Obwohl der Ca2+ permeable Ionenkanal TRPV2 in zahlreichen Immunzellen exprimiert wird, ist wenig über seine physiologische Funktion bekannt. Bisherige Studien verließen sich größtenteils auf die Anwendung von unspezifischen Modulatoren, TRPV2-defizienten Mäusen oder siRNA-vermittelten TRPV2-knockdown. Weder zelluläre Kompensationsmechanismen noch unspezifische Effekte können dabei ausgeschlossen werden. Daher haben wir eine etwa 5.500 Substanzen umfassende Substanzbibliothek auf niedermolekulare Modulatoren mit einer TRPV2-Aktivität untersucht. Mittels Fluoreszenz-basiertem Mediumdurchsatz-Screening und HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV2-Ionenkanäle exprimieren (HEKrTRPV2), konnten 3 strukturchemisch verwandte neuartige Inhibitoren ermittelt werden (IV2-1, IV2-2, IV2-3). Selektivitätsuntersuchen mit HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV1, Ratten-TRPV2, Maus TRPV3, Maus-TRPV4 oder Maus-TRPM3 exprimieren, zeigten, dass alle drei Substanzen eine TRPV2-Selektivität aufwiesen. Aufgrund des besseren IC50-Wertes wurde IV2-1 (IC50 = 6,3 ± 0.7 µM) als Leitstruktur ausgewählt und für weitere Untersuchungen verwendet. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Assays von HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen, welche TRPV2 endogen exprimieren, blockierte IV2-1 durch 2 APB oder 2 APB/Probenecid induzierte TRPV2-vermittelte Ca2+-Einströme. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen konnten 2-APB-verursachte Ein- und Auswärtsströme des TRPV2-Kanals in HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen durch IV2-1 reversibel blockiert werden. MTT Assays zur Ermittlung zytotoxischer Effekte von IV2-1 auf HEK293-, HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen ergaben keine Minderung der Zellviabilität bis zu einer Konzentration von 50 µM. Somit konnte IV2 1 als neuer, nicht toxischer TRPV2-Inhibitor validiert werden. In Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.B. Makrophagen könnten TRPV2-vermittelte Ca2+-Signale wichtige Mechanismen wie Phagozytose und Migration beeinflussen. Um den physiologischen Einfluss von TRPV2 in primären Makrophagen zu untersuchen, wurden aus Stammzellen des Knochenmarks von Mäusen primäre Makrophagen (BMDM) differenziert. Als Bestätigung der funktionellen Expression von TRPV2-Kanälen in BMDM konnten in Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen mittels 2-APB Ca2+-Einströme ermittelt werden, welche durch Zugabe von IV2 1 blockiert wurden. Weiterhin wurde ein siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 in BMDM etabliert. Mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) konnte sowohl die Expression von TRPV2-mRNA als auch der knockdown um etwa 70 Prozent in BMDM beobachtet werden. Die Kombination 2 APB/Probenecid induzierte auch in moderaten Konzentrationen einen TRPV2-vermittelten Ca2+Einstrom in BMDM, ohne zytotoxische Effekte zu verursachen. Als nächstes sollte in BMDM der Einfluss der TRPV2-Aktivität auf die Phagozytose von Zymosan- und Staphylococcus aureus-Biopartikeln untersucht werden, welche mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzindikator gekoppelt waren. Sowohl siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 als auch TRPV2-Inhibition durch IV2-1 oder Valdecoxib reduzierten die Phagozytoseaktivität der BMDM auf etwa 70 Prozent im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Diese Ergebnisse bestätigen eine Beteiligung von TRPV2 bei der Phagozytose. Anschließend wurden Transwell-Migrationsassays von BMDM in einem Gradienten aus Lipopolysacchariden (LPS) durchgeführt. Während die TRPV2-Inhibiton mit IV2 1, Valdecoxib oder ein TRPV2-knockdown die LPS-induzierte Migration von BMDM signifikant verringerte, steigerte die TRPV2-Aktivierung durch 2-APB/Probenecid die Anzahl migrierter BMDM im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen signifikant. Somit konnte ebenso eine TRPV2-Beteiligung bei der Migration von Makrophagen gezeigt werden. Da Phagozytose und Migration zielgerichtete Prozesse darstellen, sollten auch die Ca2+-Signale räumlich und zeitlich koordiniert auftreten. Solche lokal begrenzten, kurzen Ca2+-Fluktuationen können durch Ca2+-Mikrodomänen verursacht werden, welche der Aktivität einzelner oder weniger Kanäle entsprechen. Mittels TIRF-Mikroskopie und eines niederaffinen Ca2+-Indikators können hohe Ca2+-Fluktuationen in unmittelbarer Nähe zur Zellmembran selektiv detektiert und somit potenzielle durch TRPV2 generierte Ca2+ Mikrodomänen in Makrophagen untersucht werden. Nach der TRPV2-Aktivierung mit 2 APB/Probenecid konnten