nombre de lipoprotéines apolipoprotéine B (apoB) est un prédicteur du développement du diabète de type 2 (DT2), mais le mécanisme est inconnu. La résistance à l'insuline (RI) et l'hyperinsulinémie compensatoire (HI) entraînent l’épuisement des cellules β et la progression vers le DT2. De plus, l'activation du système de l'interleukine -1β (IL- 1β) est impliquée dans la pathophysiologie du DT2. Notre objectif était donc d'étudier si l’apoB est associé à la RI et à l’HI chez les humains et si cette corrélation est médiée par l’activation du système IL-1β. MÉTHODOLOGIE : 47 femmes ménopausées, non diabétiques, obèses ou en surpoids et 28 hommes, âgés de 45 à 74 ans ont été recrutés. La sécrétion d'insuline (SI) et la sensibilité à l'insuline ont été mesurées par un clamp Botnia modifié. La 1ère et 2ème phase de SI furent mesurées lors d'un test de tolérance au glucose intraveineux (IVGTT) d’une heure, suivi d’un clamp hyperinsulinémique euglycémique (HEIC) de 3 heures (taux de perfusion d'insuline de 75 mU/m2/min) pour mesurer la sensibilité à l'insuline lors des 30 dernières minutes du clamp (état d'équilibre). La sensibilité à l'insuline est exprimée comme étant le taux de perfusion de glucose (GIR) seul ou divisé par le taux d’insuline à l’état d’équilibre (M/I). RÉSULTATS : Chez les femmes, l’apoB à jeun corrélait avec une augmentation de la 2e phase de SI, la SI totale et la sécrétion totale de C-peptide (r=0,202; r=0,168; r=0,204) et avec une diminution de la sensibilité à l'insuline (GIR r=-0,299; M/I r=-0,180) indépendamment de l'adiposité. L’IL-1Ra à jeun (indicateur de l’activation du système IL-1β) corrélait positivement avec la 2e phase, la SI totale et la sécrétion totale de C-peptide (r=0,217; r=0,154; r=0,198) et négativement avec la sensibilité à l'insuline (GIR r=-0,304; M/I r=-0,214). L’IL-1Ra était également corrélée avec l'apoB (r=0,352). Une fois corrigé pour l'IL-1Ra, toutes les associations entre l'apoB et les indices de sensibilité à l'insuline et de SI ont été perdues. Malgré des glycémies similaires, il n’y avait pas de corrélation de l’apoB avec les indices mesurés chez les hommes. CONCLUSION : L’apoB est associé à l’HI et la RI chez les femmes non diabétiques obèses et en surpoids, potentiellement via l'activation du système IL-1β. Ces différences sexuelles doivent être prises en compte dans l'exploration de la physiopathologie du DT2. / INTRODUCTION: The number of plasma apolipoprotein B lipoproteins (apoB) is reported to predict the development of type 2 diabetes (T2D); however the underlying mechanism is unknown. Insulin resistance (IR) and compensatory hyperinsulinemia (HI) are believed to promote β-cell exhaustion and progression to T2D. Moreover, the activation of the interleukin-1β (IL-1β) system is implicated in the pathophysiology of T2D. Our aim was thus to investigate whether plasma apoB associates with IR and HI in humans and whether this is mediated through the IL-1β system. METHODOLOGY: 47 non-diabetic overweight and obese postmenopausal women and 28 men, 45-74 years old were recruited. Insulin secretion (IS) and insulin sensitivity were examined by a modified Botnia clamp. 1st and 2nd phase IS were measured during a 1 hour intravenous glucose tolerance test (IVGTT), followed by a 3 hour hyperinsulinemic-euglycemic clamp (HEIC, insulin infusion rate of 75 mU/m2/min) to measure insulin sensitivity during the last 30 minutes of the clamp (steady state). Insulin sensitivity was expressed as steady state glucose infusion rate (GIR) alone or divided over steady state plasma insulin (M/I). RESULTS: In women, fasting plasma apoB correlated positively with increased 2nd phase and total IS and with total C-peptide secretion (r=0.202; r=0.168; r=0.204 respectively) and negatively with insulin sensitivity (r: GIR= -0.299 and M/I =-0.180) independent of adiposity. Similar to plasma apoB, fasting plasma IL-Ra (indicator of activated IL-1β system) correlated positively with 2nd phase and total IS and with total C-peptide secretion (r=0.217; r=0.154; r=0.198 respectively) and negatively with insulin sensitivity (GIR r=-0.304; M/I r=-0.214). Fasting plasma IL-Ra also correlated with apoB r=0.352). Once corrected for IL-1Ra, the associations between apoB and the indexes of insulin sensitivity and IS were all lost. Despite similar fasting glucose, plasma apoB did not correlate with any indices of insulin secretion or sensitivity in men. CONCLUSION: ApoB is associated with HI and IR in non-diabetic overweight and obese women, which may be mediated through activation of the IL-1β system. Gender differences may need to be considered in exploring the pathophysiology of T2D in humans.

