L'obésité, avec les conséquences physiologiques qu'elle engendre, est sans doute une des pathologies entraînant le plus grand nombre de décès en Amérique du Nord. On note un accroissement de l'obésité chez les enfants qui semble pouvoir être corrélée au profil lipidique de la mère durant la grossesse. Cependant, les échanges lipidiques placentaires demeurent un volet de la science encore peu étudié. Dans le plasma, le cholestérol est véhiculé via les lipoprotéines, principalement par un certain type, soit les lipoprotéines à faible densité (LDL). Ces LDL natives sont reconnues par le récepteur aux LDL (LDLr) présent à la surface des syncytiotrophoblastes. Chez l'humain, le troisième trimestre de la grossesse associé à une hypercholestérolémie prononcée pouvant avoir comme conséquence d'engendrer des LDL oxydées. Ces particules sont considérées comme étant plus arthérogéniques, puisque leur affinité avec le LDLr est réduite. Ces LDL oxydées sont les ligands d'autres récepteurs soit le « lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor-1 » (LOX-1) et le « scavenger receptor type BI» (SR-BI). Par contre, la régulation de l'expression de ces différents récepteurs au niveau du placenta, en cas d'hypercholestérolémie, reste en grande partie inexplorée. Le but de cette étude est de caractériser la régulation de l'expression des différents récepteurs de LDL dans le placenta en fonction du profil lipidique maternel, soit de la concentration de cholestérol plasmatique, de l'indice de masse corporel pré-grossesse (IMC) et du gain de poids (GDP) en cours de grossesse. Les femmes sélectionnées sont dans un premier temps classées selon leur concentration plasmatique (inférieur à 7mM ou supérieur à 8mM), puis rétrospectivement classées selon leur IMC (normal, inférieur ou supérieur à la normale établie), ainsi qu'en fonction de leur GDP durant la grossesse (normal, inférieur ou supérieur à la normale). De plus, l'expression de ces différents récepteurs sera aussi quantifiée chez un groupe de femmes présentant un diabète gestationnel. Enfin, la localisation de ces récepteurs au niveau du syncytiotrophoblaste, soit au niveau de la membrane à bordure en brosse (BBM) ou de la membrane basale plasmique (BPM), sera déterminée. L'expression protéique des différents récepteurs dans le placenta est quantifiée par immunobuvardage de type Western et par immunohistochimie. Les résultats démontrent une diminution de l'expression du LDLr, chez les femmes ayant une concentration de cholestérol >8mM, qui semble être corrélée négativement à l'IMC et au GDP. Inversement, une augmentation de l'expression de LOX-1 est observée chez les femmes ayant une concentration de cholestérol <7mM et semble être corrélée positivement avec l'IMC, mais négativement avec le GDP. L'expression de SR-BI ne semble pas être modifiée. Ainsi, l'environnement placentaire est influencé par les IMC et GDP hors norme, ce qui, à long terme, pourrait être associé à une augmentation des problèmes cardiovasculaires. (Subventionné par IRSC) ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Placenta, LDL, LDL oxydées, LDLr, LOX-1, SR-BI, diabète gestationnel

Le travail présenté étudie les dénominateurs communs et les différences entre la maladie d'Alzheimer et les pathologies à prion.