punktuelle, hohe Ca2+ Fluktuationen in BMDM ermittelt werden, welche nach Zugabe von IV2-1 inhibiert wurden. Unter physiologischeren Bedingungen wurden zudem basal aktive Ca2+ Mikrodomänen beobachtet, welche durch IV2 1 inhibiert wurden. Dementsprechend scheint TRPV2 in BMDM basal aktive Ca2+-Mikrodomänen ausbilden zu können. Bisher konnte nur die Kombination aus 2-APB und Probenecid in moderaten Konzentrationen genutzt werden, um TRPV2-Ionenkanäle ohne zytotoxische Effekte durch hohe Konzentrationen der Einzelsubstanzen zu aktivieren. Allerdings zeigt 2-APB keine Wirkung auf humane TRPV2 Kanäle, weshalb neue Möglichkeiten der TRPV2-Aktivierung essentiell sind. Um weitere potenzierende Effekte zu untersuchen, wurde Cannabidiol (CBD) als potentester TRPV2-Aktivator aus der Gruppe der Cannabinoide in Kombination mit Probenecid untersucht. In einer zweidimensionalen Analyse von CBD- und Probenecid-Verdünnungsreihen konnte eine potenzierende Wirkung der Kombination festgestellt werden, die sowohl humane als auch Ratten TRPV2-Kanäle superadditiv aktivierte. Mittels Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen sowie elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen von HEKrTRPV2- und HEKhuTRPV2-Zellen konnte dieser superadditive Effekt von CBD/Probenecid bestätigt werden. Die CBD/Probenecid-induzierte Aktivität humaner oder Ratten TRPV2-Kanäle konnte durch IV2-1 inhibiert werden, wohingegen Valdecoxib zwar Ratten-TRPV2 blockierte, jedoch humanen TRPV2 nicht vollständig inhibieren konnte. Mastzellen sind maßgeblich an der Freisetzung von allergischen und inflammatorischen Mediatoren beteiligt und stellen somit einen wichtigen Bestandteil des angeboren Immunsystems dar. Während die Ausschüttung von Leukotrienen, β-Hexosaminidase oder Histamin größtenteils IgE-vermittelt stattfindet, können davon unabhängig auch andere Signalkaskaden, wie z.B. durch MRGPRX2-vermittelt, die Degranulation von Mastzellen induzieren. Da Mastzellen ebenfalls TRPV2-Ionenkanäle exprimieren, könnte ein TRPV2-vermittelter Ca2+ Einstrom die Freisetzung von Mediatoren beeinflussen. Mit Hilfe der neuen TRPV2-Modulatoren und Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen wurde zunächst die endogene TRPV2-Expression in basophilen RBL-2H3-Zellen als alternatives Zellmodell zu Mastzellen bestätigt. Zudem konnten keine zytotoxischen Effekte bis zu Konzentrationen von 50 µM IV2-1 oder Valdecoxib sowie einer Kombination aus 12.5 µM CBD und 500 µM Probenecid festgestellt werden. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen konnte nach physiologischer Stimulation der Fcε-Rezeptoren ein Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration gemessen werden, der durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib nicht blockiert wurde. In Untersuchungen zur Freisetzung von β-Hexosaminidase steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Mediatorausschüttung hingegen deutlich. Dieser Effekt konnte durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib inhibiert werden. Eine Kombination des TRPV2-vermittelten sowie des IgE-induzierten Stimulus führte zu einer additiv gesteigerten Freisetzung. Somit könnte TRPV2 unabhängig von der IgE-Signalkaskade eine wichtige physiologische Funktion bei der Degranulation von Mastzellen spielen. Daher wurden im nächsten Schritt primäre Mastzellen aus dem Knochenmark von Mäusen differenziert (BMMC) und die mRNA- sowie funktionelle Expression von TRPV2 durch qPCR und Fluoreszenz-basierte Ca2+-Assays bestätigt. Die verwendeten Modulatoren induzierten auch in BMMC in gleichen Konzentrationen wie in RBL 2H3-Zellen keine zytotoxischen Effekte. Die vorherigen Ergebnisse des Einflusses der TRPV2-Aktivität auf die Ausschüttung von β-Hexosaminidase konnten mit BMMC ebenso bestätigt werden. Mittels ELISA wurde zuletzt ein TRPV2-vermittelter Effekt auf die Histaminfreisetzung aus BMMC untersucht. Demnach steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Histaminausschüttung deutlich, was durch TRPV2-Inhibition mit IV2 1 blockiert werden konnte. Auch hier hatte IV2-1 keinen Effekt auf die IgE-induzierte Histaminfreisetzung. Die simultane Stimulation der Fcε-Rezeptoren und der TRPV2-Kanäle resultierte in einer additiv gesteigerten Histaminausschüttung. Folglich scheint TRPV2-Aktivität die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin oder β-Hexosaminidase unabhängig von der klassischen IgE-vermittelten Signalkaskade zu beeinflussen, was TRPV2 zu einer vielversprechenden Zielstruktur zur weiteren Erforschung im pathophysiologischen Kontext von entzündlichen und allergischen Reaktionen macht.