L’infertilité affecte jusqu’à 15-20% des couples en âge de se reproduire. C’est pourquoi, mieux comprendre les mécanismes à la base de la fécondation est essentiel pour l’identification de nouvelles causes d’infertilité et l’optimisation des techniques de reproduction assistée. La capacitation est une étape de la maturation des spermatozoïdes qui se déroule dans le tractus génital femelle. Elle est requise pour la fécondation d’un ovocyte. Notre laboratoire a démontré que des protéines du plasma séminal bovin, appelées protéines Binder of SPerm (BSP), se lient aux phospholipides portant des groupements choline à la surface de la membrane des spermatozoïdes lors de l’éjaculation et promeuvent la capacitation. Ces protéines exprimées par les vésicules séminales sont ubiquitaires chez les mammifères et ont été étudiées chez plusieurs espèces dont l’étalon, le porc, le bouc et le bélier. Récemment, l’expression de gènes homologues aux BSP a été découverte dans les épididymes d’humains (BSPH1) et de souris (Bsph1 et Bsph2). Notre hypothèse est que les BSP chez ces deux espèces sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de la maturation épididymaire et ont des rôles dans les fonctions spermatiques, similaires à ceux des protéines BSP bovines. Les protéines BSP humaines et murines représentent une faible fraction des protéines totales du plasma séminal. Pour cette raison, afin d’étudier leurs caractéristiques biochimiques et fonctionnelles, des protéines recombinantes ont été produites. Les protéines recombinantes ont été exprimées dans des cellules Escherichia coli origami B(DE3)pLysS en utilisant un vecteur d’expression pET32a. Suivant la lyse cellulaire, les protéines ont été dénaturées avec de l’urée et purifiées par chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés. Une fois liées à la colonne, les protéines ont été repliées à l’aide d’un gradient d’urée décroissant avant d’être éluées. Cette méthode a mené à la production de trois protéines recombinantes (rec-BSPH1 humaine, rec-BSPH1 murine et rec-BSPH2 murine) pures et fonctionnelles. Des expériences de chromatographie d’affinité et de co-sédimentation nous ont permis de démontrer que les trois protéines peuvent se lier à des ligands connus des protéines BSP comme la gélatine et l’héparine en plus de pouvoir se lier aux spermatozoïdes. Nos études ont également révélées que les deux protéines rec-BSPH1 peuvent se lier aux liposomes de phosphatidylcholine (PC) et sont capable de promouvoir la capacitation des spermatozoïdes. À l’opposé, rec-BSPH2 ne peut ni se lier aux liposomes de PC, ni stimuler la capacitation. Finalement, les protéines recombinantes n’ont aucun effet sur la réaction acrosomique ou sur la motilité des spermatozoïdes. Chez les bovins, les protéines BSP induisent la capacitation grâce des interactions avec les lipoprotéines de haute densité (HDL) et les glycosaminoglycanes. Puisque le HDL est également un joueur important de la capacitation chez la souris, le rôle de la protéine native BSPH1 murine au niveau de la capacitation induite par le HDL a été étudié. Les résultats obtenus suggèrent que, in vivo, la protéine BSPH1 de souris serait impliquée dans la capacitation via une interaction directe avec le HDL. Comme les protéines BSPH1 humaines et murines sont orthologues, ces résultats pourraient aussi s’appliquer à la fertilité humaine. Les résultats présentés dans cette thèse pourraient mener à une meilleure compréhension de la fertilité masculine et aider à améliorer les techniques de reproduction assistée. Ils pourraient également mener au développement de nouveaux tests diagnostiques ou de contraceptifs masculins. / Infertility can affect as much as 15-20% of couples of reproductive age. Therefore, elucidating mechanisms occurring during fertilization is needed to resolve cases of infertility and optimize assisted reproductive technology procedures. Sperm capacitation is a maturation step that takes place in the female genital tract and is deemed to be essential for sperm to fertilize an oocyte. Our laboratory has demonstrated that proteins from bovine seminal plasma called Binder of SPerm (BSP) proteins bind to choline phospholipids on the sperm membrane upon ejaculation and promote capacitation. These proteins expressed in seminal vesicles are ubiquitous amongst mammals and have been studied in many species including stallion, boar, ram and goat. More recently, the expression of BSP-homologous genes has been discovered in the epididymis of humans (BSPH1) and in mice (Bsph1 and Bsph2). We hypothesized that the BSP homologs in these two species are added to sperm during epididymal maturation and play similar roles in sperm functions as bovine BSP proteins. BSP proteins in humans and mice constitute only a minute percentage of