Introduction : L'obésité est devenue une problématique prédominante dans notre société actuelle. Effectivement, en 2005, l'organisation mondiale de la santé estimait à plus de 400 millions le nombre d'individus obèses et elle estime qu'en 2015, 700 millions d'individus seront obèses. De plus, durant le processus du vieillissement et plus spécifiquement lors de la ménopause, on assiste à une modification de la composition corporelle (gain de masse grasse et perte de masse musculaire). Récemment, un sous-type d'obèse sain (MHO: Metabolically Healthy but Obese) a été mis en évidence dans la littérature. Contrairement aux obèses à risque, les MHO présentent des composantes métaboliques saines (e.g. profil insulinémique, lipidique et inflammatoire) malgré la présence excessive de masse grasse. Les interventions visant la perte de masse grasse semblent avoir des effets différents chez ces deux sous-types d'obèses. Effectivement, une diminution de la sensibilité à l'insuline a été observée chez les obèses MHO suite à une restriction calorique de 6 mois contrairement à l'amélioration observée chez les obèses à risque. Ainsi, il est primordial d'identifier une intervention qui permettra une amélioration de la composition corporelle chez les obèses MHO tout en conservant leur profil métabolique favorable. Il a été montré que l'entraînement en résistance permettait d'améliorer la composition corporelle, le contrôle de la glycémie, la masse grasse abdominale et la tension artérielle. Objectif : Ainsi, l'objectif de cette étude était de : 1) Comparer l'effet d'un entraînement en résistance de 16 semaines sur la masse grasse chez des femmes post-ménopausées obèses à risque et MHO. 2) Vérifier et comparer si ce type d'intervention à un effet sur les composantes du profil métabolique (tour de taille, glycémie, tension artérielle, triglycérides, HDL) chez des femmes post-ménopausées obèses à risque et MHO. Méthodes : Trente-six femmes post-ménopausées, obèses, sédentaires ont été recrutées. Les MHO ont été identifiés selon les critères du syndrome métabolique définis par la Fédération International de Diabète (circonférence de taille > 88 cm et 2 des 4 facteurs suivants : triglycérides > 1,7 mmol/L; HDL < 1,3 mmol/L; tension artérielle systolique > 130 mmHg ou diastolique > 85 mmHg ; glycémie à jeun > 5,6 mmol/L). À partir de cette méthode, les participantes ayant le syndrome métabolique ont été classées dans la catégorie des obèses à risque, les autres ont été classées dans la catégorie des obèses MHO. Le profil métabolique (tension artérielle, glycémie à jeun, insuline à jeun, triglycérides et cholestérol total), la composition corporelle (tour de taille, masse grasse et masse maigre) et la force musculaire (test de 1 répétition maximale (RM) au développé des jambes et développé des bras) ont été mesurés avant et après intervention. Les participantes ont suivi un programme d'entraînement en résistance supervisé d'une durée de 16 semaines (1h/3x/semaine). Résultats : Suite à l'intervention, une diminution significative de la masse grasse totale (%) ainsi qu'une augmentation significative de la masse maigre totale (kg), du 1RM au développé des jambes et du 1RM au développé des bras ont été observées chez les deux groupes. Finalement, aucune différence significative n'a été observée pour les composantes métaboliques. Conclusion : Un entraînement en résistance d'une durée de quatre mois entraine une diminution de la masse grasse totale (%), une augmentation de la masse musculaire totale (kg) et une augmentation de la force sans avoir d'effets sur les composantes métaboliques (tension artérielle, glucose à jeun, insuline à jeun, ApoB, triglycérides, cholestérol total, HDL-cholestérol, LDL-cholestérol et CRP) autant chez les femmes post-ménopausées obèses à risque que chez celles MHO. Ainsi, l'entraînement en résistance est donc à recommander chez la femme post-ménopausée obèse à risque et MHO. ______________________________________________________________________________

La température a un effet prononcé sur les réactions physiologiques. Le métabolisme mitochondrial, qui permet de produire de l'énergie en présence d'oxygène (mode aérobie) ne fait pas exception à cette règle. Le muscle cardiaque est hautement dépendant de la production d'énergie générée par les mitochondries pour accomplir ses fonctions de pompage du sang. Bien qu'en général les mammifères régulent leur température corporelle autour de 37 °C, des variations thermiques peuvent se produire en période d'hibernation ou dans certaines situations cliniques (hypothermie induite pour la préservation d'un organe en vue d'une transplantation ou pour la protection du coeur durant la chirurgie ou hyperthermie lors d'un épisode de fièvre). Pour comprendre les effets de la température sur le métabolisme mitochondrial, les organismes ectothermes (qui ne régulent pas leur température corporelle) constituent un matériel biologique privilégié. Lorsqu'ils font face à une chute de température corporelle, ces espèces modifient la composition de leurs membranes cellulaires et mitochondriales. Une augmentation de la proportion des acides gras possédant des liens insaturés leur permet de conserver la fluidité membranaire, malgré l'effet rigidifiant d'une baisse de température. Les processus enzymatiques assurant la production