Die Anaphylaxie, eine potentiell lebensbedrohliche Reaktion, kann durch Kofaktoren beeinflusst werden. ACE-Inhibitoren, ß-Blocker und Acetylsalicylsäure (ASS) werden häufig in der Therapie von Herz-Kreislauferkrankungen eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob diese anaphylaktische Reaktionen begünstigen. Das Modell der passiv systemischen Anaphylaxie (PSA) wurde speziell angepasst, um die Behandlung einer Herz-Kreislauf-Therapie nachzubilden. Die orale Gabe von Metoprolol oder Ramipril verstärkte die Anaphylaxie geringfügig. Die Kombination der Medikamente steigerte die Anaphylaxie deutlich, was im Modell der passiv kutanen Anaphylaxie (PCA) bestätigt werden konnte. Gleichzeitig waren Mastzellmediatoren im Serum der Tiere erhöht. Die Inkubation muriner Mastzellen (MZ) mit den Medikamenten, steigerte die FcεRI-vermittelten Histaminfreisetzung in vitro. ASS-Vorbehandlung der Mäuse verstärkte die Ausprägung der PSA und der PCA, was mit einer Steigerung von MZ-Mediatoren im Serum assoziiert war. Die FcεRI-induzierte Histaminfreisetzung muriner MZ wurde hingegen nach ASS-Inkubation gehemmt, was auf einen indirekten Mechanismus hinweist. Die Reduktion der Prostaglandine (PG) durch ASS ist mit einer gesteigerten Leukotriensynthese verbunden. Der Leukotrienantagonist Montelukast konnte die, durch ASS verstärkte, PSA nicht mildern, was zeigt, dass dieser Effekt unabhängig von Leukotrienen ist. PGE2 kann die MZ-Degranulation über EP1-EP4-Rezeptoren modulieren. Tatsächlich schwächten EP3- und EP4-Rezeptoragonisten die durch ASS gesteigerte Anaphylaxie ab. PGE2 nimmt somit eine wichtige Rolle in der pro-anaphylaktischen Wirkung von ASS ein. Zusammenfassend wurde erstmals gezeigt, dass Metoprolol und Ramipril die Anaphylaxie über eine Steigerung der MZ-Reaktivität verstärken. ASS hingegen erhöht anaphylaktische Reaktionen über einen indirekt steigernden Effekt auf die MZ. PGE2 ist zumindest teilweise an der pro-anaphylaktischen Wirkung von ASS beteiligt. / Cofactors contribute to the severity of anaphylaxis, a potential life-threatening hypersensitivity reaction. ACE-inhibitors, ß-blockers and acetylsalicylic acid (asa) are frequently used drugs in cardiovascular therapy. Whether they affect systemic anaphylactic reactions has been addressed within this thesis. To this aim, the passive systemic anaphylaxis model (PSA) was employed here and specially designed to mimic a long term treatment in cardiovascular therapy. The data demonstrate that oral treatment of mice with ramipril or metoprolol alone slightly aggravated anaphylaxis. However, the combination clearly potentiated anaphylactic reactions, which was also confirmed in the passive cutaneous anaphylaxis model (PCA). In line with this, elevated amounts of mast cell (MC) mediators were detected in mice sera upon combined drug treatment. In vitro, FcεRI-mediated histamine release of murine MCs was likewise enhanced by the respective drugs. Pre-treatment of mice with asa aggravated the symptoms of PSA and PCA; simultaneously MC-mediators in sera were elevated. In contrast, FcεRI-mediated histamine release of MCs was reduced by asa in vitro, pointing to an indirect mechanism. Asa reduces prostaglandins (PGs) and increases leukotriene synthesis. The leukotriene antagonist montelukast failed to attenuate PSA, aggravated by asa, suggesting that the pro-anaphylactic effect of asa might be independent of leukotrienes. PGE2 can modulate MC degranulation via EP1-EP4 receptor. Indeed, EP3 and EP4 receptor agonists alleviated anaphylaxis enhanced by asa. Therefore PGE2 might play an important role in the pro-anaphylactic effect of asa. In conclusion, the data demonstrate for the first time that metoprolol and ramipril exacerbate anaphylactic symptoms by a direct increase in MC reactivity. In contrast, asa aggravates anaphylactic reactions by priming MCs through an indirect mechanism. PGE2 is at least partly involved in this process.

