Systemic lupus erythematosus (SLE) is a systemic autoimmune disease that is characterized by auto-reactive T and B lymphocytes and abundant auto-antibodies against nuclear components that form immune-complexes and lead to inflammation, organ dysfunction and failure. The current treatment for SLE includes corticosteroid and immunosuppressant agents which are associated with side effects. Immunotherapy such as tolerogenic dendritic cells (DCs) and regulatory T cells have potential therapeutic implications in autoimmune diseases. DCs are professional antigen presenting cells with important role in promoting immune response and maintaining peripheral tolerance. Alternatively activated DC (aaDC) derived from treating monocyte-derived DCs with vitamin D3 and dexamethasone has demonstrated tolerogenicity and suppressed activation and proliferation of allogeneic T cells in in vitro human studies. As circulating DCs in SLE patients were reported to be hyperactive with increased expression of co-stimulatory molecules and hyper-responsiveness to immunostimulatory stimuli. Therefore, this study aims to examine if aaDCs derived from SLE patients possess tolerogenic properties, to delineate the underlying mechanisms and to examine for therapeutic effect by adoptive transfer of tolerogenic DCs in lupus mouse model. We found that lupus aaDCs derived in vitro displayed semi-mature phenotype with lower expression of co-stimulatory molecules compared with mature DCs. The tolerogenic phenotype remained stable despite challenge by CD40L, CpG-DNA and SLE serum. Lupus aaDCs showed comparable tolerogenic properties as aaDCs from healthy subjects with suppressive effect on allogeneic T cell activation and proliferation. In addition, lupus and normal aaDCs were shown to polarize normal and lupus naïve T cells into IL-10+ suppressive T cells that showed antigen-nonspecific suppressive effect on allogeneic third-party T cells. On the other hand, lupus and normal aaDCs skewed memory T cells to less inflammatory phenotype with reduced expression of IFN-ɤ and IL-17. Although aaDCs displayed a cytokine profile of IL-12loIL-10hi, addition of neutralizing anti-IL-10 and exogenous IL-12 did not reverse the suppressive effect of aaDCs on allogeneic T cells, suggesting their tolerogenicity was not related to cytokine imbalance between IL-12 and IL-10. Furthermore, aaDCs were found to express reduced level of RelB, a transcription factor regulating DC differentiation and maturation. As RelB can be a potential target to induce stable tolerogenic DCs, we constructed RelB shRNA to silence RelB in bone marrow derived DCs (BMDCs) from MRL/MPJ mice. The RelB shRNA transduced BMDCs showed lower level of RelB compared with scramble control shRNA, and displayed tolerogenic phenotype with decreased co-stimulatory molecules, but had no effect on the expression of chemokine receptors. When co-cultured with allogenic CD4+ T cells, RelB shRNA modified BMDCs showed suppressive function on T cell activation and proliferation and increased the production of IL-10 by T cells. However, in vivo study based on 5 mice per treatment group did not show significant effect of RelB shRNA modified BMDCs on disease progress of lupus mice compared to control mice. In conclusion, lupus aaDCs demonstrated tolerogenic properties with induction of IL-10 producing T cells with regulatory functions. RelB shRNA modified BMDCs showed tolerogenic properties in vitro but their in vivo effect on alleviation of murine lupus disease needs further study. / published_or_final_version / Medicine / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / abstract / toc / Paediatrics and Adolescent Medicine / Master / Master of Philosophy