the seminal plasma proteins. Thus, to study their biochemical and functional characteristics recombinant proteins were produced. Recombinant proteins were expressed in Escherichia coli origami B(DE3)pLysS cells using a pET32a expression vector. Following cell lysis, proteins were denatured using urea and purified by immobilized metal ion affinity chromatography. Once bound to the resin, proteins were refolded using a decreasing urea gradient after which they were eluted. This method led to the production of three pure, functional recombinant proteins (human rec-BSPH1, mouse rec-BSPH1 and mouse rec-BSPH2). Using affinity chromatography and co-sedimentation experiments, we were able to demonstrate that all three recombinant proteins bind known ligands of BSP proteins including gelatin, heparin and have the ability to bind to sperm. Studies also revealed that both rec-BSPH1 proteins bind to phosphatidylcholine (PC) liposomes and promote sperm capacitation. However, rec-BSPH2 neither binds to PC liposomes nor stimulates capacitation. Recombinant proteins had no effect on acrosome reaction or sperm motility. In bovine, BSP proteins promote sperm capacitation through interactions with high-density lipoproteins (HDL) and glycosaminoglycans. Since in mice HDL is also a major factor implicated in capacitation, the role of the native murine BSPH1 protein in HDL-induced capacitation was investigated. Results obtained suggest that, in vivo, murine BSPH1 protein could act in capacitation via a direct interaction with HDL. As human and murine BSPH1 are orthologs, these results could possibly also apply to human fertility. The results presented in this thesis could lead to a better understanding of male fertility and help improve assisted reproduction technology procedures. They could also lead to the development of diagnostic tests as well male contraceptives.

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène impliquée dans la toxi-infection alimentaire à l’origine de la listeriose, une maladie peu fréquente mais avec un taux de mortalité de 25 % chez l’homme. Cette bactérie est capable de former un biofilm lui permettant de mieux résister aux stress environnementaux ainsi qu’aux traitements de décontamination. Une nouvelle stratégie d’analyse génomique a été développée et a permis de cibler des systèmes de sécrétion et des protéines potentiellement impliqués dans la formation de biofilm. L’inactivation de la voie SecA2 entraîne la formation d’un biofilm aérien et par conséquent fragile. Ce morphotype est capable de croître de façon sessile à 20°C sur du polystyrène alors que ce n’est pas le cas pour la souche sauvage. De nouvelles protéines sécrétées de façon SecA2 dépendante ont été identifiées par l’étude de l’exoprotéome du mutant ΔsecA2 en comparaison avec celui de la souche sauvage. Le rôle des lipoprotéines dans la formation de biofilm ainsi que leur maturation par les peptidases signal de type II, LspA et LspB, a également été abordé. La combinaison d'une analyse de l’expression des gènes codant les lipoprotéines au cours de la formation de biofilm avec l’analyse génomique basé sur le sécrétome a permis de cibler trois lipoprotéines, dont LpeA qui serait impliquée dans les phases tardives de formation de biofilm. Enfin, l’importance majeure de LspA dans la maturation des lipoprotéines, a été mise en évidence par l’étude de l’exoprotéome des doubles mutant ΔlgtΔlspA et ΔlgtΔlspB en comparaison avec celui de Δlgt. / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogenic bacteria responsible for listeriosis, a rare but high mortality rate disease in humans (25 %). This bacterium can form biofilm allowing a better resistance to environmental stresses as well as decontamination treatments. A new strategy for genomic analysis was developed and allowed to target secretion systems and proteins potentially involved in biofilm formation. Inactivation of the SecA2 pathway leads to the formation of an aerial and fragile biofilm. This morphotype is able to grow in a sessile mode at 20 °C on polystyrene whereas this is not the case for the wild type strain. New proteins secreted in a SecA2 manner were identified by comparing the ΔsecA2 exoproteome to the one of the wild type. The role of lipoproteins in biofilm formation and their maturation by the signal peptidase II, LpsA and LspB, was also tackled. Combining expression analysis of genes encoding lipoproteins during biofilm formation with genomic analysis based on the secretome allowed targeting three lipoproteins, including LpeA, which appeared to be involved in the later stages of biofilm formation. Finally, the importance of LspA in the maturation of lipoproteins,was highlighted by comparing of the double mutant ΔlgtΔlspA and ΔlgtΔlspB exoproteomes to the one of Δlgt.