Helmintheninfektionen induzieren in ihren Wirten Typ 2 (Th2) Immunantworten, welche parasitäre Larvenstadien hemmen und/oder zur Abstoßung von intestinalen Würmern führen. Th2-Antworten können auch gegenüber Umweltallergenen ausgebildet werden und allergische Reaktionen vermitteln. Mastzellen (MZ) spielen eine herausragende Rolle für die Wirtsantwort gegen Parasiten. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Infektion von MZ-defizienten Mäusen mit Helminthen zu einer reduzierten Produktion von IL-25, IL-33 und TSLP, einer beeinträchtigten Etablierung von Th2 Immunantworten und einer erhöhten Wurmlast führt. Diese Parameter konnten allerdings nach einem erfolgreichen Transfer von Knochenmark aus Wildtypmäusen wiederhergestellt werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt somit eine wichtige Funktion von Mastzellen für die Initialisierung von Th2 Immunantworten. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ein Cystein-Protease-Inhibitor - AvCystatin sowohl Parameter von Atemwegsentzündung und -hyperreaktivität als auch Lieschgraspollen (Phl p 5b)-spezifische Immunantworten in einem klinisch relevanten Mausmodell für Atemwegsentzündung inhibiert. Gleichzeitig führte die Behandlung mit AvCystatin zu einem Anstieg von IL-10 und erhöhten Frequenzen von CD4+CD25+Foxp3+ T Zellen. Die in vivo Effekte von AvCystatin wurden unabhängig von der Protease-inhibitorischen Aktivität des Immunmodulators oder dessen Fähigkeit zur Oligomerisation vermittelt. AvCystatin unterdrückte zudem die Allergen-spezifische Produktion von IL-13 und induzierte in vitro unter Verwendung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut (PBMCs) von Graspollen allergischen Patienten einen IFN-gamma vermittelten Th1 shift. Zusammenfassend tragen die Ergebnisse der Arbeit zu einem besseren Verständnis für die frühen Ereignisse von Th2 Immunantworten bei und zeigen, dass Helminthenmoleküle Bystandereffekte auf Immunantworten vermitteln können, die gegen andere Antigene gerichtet sind. / Helminth infections induce protective type 2 (Th2) immune responses in the host leading to arrested larval development and/or intestinal worm expulsion. Moreover, Th2 immune responses are initiated against harmless environmental allergens and mediate development of allergic disease. Among multiple mechanisms implicated in host responses to parasites and allergens, mast cells (MCs) play a pivotal role. The present study shows that MC-deficient mouse strains following infection with two gastrointestinal helminths had dramatically reduced early production of the tissue-derived cytokines IL-25, IL-33, and TSLP, which resulted in impaired induction of Th2 immune responses as well as increased parasite burden. These parameters were restored after transfer of WT bone marrow. These data reveal an important role for MCs in orchestrating type 2 immune responses. Parasites have developed various strategies to modulate the immune system via induction of a range of regulatory mechanisms. In this study AvCystatin, the filarial cysteine inhibitor, was found to inhibit airway inflammation and hyperreactivity induced by a clinically relevant allergen of timothy grass pollen (Phl p 5b). AvCystatin increased levels of the regulatory cytokine IL-10 and total numbers of CD4+CD25+Foxp3+ T cells. The immunomodulatory effect in vivo was found to be independent of AvCystatin’s protease inhibitor activity or oligomerization. Finally, AvCystatin suppressed allergen-specific production of IL-13 and created a shift towards Th1 immunity by increased levels IFN-gamma of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from grass pollen allergic patients. The findings contribute to a better understanding of the early events that dictate the priming of type 2 immune responses. Furthermore, helminth product-induced suppression may also have effects on bystander responses to unrelated antigens, thus, suggesting a promising preventive and therapeutic concept in the treatment of aberrant inflammations.