d'énergie aérobie sont en bonne partie de protéines imbriquées dans la membrane mitochondriale interne, et donc possiblement affectés par la fluidité de cette membrane. L'objectif du Chapitre 1 était de déterminer l'impact d'un changement de composition membranaire sur les fonctions physiologiques ainsi que sur leur thermosensibilité dans les mitochondries de coeur de rat. Des variations dans la composition des membranes mitochondriales ont pu être induites par une modification du type d' huile (riche en gras saturés, monoinsaturés ou polyinsaturés) et du contenu en antioxydant (probucol) dans l'alimentation. Les différences de composition en acides gras des membranes mitochondriales cardiaques n'ont cependant pas engendré de différences au niveau de la respiration mitochondriale ou de sa thermosensibilité. Les résultats du Chapitre I ne supportent pas l'hypothèse d'un rôle primordial de la composition en acides gras des membranes sur les fonctions des protéines qui y baignent. La respiration mitochondriale est un processus complexe qui implique différentes réactions reliées entre elles. Ces réactions sont toutes influencées par la température mais pas nécessairement de la même façon. Dans le Chapitre II, nous avons décortiqué la respiration mitochondriale pour quantifier et comparer les effets de la température sur ces différentes étapes. Le but visé était d'identifier les sites pour lesquels la température peut causer une pression sélective particulièrement forte. Pour répondre à cette importante question, nous avons proposé une approche comparative en étudiant une espèce de poisson adaptée à des températures basses (le loup Atlantique, Anarhichas lupus) et une espèce qui conserve une température corporelle constante (le rat). La comparaison de la thermosensibilité de la respiration mitochondriale et de différentes étapes impliquées dans ce processus (Complexes l, II, III et IV du système de transport des électrons, ATPase, citrate synthase et pyruvate déshydrogénase) chez ces deux espèces a permis de démontrer clairement qu'une étape particulière, la pyruvate déshydrogénase, est parfaitement corrélée à la sensibilité thermique de la respiration mitochondriale. Cette enzyme n'étant pas située dans la membrane, les résultats corroborent ceux obtenus dans le Chapitre I et laissent supposer un contrôle de la respiration mitochondriale par des étapes situées avant l'entrée des électrons du système de transport des électrons. L'acquisition de nouvelles connaissances concernant les effets de la température et de différents substrats énergétiques sur le métabolisme mitochondrial chez les mammifères est aussi d'une grande importance dans la détection des maladies mitochondriales. La plupart des études qui tentent de détecter des anomalies du système respiratoire dans les mitochondries isolées ou les fibres cardiaques perméabilisées de mammifères effectuent des mesures entre 20 et 30 °C, mais rarement à la température physiologique (37 °C). Ces études utilisent des substrats énergétiques qui sont loin des conditions physiologiques rencontrées par les mitochondries dans leur environnement cellulaire. De plus, un problème survient régulièrement pour mettre en relation une mutation génétique affectant l'ADN mitochondrial et la détection d'une baisse de production d'énergie au niveau des mitochondries. Le manque de corrélation entre les analyses génétiques et la performance physiologique semble lié à l'excès apparent de certaines composantes des voies mitochondriales. C'est le cas du Complexe IV du système de transport des électrons. Lorsqu'une maladie survient et qu'elle supprime une partie de l'activité de ce complexe, la mesure de l'excès d'activité disponible permet d'évaluer précisément les implications potentielles de cette anomalie sur la production d'énergie. L'objectif du Chapitre III était de mieux comprendre les effets de la température et de différents substrats énergétiques sur la détermination d'une anomalie mitochondriale. Contrairement aux deux chapitres précédents qui ont travaillé avec des mitochondries isolées, dans ce troisième chapitre, nous avons utilisé des fibres cardiaques perméabilisées. Cette technique combinée à l'utilisation d'un appareil de mesure permettant une meilleure résolution, a rendu possible les mesures à 5 températures sur un tissu aussi petit que le ventricule gauche de souris. Les possibilités qui s'ouvrent grâce à l'utilisation de cette espèce sont grandes puisqu'il existe de nombreux modèles de souris génétiquement modifiées qui facilitent l'étude des anomalies reliées aux mitochondries. Les résultats démontrent clairement l'importance de travailler à la température physiologique et d'utiliser des combinaisons de substrats respectant le fonctionnement du système de transport des électrons. Ce projet fournit une importante base conceptuelle pour des analyses futures des fonctions mitochondriales, et ce autant dans un contexte biomédical que dans l'optique de comprendre l'évolution d'espèces dans différents habitats thermiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cœur, Rat, Souris, Poisson, Composition membranaire, Sensibilité thermique, Système de transport des électrons, Respiration mitochondriale, Phosphorylation oxydative, Pyruvate déshydrogénase, Complexes mitochondriaux, Contrôle de la respiration mitochondriale.