Introduction/objectif : La dyslipidémie des sujets obèses insulinorésistants est principalement caractérisée par une augmentation plasmatique des LRT hépatiques (LRT-apo-B100) et intestinales (LRT-apo-B48). La chirurgie bariatrique, largement pratiquée dans le traitement de l'obésité, est associée à l'amélioration de nombreuses anomalies métaboliques. Nous avons étudié l'effet de la chirurgie bariatrique sur le métabolisme des LRT intestinales et hépatiques.Méthodes/résultats : Le métabolisme des LRT de 22 patients obèses non diabétiques bénéficiant d'une chirurgie bariatrique : sleeve gastrectomie (SG ; n=12) ou bypass gastrique (BP ; n=10) a été étudié par une méthode d'enrichissement isotopique stable (D3-L-Leucine) en alimentation continue. Chaque sujet a réalisé deux études cinétiques : une 1 mois avant et une 6 mois après la chirurgie. Le résultat principal est une diminution de la taille du pool de LRT-apo-B100 après une SG et un BP (p<0,01) expliquée par une augmentation du taux de clairance des LRT-apo-B100 (SG : p<0,05) sans diminution du taux de production. Le pool de LRT-apo-B48 est significativement réduit après une SG (p<0,05), sans explication claire à part une tendance à la diminution du taux de production. La diminution du pool de LRT-apo-B100 est significativement corrélée à la diminution de la concentration en apo-CIII dans le groupe entier.Conclusion : Cette étude est la première étude cinétique réalisée chez l'Homme explorant les mécanismes d'amélioration du métabolisme des LRT après une chirurgie bariatrique. Cette amélioration du métabolisme peut contribuer à la diminution de la mortalité cardiovasculaire observée après une chirurgie bariatrique. / Introduction and objective: The dyslipidemia of insulin-resistant obese patients is widely characterised by the elevation of plasma triglyceride-rich lipoproteins (TRL) of both hepatic (TRL-apoB-100) and intestinal (TRL-apoB-48) origin. Bariatric surgery is a well-established and effective modality for the treatment of obesity, and is associated with improvements in a number of metabolic abnormalities that are associated with obesity. Here, we have investigated the effect of bariatric surgery on intestinal and hepatic TRL metabolism. Approach and Results: Twenty two non-diabetic, obese subjects undergoing bariatric surgery: sleeve gastrectomy (SG; n=12) and gastric bypass (BP; n=10) were studied using a stable isotope (D3-L-Leucine) enrichment methodology, in the constant fed state. Each subject underwent two lipoprotein turnover studies: 1 month before and 6 months after surgery. The main finding was a reduction in TRL-apo-B100 concentration following both SG and BP procedures (P<0.01 for both), explained by an increase in TRL-apo-B100 fractional catabolic rate (P<0.05 for SG) without a reduction in production rate. TRL-apo-B48 concentration was significantly reduced following SG, with no clear explanation other than a trend towards reduction in production rate. The reduction of TRL-apo-B100 concentration was significantly associated with a reduction of plasma apo-CIII in the pooled group of patients undergoing bariatric surgery. Conclusions: This is the first human kinetic study to explore the mechanism of improvement of TRL metabolism following bariatric surgery. These effects may contribute to the decrease of cardiovascular mortality after surgery.