Zusätzlich zu seiner Funktion innerhalb des Gerinnungssystems vermittelt Thrombin inflammatorische Reaktionen. Mastzellen (MZ) sind durch die Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren wie Maus-Mastzell Proteasen (MCPTs mouse mast cell proteases auch als mMCPs bekannt), Zytokinen und Chemokinen. charakterisiert. Da Thrombinrezeptoren, auch als Proteinase-aktivierbare Rezeptoren (PAR) bekannt, von MZ exprimiert werden, wurde untersucht ob eine MZ-Aktivierung über die Thrombin/PAR Interaktion bei einer dermalen Entzündung eine Rolle spielt. Die intrakutane Injektion von Thrombin in die Ohren von C57BL/6 Kit+/+ Mäusen löste eine sofortige kutane Entzündung, einhergehend mit einer starken Ohrschwellung, aus. Im Vergleich dazu war diese Schwellung in MZ-defizienten C57BL/6 KitW-sh/W-sh Mäusen deutlich stärker, was darauf hindeutet, dass MZ anti-inflammatorisch wirken. Die lokale Rekonstitution von C57BL/6 KitW-sh/W-sh Mäusen mit knochenmarksgenerierten MZ normalisierte diesen Effekt. Die quantitative histomorphometrische Untersuchung der MZ bestätigte zusätzlich eine starke Degranulation der MZ nach Thrombininjektion nach. PCR-Analysen der MZ wiesen die Expression aller bekannten Thrombin-Rezeptoren. Die Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen von Thrombin oder PAR-agonistischen Peptiden führte zu einer dosis-abhängigen Degranulation der MZ, was nahe legt, dass die Degranulation der MZ für die Limitierung der thrombin-induzierten Entzündung nötig ist. Gestützt wird die Hypothese durch die Tatsache, dass Zellkulturüberstand von degranulierten MZ zu einer Inaktivierung der Thrombinaktivität führt. Des Weiteren führte die Injektion von Thrombin in die Ohren von MCTP4-defizienten Mäusen zu einer deutlich erhöhten Ohrschwellung im Vergleich zur korrespondierenden Wildtyp-Maus. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die sofortige thrombin-induzierte Entzündungsreaktion durch kutane MZ kontrolliert wird. Dieser Mechanismus wird teilweise durch MCPT4 vermittelt. / In addition to its function in the coagulation system, thrombin mediates inflammatory reactions. Mast cells (MCs) are characterized by releasing inflammatory mediators like mouse mast cell proteases (MCPTs, also designated mMCPs), cytokines, and chemokines, upon activation. Since thrombin-receptors, also known as Proteinase-activated receptors (PAR), are expressed by MCs, it was questioned whether MC activation via the thrombin/PAR axis plays a role in skin inflammation. Intracutaneous injection of thrombin in ears of C57BL/6 Kit+/+ mice induced immediate inflammatory skin reactions associated with a distinct ear swelling. This swelling was more pronounced in MC-deficient C57BL/6 KitW-sh/W-sh mice, indicating that MCs are anti-inflammatory, local reconstitution of C57BL/6 KitW-sh/W-sh mice with C57BL/6 Kit+/+ bone marrow-derived MCs normalized this effect. Additionally thrombin injection resulted in a strong degranulation of MCs assessed by quantitative histomorphometry. PCR analysis of MCs displayed expression of all known thrombin receptors. Stimulation with thrombin or PAR agonistic peptides resulted in a dose-dependent degranulation of MC, suggesting MC degranulation could be necessary for the limitation of thrombin-induced inflammatory responses. Supporting this hypothesis, supernatant from degranulated MCs inactivated thrombin activity. Furthermore, injection of thrombin in ears of C57BL/6 MCPT4-deficient mice, resulted in markedly increased ear swelling compared to the corresponding wild type mice. Together our results suggest that thrombin-induced immediate inflammatory skin reactions are controlled by cutaneous MCs, a mechanism partly mediated via MCPT4.