Plusieurs domaines de recherche, tels que la toxicologie, la pharmacologie, la recherche et développement de nouveaux médicaments et la médecine, exige l'utilisation d'une grande quantité d'hépatocytes. Les hépatocytes de rats sont un modèle physiologique important pour étudier in vitro les composés au niveau de leur hépatotoxicité, l'induction des enzymes du métabolisme telles que les isoformes du cytochrome P450 et leurs interactions médicamenteuses, ainsi que pour établir la pertinence du modèle par rapport à l'homme. La cryoconservation permet de préserver une grande quantité d'hépatocytes fonctionnels. Cependant, les hépatocytes sont des cellules extrêmement sensibles aux dommages induits par le gel et le dégel, même après l'addition des cryoprotectants classiques tel que le DMSO. La cryoconservation réduit la viabilité et certaines fonctions hépatospécifiques. Le changement le plus prononcé est la diminution de leur efficacité d'attachement. L'adhésion des cellules à la matrice extracellulaire et les contacts cellules-cellules sont cruciaux pour plusieurs fonctions cellulaires. Ces processus sont en partie régulés par les molécules d'adhésion cellulaire. Les mécanismes responsables de la réduction de l'efficacité d'attachement des hépatocytes cryoconservés ne sont pas bien élucidés. Ainsi, l'amélioration des techniques de cryoconservation est nécessaire afin d'améliorer les fonctions et de réduire les dommages cellulaires. Dans cette thèse, nous décrivons une nouvelle méthode efficace pour la cryoconservation de cellules de mammifères basée sur l'utilisation d'un extrait de protéines de blé (WPE) ou d'un extrait partiellement purifié avec le sulfate d'ammonium ou l'acétone (SuIWPE ou AcWPE) ou de protéines recombinantes associées à la tolérance au gel chez le blé. Ces méthodes permettent l'entreposage à long terme et la récupération d'une grande quantité de cellules viables et dont les fonctions sont maintenues. Pour tester l'efficacité de cette nouvelle méthode, nous avons mesuré plusieurs paramètres, tels que la viabilité immédiatement après dégel, la viabilité en culture, l'efficacité d'adhésion et l'évaluation des fonctions hépatospécifiques (sécrétion d'albumine, biotransformation de l'ammonium en urée, activité basale et inductibilité du cytochrome P450). En culture, la morphologie des hépatocytes cryoconservés avec l'extrait de protéines de blé (WPE), l'extrait partiellement purifié (SuIWPE ou AcWPE) et les protéines recombinantes associées à la tolérance au gel chez le blé (WCS120, WSC19, WCOR410, TaTIL et TaIRl-2), est semblable à celle des cellules fraîches. De plus, la stabilité des trois principales molécules d'adhésion, soit l'intégrine β1, la E-cadhérine et la β-caténine fut étudiée. L'expression des molécules d'adhésion est généralement inférieure chez les hépatocytes cryoconservés avec le diméthylsulfoxyde (DMSO), comparativement au WPE. L'intégrine β1 et la β-caténine sont les plus touchées par la cryoconservation. Les molécules d'adhésion sont préservées chez les hépatocytes cryoconservés avec les SuIWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes; l'expression étant faiblement diminuée comparativement aux hépatocytes frais. Par le fait même, l'adhérence cellulaire des cellules cryopréservées avec les SuIWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes est supérieure (70%) à celle des cellules cryopréservées avec le WPE ou le DMSO (50%). Les fonctions hépatospécifiques telles que la sécrétion d'albumine et la biotransformation de l'ammonium en urée sont maintenues durant 4 jours de culture, pour les cellules cryoconservées aves les WPEs. Nous avons également déterminé que les WPE, SuIWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes peuvent améliorer les activités des principaux isoformes du cytochrome P450, chez les hépatocytes en suspension et en culture après cryoconservation. Ceci a été réalisé en comparant les activités basales et inductibles des isoformes CYP1A1/2, 2C6, 2D2 et 3A1/2 dans les hépatocytes de rat cryoconservés avec les WPE, SulWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes comparativement aux cellules fraîches et les cellules cryoconservées au DMSO. Nous démontrons d'une manière concluante que les hépatocytes de rat cryoconservés avec les WPE, SuIWPE, AcWPE ou les protéines recombinantes maintiennent le même niveau de compétence métabolique et de capacité à répondre aux inducteurs classiques du CYP, que les hépatocytes fraîchement isolés. Ces résultats démontrent clairement que le WPE, et plus particulièrement, les SuIWPE, AcWPE et les protéines recombinantes, sont plus efficaces que la technique classique de cryoconservation au DMSO pour les hépatocytes de rat, tant pour le maintien de l'expression des molécules d'adhésion que pour leurs fonctions hépatospécifiques. Les extraits WPE, SuIWPE, AcWPE et protéines recombinantes contiennent des agents cryoprotecteurs potentiellement universels pour les cellules de mammifères, tout en étant économiques et non-toxiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Foie, Hépatocytes, Cryoconservation, Protéines de blé, Viabilité, Activité métabolique, Cyrochrome p450, Molécules d'adhésion.

