Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.

Die Haut ist das größte Organ des Menschen und bildet die Barriere gegenüber Einwirkungen aus der Umwelt. Die Störung der Hautbarriere durch exogene und endogene Reize führt zu einer Entzündungsreaktion in der Haut. In der Folge können Hauterkrankungen wie die irritative oder Atopische Dermatitis entstehen. Der Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α) ist ein pleiotrop wirksames Zytokin, das eine zentrale Rolle bei entzündlichen Prozessen spielt. Ziel der vorgelegten Promotionsarbeit war zu untersuchen, ob und wie TNF-α zu Entzündungsgeschehen, ausgelöst durch exogene und endogene Faktoren, beiträgt. Die Bedeutung von TNF-α wurde in TNF-ko Mäusen in verschiedenen Hautmodellen untersucht. Für das Irritationsmodell wurden chemische und physikalische Reize verwendet. TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) wurde durch die verschiedenen Stimuli signifikant induziert. Diese Induktion war unabhängig von der endogenen TNF-α Produktion, gezeigt durch den Einsatz von TNF- ko Mäusen . Da endogenes TNF-α für die Hautirritation keine notwendige Bedingung darstellte, wurde die Bedeutung von TNF-α bei der atopischen Dermatitis (AD) untersucht. TNF-α defiziente Mäuse zeigen verstärkt Ekzeme im Vergleich zu Wildtyp Mäusen. Die Behandlung von TNF-ko Mäusen mit einem TSLP Antikörper führte zu einer Verminderung des Ekzems. Mastzellen wurden vermehrt in läsionaler Haut gefunden und korrelierten mit dem Schweregrad des atopischen Ekzems sowie der TSLP-Expression. / The skin is the largest organ of an individuum and builds the barrier for a host against the environment. Skin barrier disruption by exogenous or endogenous stimuli can lead to skin inflammation. As a consequence, irritant or atopic eczema, frequent skin diseases, may evolve. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is a pleiotropic cytokine which plays a central role in inflammatory processes. The main aim of this thesis was to clarify whether and how endogenous TNF-α is contributing to skin inflammation driven by exogenous and endogenous triggers. The role of endogenous TNF-α was studied using TNF knockout (-/-) mice. In an irritation model, chemical and physical stimuli were applied on to mouse skin. Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) was significantly induced by the used irritants. This TSLP induction was independent from endogenous TNF-α proven by using TNF-/- mice. Next the role of TNF-α in atopic dermatitis (AD) promoting an allergic skin inflammation was investigated. TNF-/- mice developed more severe AD compared to the wildtype mice and TSLP was significantly increased and correlated with the severity of the eczema. To prove the pathophysiological role of TSLP for AD progression, TNF-/- mice were pretreated with an TSLP antibody. Indeed, these mice developed less AD symptoms compared to the control mice. Mast cells (MCs) were also significantly increased in lesional skin in the AD model and moreover, correlated with AD severity, but also with TSLP expression.