Ziel dieser Arbeit war es, sowohl die Auswirkungen einer veränderten Selenversorgung über die Nahrung als auch die Rolle des zentralen Transport- und Speicherproteins für Selen (Selenoprotein P, SepP) auf die intestinale Tumorigenese tierexperimentell zu untersuchen. Eine gestörte SepP-Expression, führte zur Ausbildung größerer Tumore. Durch eine Steigerung der Selenversorgung über die Nahrung eine signifikante Reduktion von Tumoranzahl und Gesamttumorfläche erzielt werden. Hierzu wurde den Tieren ab Tag 21 das Vierfache der empfohlenen Tagesdosis (RDA) für Selen verabreicht. Die Ergebnisse zeigten zudem, dass die Auswirkungen einer verminderten SepP-Expression durch eine nutritive Se-Supplementation kompensiert werden können. Der Verlust eines SepP-Allels war mit einer gesteigerten Infiltration von Mastzellen ins Tumorgewebe und höheren Il6-Spiegeln im Serum assoziiert. Auch waren die Tumore dieser Versuchsgruppen schlechter differenziert. Diese Resultate weisen auf eine modulatorische Wirkung von SepP auf die krebsbedingte Immunantwort hin und unterstreichen eine zentrale Rolle dieses Selenoproteins in Bezug auf anti-kanzerogene Wirkmechanismen von Selen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit erstmals die Abhängigkeit protektiver Selen-vermittelter Effekte von einer optimalen SepP-Expression und die präventiven Fähigkeiten einer gesteigerten Selenzufuhr zur Kompensation eines nachteiligen Genotyps. Somit können gerade Menschen, die z.B. aufgrund ihrer genetischen Prädisposition ein erhöhtes Darmkrebsrisiko aufweisen von einer gesteigerten präventiven Supplementation profitieren. Dennoch zeigen Vorarbeiten und die Ergebnisse zu den transgenen Versuchstieren, dass es gerade in Bezug auf eine therapeutische Anwendung unabdingbar ist, ein wachstumsförderndes Potential einer solchen Intervention nach erfolgter Tumorinitiation auszuschließen. Hierzu muss in weitergehenden Studien noch eine geeignete Strategie entwickelt und getestet werden. / The aim of this work was to evaluate to which extend the gene expression of the central transport and storage protein for selenium (Selenoprotein P, SepP) is required to mediate health promoting effects and if these effects can be modulated by selenium supplementation. SepP+/--mice were crossed with Apcmin/+-mice to elucidate the potential disadvantage of a decreased SepP-expression. A third mouse strain, expressing human SEPP in liver, was used to study the beneficial effects of additional circulating human SEPP. Two diets with different selenium content were used to obtain better insights into how SepP-expression influences intestinal tumorigenesis. The loss of one SepP-allele resulted in the development of larger tumors. Overall tumor-count and -area could be reduced by increasing nutritional selenium concentrations. Increased tumorigenesis could thus be compensated for raising nutritional Se concentrations. Interestingly, the additional expression of human SEPP did not elicit any cancer-preventive action. An increased number of mast cells was found in tumorous tissue of SepP+/--mice. This was accompanied by a lower differentiation state and higher Il6 concentrations in serum of heterozygous mice. The results indicate that the SepP genotype is modulating the immune response and highlight the central role of SepP in mediating the anti-cancerogenic effects of Se. We are the first to show that protective effects of Se are related to the expression of SepP and that the negative outcome of a reduced expression can be alleviated by raising nutritional Se supply. Individuals with a higher risk for colorectal cancer may thus benefit from supplementation strategies. Nevertheless the data obtained from transgenic mice and the results of previous studies indicate that therapeutic administration of Se should be handled with care. Especially the potential danger of supplemental Se promoting tumor growth in advanced stages should be addressed in further investigations.

Die Mechanismen der Mastzell(MZ)-Homöostase in peripheren Geweben sind weitgehend unbekannt. Die Regulation der MZ-Zahlen schließt wahrscheinlich die lokale Proliferation der Gewebe-MZ sowie die Rekrutierung und Differenzierung von MZ-Vorläuferzellen ein, wobei das Gewebe den MZ-Phänotyp beeinflusst. Fibroblasten (Fb) induzieren die Proliferation und Differenzierung unreifer Knochenmark-generierter MZ (BMCMC) zu Bindegewebs-MZ (CTMC). Da BMCMC an Fb adhärieren, wurde untersucht ob dieser direkte Zellkontakt für die Fb-induzierte Proliferation und die Differenzierung zu CTMC entscheidend ist. Cokultur-Experimente mit BMCMC und Fb zeigten, dass die verstärkte Proliferation, der erhöhte Histamingehalt und die Induktion der Expression der MZ Protease 4 (MCPT-4) mRNA (beides Marker der CTMC) vom direkten Zellkontakt abhängen. Adhäsionsversuche mit blockierenden Antikörpern demonstrierten, dass die Interaktion von alpha4beta7 Integrin auf den BMCMC mit Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1), auf den