Le cholestérol est souvent perçu comme néfaste à la santé mais c'est un constituant essentiel pour l'élaboration de la membrane cellulaire, la synthèse de certaines hormones stéroïdiennes et des acides biliaires. Vu l'augmentation fulminante de maladies cardiovasculaires reliées à un excès de cholestérol dans la circulation sanguine qui se traduit par un dépôt au niveau de la paroi de l'artère, il est nécessaire de pousser les connaissances sur le métabolisme du cholestérol. Sachant que le cholestérol est transporté dans le système circulatoire par le biais de lipoprotéines et que les apolipoprotéines de ces dernières interagissent avec les récepteurs cellulaires, il est primordial de mettre en évidence ces voies impliquées dans la captation des lipoprotéines. Il existe plusieurs classes de récepteurs de lipoprotéines à la surface cellulaire dont l'une mène à l'internalisation et une dégradation complète de la particule. L'exemple le plus connu de cette classe est le récepteur de LDL (rLDL). L'autre classe peut capter sélectivement les esters de cholestérol (EC) des lipoprotéines de faible densité (LDL) ou lipoprotéines de haute densité (HDL), sans toutefois entraîner une captation et dégradation parallèle de leurs apolipoprotéines. Les deux récepteurs impliqués dans la captation sélective des EC sont le "cluster of differentiation" (CD36) et le récepteur "scavenger" de type B, classe l (SR-BI). Ces récepteurs se retrouvent dans le foie mais au moment où ces études doctorales ont été amorcées ils avaient été caractérisés surtout dans les cellules extrahépatiques et colocalisés dans les cavéoles, des invaginations membranaires absentes du foie. Notre première étude a permis de démontrer que, dans les cellules hépatiques de souris, la captation sélective des EC peut se faire autant par les cellules parenchymateuses que non parenchymateuses. Cependant, seulement les cellules parenchymateuses peuvent soutirer les EC à partir des trois classes, soient les HDL, LDL et LDL oxydées (LDLox) tandis que les cellules non parenchymateuses le font qu'à partir des LDL et LDLox. De plus, les cellules parenchymateuses expriment plus de rLDL, SR-BI et CD36 que les cellules non parenchymateuses. Cependant, la cavéoline-I est détectable seulement dans les cellules non parenchymateuses. En second lieu, nous avons voulu définir l'implication de la cavéoline-I exprimée dans la cellule HepG2 normale (un hépatome humain) au niveau du métabolisme des LDL et HDL. Pour ce faire, l'ADN complémentaire (ADNc) de la cavéoline a été inséré en orientation sens dans le vecteur d'expression eucaryote (pRc/CMV) puis transfecté dans des cellules HepG2. L'expression de la cavéoline-I génère une augmentation de la captation de l'albumine et de l'efflux de cholestérol suggérant la formation de cavéoles. Les cellules HepG2 exprimant la cavéoline-I révèlent une augmentation de 108% de la dégradation des LDL, une augmentation de 55% de la captation sélective des EC à partir des HDL mais une diminution de 66% pour celle des LDL. De plus, notre étude démontre qu'il y a une plus de colocalisation entre la cavéoline-l et le CD36 ou le rLDL qu'entre la cavéoline-l et le SR-BI. Par contre, la présence de la cavéoline-I augmente la forme dimérique du SR-BI. Ainsi, l'expression de la cavéoline-l dans les cellules HepG2 favorise la captation sélective des EC à partir des HDL ainsi que la dégradation des LDL tandis que dans les cellules normales HepG2, la voie de captation sélective des EC des LDL est favorisée. En troisième lieu, comme le foie génère une quantité substantielle de cholestérol, nous avons étudié l'efflux de cholestérol sur de multiples lignées de cellules HepG2 ainsi que les cellules hépatiques de foie de souris. Nos études démontrent que la surexpression de SR-BI, de CD36 et de la cavéoline-I dans les cellules HepG2 génère une augmentation de l'efflux de cholestérol de 106%, 92% et 48% respectivement. De plus, une double surexpression de SRBI et de la cavéoline-l ou de CD36 et de la cavéoline-l induit une hausse plus importante de l'efflux de cholestérol. Les expériences réalisées avec les cellules hépatiques de souris en culture primaire ont révélé