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques sont un problème majeur de santé publique. Les thérapies actuellement disponibles se fondent sur une approche vasculaire de la prise en charge. L’arrivée de la thrombectomie mécanique comme traitement de routine de l’AVC, expose le patient à des lésions de reperfusion comme les transformations hémorragiques (TH). L’hyperglycémie aiguë, augmente ce risque. Nous avons mis au point un modèle préclinique pertinent et reproductible chez la souris permettant d’étudier les mécanismes de ces TH. Les lipoprotéines de haute densité (HDL) sont des complexes moléculaires ayant des propriétés protectrices. Nous avons démontré que lors de la phase aiguë de l’AVC, ces HDL subissaient des modifications structurelles et devenaient dysfonctionnelles. Un des mécanismes de cette altération est représenté par l’oxydation des protéines de surface notamment l’apoA-1 par la myéloperoxydase (MPO) libérée par les neutrophiles recrutés dans la zone ischémiée. Le dosage du taux plasmatique de MPO en phase aiguë d’AVC pourrait permettre de mieux caractériser ce mécanisme. L’injection de HDL a déjà prouvé son efficacité dans la diminution de la taille des infarctus cérébraux ainsi que dans la survenue des complications hémorragiques sur des modèles murin d’ischémie cérébrale. L’hypothèse d’un défaut d’efficacité des HDL dans cette condition pathologique particulière nous conduit à envisager une amélioration de leurs fonctions grâce à leur propriété de vecteur de molécules protectrices. Ces HDL seraient alors utilisées comme transporteur de molécules augmentant leur potentiel neuro- et endothélio-protecteur dans le traitement de l’AVC ischémique. / Ischemic stroke is a major public health problem. Currently, available therapies are based on a vascular approach. The advent of mechanical thrombectomy as a routine treatment for stroke exposes the patient to reperfusion injury such as hemorrhagic transformation (HT). Acute hyperglycemia increases this risk. We have developed a relevant and reproducible preclinical model in mice to study the mechanisms of these HT. High density lipoproteins (HDL) are molecular complexes with protective properties. We demonstrated that during the acute phase of stroke, these HDLs become dysfunctional. One of the mechanisms of this alteration is represented by the oxidation of surface proteins including apoA-1 by myeloperoxidase (MPO) released by neutrophils recruited into the ischemic zone. The MPO plasmatic level determination in the acute phase of stroke could be relevant. The injection of HDL has already proved effective in reducing the size of infarct and in the occurrence of HT in murine models of stroke. The hypothesis of a lack of efficiency of HDL in this particular pathological condition leads us to consider an improvement of their functions thanks to their vector property of protective molecules. These HDLs would then be used as a transporter of molecules increasing their neuro- and endothelio-protective potential in the treatment of ischemic stroke.

Dans le plasma, la protéine humaine de transfert des esters de cholestérol joueun rôle central dans le métabolisme des lipoprotéines plasmatiques en catalysant le transfert net massique d'esters de cholestérol des HDL vers les lipoprotéines contenant de l'Apo.B, et de triglycérides des VLDL vers les HDL et LDL. Bien que le rôle de la CETP sur l'athérogénicité du profil lipoprotéique reste à l'heure actuelle encore ambigu, l'étude des mécanismes de régulation de cette protéine suscite un intérêt croissant d'un point de vue pharmacologique en particulier en ce qui concerne le développement d'inhibiteurs. <br />Une approche in vitro nous a permis de montrer que des composés amphipathiques (acides gras non estérifiés et rétinoïdes) constitués d'une chaîne carbonée hydrophobe et d'un groupement carboxylique ionisable induisaient une augmentation de l'activité de transfert des esters de cholestérol en augmentant l'électronégativité des particules lipoprotéiques. <br />In vivo, nos études ont permis de mettre en évidence une corrélation significative entre la concentration en acides gras non estérifiés liés aux protéines et l'activité de la CETP plasmatique chez des sujets normolipidémiques. L'effet des acides gras non estérifiés est encore plus marqué dans des situations pathologiques associées à une redistribution des AGNE de l'albumine vers les lipoprotéines plasmatiques (analbuminémie ou syndrôme néphrotique). La mise au point d'une méthode électrophorétique spécifique nous a permis de confirmer que, chez des sujets analbuminémiques, les échanges d'esters de cholestérol s'effectuent préférentiellement avec les lipoprotéines les plus électronégatives dont le contenu en AGNE est le plus élevé.<br />Globalement, les résultats de cette étude montrent que les AGNE constituent des modérateurs potentiels de l'activité de transfert des esters de cholestérol au niveau plasmatique et qu'ils pourraient ainsi influencer l'athérogénicité du profil lipoprotéique.