published_or_final_version / Paediatrics / Master / Master of Philosophy

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INTRODUCCION: El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la producción de numerosos autoanticuerpos. Recientemente, se ha descrito un nuevo grupo denominado anticuerpos antifosfolípido (AAF), cuyo estudio ha despertado un gran interés por sus implicaciones clínicas y patogenéticas. Los AAF son un grupo heterogéneo de autoanticuerpos adquiridos de forma espontánea, que van dirigidos contra estructuras fosfolipídicas de las membranas celulares.La detección de los AAF se efectúa mediante diversas técnicas. Las más clásicas son las pruebas coagulométricas, que detectan un tipo de AAF denominado anticoagulante lúpico (AL). Otro método indirecto consiste en la detección de una serología luética falsamente positiva (SlFP) mediante técnicas reagínicas. Más recientemente se han descrito técnicas para la detección directa de AAF (RIA, ELISA) que han permitido la identificación de anticuerpos contra fosfolípidos específicos. De todos ellos, el anticoagulante lúpico (AL) y los anticuerpos anticardiolipina (ACL), son los que han merecido un mayor interés por parte de los investigadores. A pesar de los artículos publicados sobre el LES y los AAF, existen numerosas cuestiones controvertidas por resolver, entre las que destacan: a) la mayoría de los estudios determinan el AL o los ACL y raramente ambos a la vez, por lo que disponemos de poca evidencia sobre qué "test" es el más eficaz. Además, no todos los pacientes con AL tienen ACL y viceversa; b) No existe acuerdo sobre que prueba es la más adecuada para la detección del AL; y c) recientemente se han descrito otros ELISAs que detectan otros AAF como los antifosfatidilserina, etc., cuya importancia no esta bien definida.OBJETIVOS:En base a estas premisas hemos desarrollado esta Tesis cuyos objetivos son: 1) determinar la incidencia del anticoagulante lúpico en el LES, en base al empleo de una amplia batería de pruebas coagulométricas, a fin de valorar la utilidad de cada una de ellas; 2) desarrollar una técnica deELISA para determinar el anticoagulante lúpico, que fuera sencilla y reproducible; 3) determinar la incidencia de los anticuerpos anti-cardiolipina por ELISA, junto con otros AAF, como los anti-fosfatidilserina (AFS), antifosfatidil-inositol (AFI) y los anti-ácido fosfatidico (AFA); y 5) valorar la relación los diferentes AAF determinados en este estudio con la presencia de diversas manifestaciones clínicas y/o analíticas, a fin de comprobar si definen algún subgrupo específico.PACIENTES Y MÉTODO:Durante un periodo de dos años hemos estudiado de forma prospectiva un grupo de 92 pacientes (84 M y 8 V) afectos de LES en base a los criterios de la ARA (1982). En todos los casos se les ha determinado varios parámetros inmunológicos (ANA, ENA, complemento, etc.). El AL ha sido evaluado por diversas pruebas coagulométricas y hemos empleado varios ELISAs para determinar los ACL, AFS, AFA y AFI. Por último, hemos desarrollado un ELISA que emplea una tromboplastina comercial como antígeno para la determinación del AL.RESULTADOS:Las características de la serie son similares a las descritas en la literatura en relación a edad, sexo y manifestaciones clínicas. En 29p (32%) detectamos un AL, las pruebas coagulométricas más sensibles para su detección fueron el tiempo del veneno de víbora de Rusell diluido y el tiempo de inhibición de la tromboplastina tisular diluida. Hemos desarrollado un ELISA para detectar el AL con una tromboplastina comercial como antígeno que permite una adecuada detección del mismo y que tiene una buena correlación con las pruebas coagulométricas. Los anticuerpos antitromboplastina (ATP) tienen una incidencia en este estudio del 35%. La incidencia de los otros AAF por ELISA en el LES es alta, entre los que destaca los ACL (37%) y los AFS (32%). Al emplear el análisis multivariado para analizar la relación entre el AL y los diferentes AAF por ELISA, incluidos los ATP, observamos que estos eran los que tenían la mejor correlación (p<0.001).Al evaluar la relación entre los AAF y las manifestaciones clínicas y/o analíticas en el LES obtuvimos los siguientes resultados: - Un 8% de los pacientes tuvieron trombosis diversas. En el análisis univariado el AL y el isotipo IgG de los ATP, ACL y AFS tenían una asociación significativa, que era más intensa en aquellos pacientes con títulos más altos de AAF. Al aplicar el análisis multivariado el AL mostraba la mejor correlación (P=0.002), la trombocitopenia estuvo presente en un 20% de los casos, asimismo el AL y el isotipo IgG de los ATP, ACL y AFS tenían una asociación significativa, que era más intensa en aquellos pacientes con títulos más altos de AAF. En el análisis multivariado los ATP-IgG mostraban la mejor correlación (p<0,000).- Durante el tiempo del estudio ninguna paciente tuvo un aborto, aunque en 17 casos (20%) tenían antecedentes de uno o más abortos previos.- Encontramos una asociación significativa con el AL y los ATP-IgG. Otras asociaciones significativas se establecieron entre la anemia hemolítica y la neutropenia con los ATP y ACL, en ambos casos con el isotipo IgM.- No encontramos relación entre los AAF y la actividad de la enfermedad, nefropatía, afección del sistema nervioso central distinta de la vascular y ninguno de los parámetros inmunológicos estudiados.CONCLUSIONES: Las principales conclusiones de esta tesis las podemos resumir en los siguientes puntos:1. La incidencia de los AAF en el LES es alta, destacando el AL y los ATP, ACL y AFS. Los coeficientes de variación de las diferentes pruebas empleadas demuestran que son técnicas reproducibles aplicable a series amplias de pacientes.2. La técnica de ELISA con tromboplastina como antígeno permite una fácil y rápida detección del AL, lo que la ofrece como una alternativa válida a las pruebas coagulométricas.3. Los AAF definen un subgrupo de pacientes con LES que se caracterizan fundamentalmente por una elevada incidencia de trombosis, abortos y trombocitopenia. / At present there are many assays to detect APA in patients with SlE but only few prospective studies evaluating the relationship between several clinical features and these tests have been reported. OBJECTIVE: To analyze the phospholipid reactivity patterns, clinical and immunological characteristics of a series of 92 patients with SlE. METHODS: Eighty four females and 8 males with SLE (ARA revised criteria) were included in the study. The APA isotypes were determined by ELISA using cardiolipin (Cl), thromboplastin (TP), phosphatidic acid (PA) I phosphatidyljnositol (PI) and phosphatidylseryne (PS). Lupus anticoagulant (LAC) was evaluated by several coagulation assays. RESULTS: Twenty nine patients (32%) were positive for LAC; 32p(35%) for TP; 34p (37%) for Cl; 29p (32%) for PS; 26p (28%) for PA; 22p (24l) for PI. All phospholipids showed a good correlation with lAC, although this was higher for TP, and if these results are confirmed by others authors, this assay could became an alternative to coagulative tests to detect lAC. A significant statistical correlation was found between thrombosis and lAC, IgG-TP and IgG-CL. Thrombocytopenia was correlated with lAC, IgG-TP, IgG-Cl and IgG-PS. In addition, correlation was also found between the 19M isotypes of TP and Cl with hemolytic anemia and neutropenia. No correlation was found with disease activity, neurologic involvement (other than thrombotic events), treatment and any other clinical or immunological features (DNA and ENA antibodies, complement, etc.). CONCLUSIONS: Our results confirms that lAC and ELISA share a similar phospholipid reactivity. The most sensitive assays to detect APA were lAC, TP and Cl antibodies. These assays really define a subset of SlE patients mainly characterized by thrombotic events, thrombocytopenia and hemolytic anemia and neutropenia.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Univ., 2003. / Härtill 5 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--Case Western Reserve University, 2008. / [School of Medicine] Department of Epidemiology and Biostatistics. Includes bibliographical references.

Inaug.-Diss.--Amsterdam. / "Litteratuurlijst": p. 168-171.