une diminution de 41 % et 56% de l'efflux de cholestérol pour les cellules de souris déficientes en SR-Bl ou doublement déficientes en SR-BI et CD36 respectivement. Cependant, aucune différence significative n'a été observée pour les souris déficientes en CD36. Ainsi, les résultats suggèrent que le SR-BI est impliqué autant dans l'efflux de cholestérol chez les cellules hépatiques de souris que chez l'humain tandis que CD36 ne l'est que chez l'humain. Nos derniers travaux visaient à élucider l'importance de la cavéoline-L dans le métabolisme des LDLox. Nos résultats révèlent que la cavéoline-I a le potentiel d'augmenter autant la liaison que la dégradation des LDL légèrement (LDLlox) que fortement oxydées (LDLfox). Par contre, la présence de la cavéoline-I affecte seulement la captation sélective des EC en diminuant de 50% celle des LDLlox et pas celle des LDLfox. Cette étude démontre aussi une augmentation de 27% de l'efflux de cholestérol à partir de LDLlox mais une diminution de 22% à partir des LDLfox. Enfin, l'expression de la cavéoline-l stabilise les niveaux de SR-BI et de rLDL lorsque les cellules HepG2 sont traitées avec les LDLox (lox et fox) mais n'a pas d'impact sur le niveau de CD36. Ces résultats suggèrent que l'importance physiologique de l'expression de la cavéoline-l hépatique est dans le rôle de l'épuration (dégradation) de ces particules athérogènes. En conclusion, l'ensemble des travaux rapportés dans cette thèse supporte que l'expression de la cavéoline-I au niveau hépatique grâce à une modulation biotechnologique aurait un rôle clé dans l'homéostasie du cholestérol hépatique, puisqu'elle affecte à la hausse l'efflux de cholestérol et module la captation sélective à partir des LDL, HDL et LDL oxydées. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Foie, Lipoprotéines, Cavéoline, Récepteurs, Oxydation.

L’exposition foetale à l’hyperglycémie maternelle (HGM), ainsi qu’un poids à la naissance aux deux extrémités du spectre (petit ou grand poids en fonction de l’âge gestationnel) sont deux conditions associées à un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires et/ou métaboliques, tels l’obésité ou le diabète de type II, plus tard dans la vie. Le système IGF {Insulin-like growth factor) est un important régulateur du métabolisme et de la croissance foeto-placentaire. Une perturbation moléculaire précoce du système IGF pourrait donc être impliquée dans la programmation métabolique foetale. Les objectifs de cette étude étaient donc d’évaluer l’impact d’une exposition foetale à l’HGM sur le profil de méthylation de l’ADN et d’ARNm des gènes IGF1R {Insulin-like growth factor 1 receptor), IGFBP3 {Insulin-like growth factor binding protein 3), IGFI {Insulin-like growth factor 1) et INSR {Insulin receptor) dans le placenta, puis d’évaluer les possibles associations entre le profil épigénétique des gènes de ce système et les indices de développement foeto-placentaire. L’HGM (incluant l’intolérance au glucose et le DGM) a été diagnostiquée selon les critères de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS; HGM: n=34; normo-glycémie matemelle (NGM): n=106). Une hypométhylation de l’ADN des gènes IGF1R et IGFBP3 a été démontrée dans les placentas exposés à l’HGM comparé à ceux exposés à la NGM (respectivement -4,3%; p=0,02 et -2,5%; p= 0,01). Les niveaux de méthylation de l’ADN d’IGFIR et d'1GFBP3 étaient aussi corrélés négativement à la glycémie 2h post-HGOP (respectivement r=-0,23; p= 0,01 et r=-0,20; p= 0,03). Le poids du nouveau-né à la naissance était associé au niveau d’ARNm d’IGFIR dans le placenta (r=0,20; p=0,03). Ces résultats supportent la fonction régulatrice de croissance du système IGF au cours du développement foeto-placentaire et suggèrent une dérégulation du profil de méthylation de l’ADN des gènes IGF1R et d'IGFBP3 dans les placentas exposés à l'HGM. Cette étude suggère également un effet compensatoire du système IGF placentaire pouvant contribuer à limiter les effets promoteurs de croissance liés à l’hyperinsulinémie foetale associé à l’HGM. Les gènes IGF1R et IGFBP3 pourraient être impliqués dans la programmation foetale des maladies métaboliques chroniques.