Fb, an der Adhäsion beteiligt ist, die Proliferation und Differenzierung der MZ selbst jedoch nicht auslöst. Interessanterweise zeigten BMCMC die Kit, den Rezeptor für den wichtigen MZ-Wachstumsfaktor Stammzellfaktor (SCF), nicht exprimieren, ebenfalls die kontaktabhängigen Fb-induzierte Veränderungen, wenngleich im geringeren Ausmaß. Eine genomweite Expressionsanalyse wies schließlich die kontaktabhängige Hochregulation der Expression weiterer Gene, die mit dem Phänotyp der CTMC assoziiert sind, nach. Des Weiteren konnte die Verringerung der Expression bestimmter Gene gezeigt werden, die von unreifen MZ oder MZ-Vorläufern exprimiert werden. Insgesamt zeigen die Daten der hier vorliegenden Arbeit, dass für die durch Fb ausgelöste umfassenden Differenzierung und Ausreifung von unreifen MZ zu CTMC, eine teilweise durch VCAM-1/alpha4beta7 vermittelte direkte Zell-Zell-Interaktion notwendig ist, bei der sowohl Kit-abhängige, als auch Kit-unabhängige Signalwege involviert sind. / The precise mechanisms of mast cell (MC) homeostasis in peripheral tissues are largely unknown. Regulation of MC numbers is assumed to involve the proliferation of local MCs and the recruitment and subsequent differentiation of MC precursors, whereas the tissues determine the MC phenotype. Fibroblasts (Fb) induce proliferation and differentiation of bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs) towards connective tissue type MCs (CTMCs). Since BMCMCs exhibit adhesion to Fbs, it had been analyzed, whether this direct cell-to-cell crosstalk is mandatory for the differentiation towards CTMCs. It was found that Fb-cocultured immature MCs exhibit increased proliferation and histamine content and the induced expression of mast cell protease 4 (mcpt4) mRNA, both markers for mature CTMC, and that these changes required a directed cell-to-cell interaction. Adhesion Assays using blocking mAbs revealed that the interaction of alpha4beta7 integrin on BMCMCs with Fb-expressed Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) is largely responsible for the adhesion, which itself didn’t induce proliferation and differentiation of MCs. Most notably, MCs deficient for Kit, the receptor for the MC growth factor stem cell factor (SCF), also showed a significant Fb-induced increase in histamine content, mcpt4 expression, and proliferation, albeit to a lesser extent than wildtype BMCMCs. Whole genome expression analysis showed contact-dependently upregulated expression of several genes associated with CTMC phenotype and functions. Furthermore, downregulation of genes associated with MC progenitors had been shown. Collectively, the data show that the Fb-induced substantial differentiation of immature MCs towards CTMCs requires a partly VCAM-1/alpha4beta7-mediated cell-to-cell interaction and involves both Kit-dependent and -independent signaling pathways.

Die Degranulation von Mastzellen soll durch Glycosphingolipide, welche mit der Zellmembran wechselwirken inhibiert werden. Der Sphingosingrundkörper wurde in zehn-stufigen Synthese ausgehend von N-Boc-Serin, aufgebaut. Die anschließende Glycosylierung erfolgte nach der Trichloracetimidatmethode in sehr guten Ausbeuten und stellte den Schlüsselschritt dar. Durch die Variation von unter Anderem der Amidseitenkette, der Glycosylkopfgruppe und des Sphingosingrundkörpers wurde eine Vielzahl an Derivaten für das Screening im Degranulationsassay bereitgestellt. / The present dissertation covers the synthesis of glycosphingolipids which interact with the cell membrane in order to inhibit the degranulation of mast cells. The sphingosin body was synthesized in ten steps starting from N-Boc-Serin. The key step, the glycosylation was achieved using the trichloracetimidat method. The variation of the amid sidechain, the gylcosyl headgroup and the sphingosin body created a number of derivatives that were tested in the degranulation assay.

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Die Degranulation von Mastzellen soll durch Glycosphingolipide, welche mit der Zellmembran wechselwirken inhibiert werden. Der Sphingosingrundkörper wurde in zehn-stufigen Synthese ausgehend von N-Boc-Serin, aufgebaut. Die anschließende Glycosylierung erfolgte nach der Trichloracetimidatmethode in sehr guten Ausbeuten und stellte den Schlüsselschritt dar. Durch die Variation von unter Anderem der Amidseitenkette, der Glycosylkopfgruppe und des Sphingosingrundkörpers wurde eine Vielzahl an Derivaten für das Screening im Degranulationsassay bereitgestellt. / The present dissertation covers the synthesis of glycosphingolipids which interact with the cell membrane in order to inhibit the degranulation of mast cells. The sphingosin body was synthesized in ten steps starting from N-Boc-Serin. The key step, the glycosylation was achieved using the trichloracetimidat method. The variation of the amid sidechain, the gylcosyl headgroup and the sphingosin body created a number of derivatives that were tested in the degranulation assay.