Le métabolisme glucidique de l’oiseau est important pour maitriser la croissance de l’animal et la qualité de la viande. Nous avons étudié l’utilisation périphérique du glucose chez le poulet au niveau musculaire en identifiant et en caractérisant les principaux acteurs impliqués. Nous avons identifié et caractérisé un nouveau transporteur de glucose chez les oiseaux, GLUT12. Il est exprimé dans les muscles, son expression est régulée in vivo par l’insuline et il peut être enrichi dans les membranes plasmiques des cellules suite à une stimulation insulinique. In vitro, une augmentation du transport de glucose est mesurée sur le même pas de temps que la translocation de GLUT12. Comme pour GLUT4 chez les mammifères, la PI3K est impliquée dans la translocation de GLUT12. L’expression des GLUTs musculaires varie avec l’âge des animaux mais aussi avec leur état physiologique, le type métabolique et/ou la fonction du muscle. L’ensemble de nos résultats explique en partie le métabolisme glucidique atypique des oiseaux et laisse entrevoir le développement de nouvelles stratégies d’élevage pour répondre à une demande croissante de produits avicoles de qualité. / Glucose metabolism in birds is important to control animal growth and meat quality. We studied peripheral glucose utilization in chicken muscle by identifying and characterizing a new glucose transporter in birds, GLUT12. This transporter is expressed in muscles, its expression is regulated in vivo by insulin and it can be enriched in cells plasma membranes following insulin stimulation. In vitro an increase of glucose transport is measured in the same time than GLUT12 translocation. As for GLUT4 in mammals, PI3K pathway is involved in GLUT12 translocation. Expression of muscular GLUTs varies depending on animals’ age but also depending on their physiological state and on the metabolic type and/or function on the muscle. All of our results partly explain the atypical glucose metabolism in birds and let us foresee development of new farming strategies in order to answer to increased demand of avian quality products.

Les Glioblastomes (GBM) sont des tumeurs cérébrales de trés sombre pronostic malgré leur traitement associant résection chirurgicale et chimio/radiothérapie. Ils contiennent notamment une sous-population de cellules souches/initiatrices de GBM (GIC) impliquée dans la radio/chimiorésistance et la récidive de ces tumeurs en étant capable de générer la majorité des cellules tumorales plus différenciées. Des études ont montré que les cellules tumorales pourraient avoir la capacité de se dédifférencier et d'acquérir un phénotype plus proche des GIC en réponse à des stress. Notre hypothèse est qu'une telle plasticité pourrait avoir lieu en réponse aux radiations ionisantes (RI) et participer à la récidive rapide de ces tumeurs après thérapie. En effet, j'ai montré que l'exposition de cultures primaires de cellules de GBM établies à partir de résection de patients à une dose infra-toxique et cliniquement relevante de RI potentialise à long terme la réacquisition de caractéristiques associées au phénotype des GIC (auto-renouvellement, expression de marqueurs souches et tumorigénicité). J'ai identifié au cours de ce processus (1) une surexpression de la protéine anti-apoptotique Survivine; dont l'inhibition pharmacologique bloque la plasticité radio-induite, (2) une reprogrammation métabolique précoce et (3) une enzyme impliquée dans l'acidification du pH extracellulaire, qui semble favoriser le processus de dédifférenciation radio-induite. A terme, le ciblage des mécanismes impliqués dans de ce processus adaptif aux RI pourrait contribuer à développer des stratégies thérapeutiques innovantes pour radiosensibiliser ces tumeurs. / Glioblastomas (GBM) are some highly lethal brain tumors despite a treatment associating surgical resection and radio-chemotherapy. Amongst these tumors, a subpopulation of radio/chemoresistant GBM stem-like/initiating cells (GIC) appears to be involved in the systematic GBM recurrence through the generation of more differenciated tumoral cells. Recent studies showed that tumor cells may have the ability to dedifferentiate and acquire a GIC phenotype in response to microenvironment stresses. We hypothesized that GBM cells could be subjected to a similar dedifferentiation process after ionizing radiations (IR), then supporting the GBM rapid recurrence after radiotherapy. Indeed, I showed that the exposure of several primo-cultures of differentiated GBM cells isolated from patient resections to a subtoxic and clinically relevant IR dose potentiated the long-term reacquisition of GIC properties (self-renewal ability, expression of stemness markers and tumorigenicity). I also identified during this process (1) an up-regulation of the anti-apoptotic protein Survivin whose pharmacological down-regulation led to a blockade of the IR-induced plasticity, (2) the presence of a metabolic shift occurring quickly after IR and (3) an enzymatic target, which appears to be involved in extracellular acidification under IR and could also potentiate the long term dedifferentiation induced by IR. At term, targeting the mechanisms associated with IR-induced plasticity in order to inhibit the IR-induced adaptive processes will likely contribute to develop some innovating pharmacological strategies for an improved radio-sensitization of these brain tumors.

La mise au point et la validation d’une méthode de dosage par CLHP des alcaloïdes majoritaires (cépharanthine,xylopinine, tétrahydropalmatine) de Stephania rotunda sont réalisées. La méthode est appliquée au dosage des alcaloïdesdans différentes parties de la plante. Le tubercule est la drogue végétale la plus riche en alcaloïdes majoritaires, enparticulier en cépharanthine (1%). Le dosage des alcaloïdes majoritaires des tubercules d’origine différente est effectué.La cépharanthine est beaucoup plus concentrée dans le tubercule de Pailin (1,9%). La comparaison de la compositionchimique du tubercule cultivé et sauvage montre des résultats proches. L’isolement de huit alcaloïdes est effectué parChromatographie Flash. Leur structure est déterminée par SM et RMN. La cépharanthine, la xylopinine, latétrahydropalmatine, la palmatine et la roémérine précédemment décrites sont réisolées. La pseudopalmatine, lastéphanine et la vireakine, alcaloïde nouveau, sont décrites pour la première fois dans la plante. L’étude pharmacologiquede S. rotunda montre que la majorité des extraits testés (76%) présentent in vitro une activité antiplasmodiale intéressantesur la souche W2 de Plasmodium falciparum avec une CI50 < 5 μg/ml. La cépharanthine et la pseudopalmatine sont lesalcaloïdes les plus actifs avec une CI50 de 0,7 et 1 μg/ml, respectivement. Les effets sur la croissance in vitro de la soucheW2, des associations alcaloïdes/alcaloïdes et alcaloïdes/molécules antimalariques de référence sont testés. L’étude in vitrodu métabolisme hépatique de la cépharanthine montre la présence d’un métabolite principal M1 cytochrome dépendant.Une importante variabilité inter-individuelle de la formation de M1 est observée. L’étude de la variabilité inter-sexemontre qu’il n’y a pas de différence significative entre homme et femme. Les études in vitro de différentes espècesanimales indiquent une variabilité inter-espèces. L’enzyme responsable de la formation du métabolite M1 est déterminée.Le CYP3A4 est très fortement impliqué dans la métabolisation de la cépharanthine. Enfin, la détermination structurale dumétabolite majoritaire M1 a été réalisée par CDI-SM/SM. Cette étude nous a permis de conclure que la structure dumétabolite M1 correspond à un composé N-déméthylé. / An HPLC method is developed and validated for the simultaneous determination of major alkaloids: cepharanthine,xylopinine, tetrahydropalmatine in tuber of Stephania rotunda Lour. The validated method was successfully applied toquantify the three alkaloids in various parts of the plant. The higher content of major alkaloids, in particularcepharanthine (1%), is found in the tuber of this plant. The major alkaloids of tubers from different regions aredetermined. The cepharanthine is concentrated in tuber of Pailin (1.9%). The comparison of the chemical composition ofcultivated and wild tubers shows similar results. Eight alkaloids were isolated from S. rotunda using FlashChromatography. Their structures are elucidated by MS and NMR. Cepharanthine, xylopinine, tetrahydropalmatine,palmatine and roemerine previously described are reisolated. Pseudopalmatine, stephanine, and vireakine (newaporphine alkaloid) are described for the first time in the plant. Pharmacological study of S. rotunda shows that themajority of extracts (76%) exert in vitro antiplasmodial activity against a chloroquine resistant strain of Plasmodiumfalciparum (W2) with IC50 < 5 μg/ml. Cepharanthine and pseudopalmatine display significative activity with IC50 valuesof 0.7 and 1 μg/ml, respectively. Isobol experiments are performed with W2 strain by combination of alkaloids/alkaloidsand alkaloids/antimalarial reference molecules. In vitro metabolism study of cepharanthine using human liver microsomesshows the cytochrome-dependant formation of a major metabolite M1. Enzymatic kinetics were investigated with pooledhuman liver microsomes to determine Michaelis-Menten constants. Important inter-individual variability of cepharanthinemetabolism is observed. In vitro studies indicate an important inter-species variability. The enzyme responsible for theformation of M1 metabolite is investigated. This study shows that CYP3A4 is involved in the metabolism of thecepharanthine. The structure of M1 metabolite, identified by CDI-MS/MS, corresponds to a N-desmethyle derivative ofcepharanthine.