Die Ausbildung und der Schweregrad einer Anaphylaxie kann durch verschiedene Co-Faktoren beeinflusst werden. Zu diesen zählen die nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs), die ihre Wirkung über die Inhibition der COX entfalten. Wie NSAIDs den Schweregrad der Anaphylaxie beeinflussen, ist bisher nicht genau bekannt. Interessanterweise zeigen Anaphylaxie-Patienten mit einer NSAID-Hypersensibilität niedrige Konzentrationen des regulatorischen Prostaglandins E2 (PGE2). Zudem zeigen ASA-tolerante und –intolerante Asthma-Patienten variable anaphylaktische Sensitivitäten. Anhand der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich eine PGE2-Dysregulation auf die Ausbildung und den Schweregrad der Anaphylaxie auswirkt und ob diese durch genetische Prädispositionen gefördert werden kann. Dazu wurden zunächst die PGE2 Konzentration im Serum von ANA-Patienten und gesunden Individuen gemessen. ANA-Patienten zeigten reduzierte PGE2 Level, die invers mit dem Schweregrad der ANA korrelierten. Unterstützend weisen zwei in der Allergieforschung häufig verwendete Mauslinien, Balb/c und C57BL/6, unterschiedliche PGE2 Level auf, die wiederum invers mit dem ANA-Schweregrad korrelierten. Eine Stabilisierung der PGE2 Konzentration mittels eines pharmakologischen Inhibitors der Hydroxyprostaglandin-Dehydrogenase (15-PGDH-I) in vivo führte zu einer Verbesserung des ANA Schweregrades. Um in diesem Zusammenhang den Einfluss von ASA und PGE2 besser zu verstehen, wurde das Model der systemisch passiven ANA im Mausmodel eingesetzt. ASA verschlimmerte den Schweregrad der ANA durch die Inhibition der COX1/2. PGE2 konnte diese Verschlimmerung über die EP Rezeptoren 2, 3 und 4 reduzieren. Um die zugrundeliegenden Mechanismen der Wirkweise von exogenem PGE2 und EP-Agonisten besser zu verstehen, wurden diese Zusammenhänge in murinen und humanen Mastzellen untersucht. PGE2 reduzierte die Schwere der ANA durch Inhibition der Mastzell-Aktivität in diesem System über die Rezeptoren EP2 und EP4. Anhand der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits homöostatische PGE2 Konzentrationen die Aktivität der Mastzelle verändern und vor einer schweren ANA schützen. Zudem kann der Grad der ANA und der Einfluss des PGE2 auf die Mastzellantwort durch genetische Prädisposition beeinflusst werden. Die pharmakologische Stabilisierung des PGE2 könnte daher eine vielversprechende, therapeutische wie auch vorbeugende Strategie zur Behandlung risikoreicher ANA- Patienten sein. / The clinical outcome of anaphylaxis (ANA) can be affected by several co-factors. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are well-known co-factors of ANA acting via COX-inhibition. The NSAIDs-mediated mechanisms altering the severity of ANA are not well-defined. It is reported that patients of ASA (NSAID)-hypersensitivity show low levels of the regulatory prostaglandin E2 (PGE2). Moreover, the effectiveness of PGE2 administration in such patients suggests a critical role of PGE2 in ASA hypersensitivity. In addition, patients of ASA-tolerant and ASA-intolerant asthma show variable ANA sensitivities suggesting a role of genetic variation in susceptibility. The aim of this thesis was to study whether and how PGE2 dysregulation predisposes to ANA and whether genetic pre-dispositions affect the PGE2 system and therefore ANA susceptibility. First, sera from ANA patients and healthy individuals were analyzed for PGE2 levels. ANA patients were characterized by reduced PGE2 levels which inversely correlated with the severity of ANA. This disparity was confirmed by differential PGE2 levels between Balb/c and BL/6 strains, two genetic mouse strains frequently employed in allergy research. PGE2 levels in these mice were again inversely related with the severity of ANA. Results were confirmed by in vivo PGE2 stabilization using 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase inhibitor (15-PGDH-I). Pharmacological PGE2 stabilization ameliorated ANA severity in mice. A passive systemic ANA (PSA) model was applied to study the impact of ASA on ANA severity and the role of PGE2 in this context. ASA aggravated ANA by inhibiting COX-1/COX-2, while PGE2 reduced the aggravation through EP receptors 2, 3 and 4. To delineate the underlying mechanisms, murine and human mast cells were used to study the impact of exogenous PGE2 and EP agonists. PGE2 attenuated ANA severity by inhibiting MC activation through EP2 and EP4 receptors and interfering with MC signaling. In summary, this thesis demonstrates that homeostatic levels of PGE2 modulate MC activation and protect against ANA severity. The impact of PGE2 on MC responses and ANA susceptibility is governed by genetic variation. Pharmacological stabilization of PGE2 may prove to be a therapeutic or preventive strategy in the management of high-risk ANA patients.