Die Haut ist das größte Organ des Menschen und stellt die primäre Barriere gegen Umwelteinflüsse und Pathogene dar. Eine Dysbalance der Hautbarriere birgt die Gefahr einer nachfolgenden Entzündungsreaktion. Bleibt diese bestehen, können sich Hautkrankheiten wie zum Beispiel die atopische Dermatitis (AD) entwickeln. Verschiedene Zytokine wie Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) werden bei entzündlichen Hauterkrankungen eine bedeutende Rolle zugeschrieben. Die Bedeutung von TSLP wurde zunächst anhand mehrerer Knockout-Mausstämme untersucht. Hier zeigte sich, dass TSLPR-KO und TNF-TSLPR-DKO Mäuse im Gegensatz zu TNF-KO Mäusen keine bzw. weniger Zeichen einer Entzündungsreaktion in der Haut entwickeln. Die Rolle äußerer Einflüsse auf die TSLP-Produktion wurde anhand eines Irritationsmodells ebenfalls in Mäusen untersucht. Dabei führte die Hautirritation, ausgelöst durch Abtragen der oberen Hautschichten mittels eines Tesa-Abriss, zu einem signifikanten Anstieg von TSLP in der Haut?. Mit Hilfe von Agonisten und Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass dieser Irritations-vermittelte TSLP-Anstieg über Interleukin-1 (IL-1) und Protease Activated Receptor 2 (PAR-2) vermittelt wird. In diesem Zusammenhang wurde auch gezeigt, dass die Aktivierung von IL-1- sowie PAR-2-abhängigen Signalwegen zu einer gesteigerten Aktivität des TSLP-Promotors führte. Die Untersuchung der Wirkung verschiedener Mastzellmediatoren auf die TSLP-Expression ergab, dass Tryptase, über die Aktivierung von PAR-2, der wichtigste Mediator für den Anstieg von TSLP nach der Degranulation von Mastzellen ist. Dieses Ergebnis wurde mittels verschiedener in vitro, in vivo und ex vivo Experimentalansätze belegt. So konnte in einem c48/80-abhängigen Degranulationsmodell in Mäusen gezeigt werden, dss PAR-2- sowie Mastzell-KO Mäuse im Vergleich zu Wildtypen nach Injektion von c48/80 signifikant weniger TSLP exprimierten. / The skin is the first line of defense against environmental or microbial pathogens. A deviation of the skin barrier homeostasis by any kind of insult can result in an inflammatory response. The inflammatory response in turn can promote the development of an eczemaincluding atopic eczema. Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) due to its pleiotropic nature play an important role in inflammatory disorders. The major aim of this thesis was to better understand the underlying mechanisms of TSLP production in the context of skin irritation and mast cell (MC) mediators and their contribution in the development of atopic dermatitis (AD). The role of TSLP was studied using TSLPR-/- mice. The data show that TSLPR-/- and TNF-/-/TSLPR-/- mice were protected from AD development, by contrast TNF-/- mice exhibited severe AD. The role of exogenous triggers was studied using tape stripping mediated skin irritation mouse models. Skin irritation resulted in significant enhanced TSLP production. TSLP induction was identified to depend on interleukin (IL)-1 and protease activated receptor (PAR)-2 pathways proven by using exogenous activators or inhibitors of these pathways. Moreover, PAR-2 and IL-1 concomitantly promoted NF-κB binding to the human TSLP promoter which in turn resulted in an increased TSLP promoter activity. Additionally, the role of mast cell mediators in the context of TSLP induction was investigated. Tryptase turned out to be the trigger responsible for the enhanced TSLP response by activating the PAR-2 pathway. This finding was proven by employing in vitro, ex vivo and in vivo approaches. In detail PAR-2-/- and MC-/- mice were used in a compound 48/80 (C48/80) dependent MCs degranulation model. PAR-2-/- and MC-/- mice produced significantly less TSLP in comparison to control mice.

Ionizing radiation (IR) leads to fibrosing alveolitis (FA) after a lag period of several weeks to months. In a rat model, FA starts at 8 weeks after IR. Before that, at 5.5 weeks after IR, the transcription factors Sp1 (stimulating protein 1) and AP-1 (activator protein 1) are inactivated. To find genes/proteins that were down-regulated at that time, differentially expressed genes were identified in a subtractive cDNA library and verified by quantitative RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction), western blotting and immunohistochemistry (IH). The mRNA of the molecular chaperone HSP90AB1 (heat shock protein 90 kDa alpha, class B member 1) was down-regulated 5.5 weeks after IR. Later, when FA manifested, HSP90ab1 protein was down-regulated by more than 90% in lung cells with the exception of mast cells. In most mast cells of the normal lung, both HSP90ab1 and HSP70, another major HSP, show a very low level of expression. HSP70 was massively up-regulated in all mast cells three months after irradiation whereas HSP90AB1 was up-regulated only in a portion of mast cells. The strong changes in the expression of central molecular chaperones may contribute to the well-known disturbance of cellular functions in radiation-damaged lung tissue. (J Histochem Cytochem 62:355–368, 2014)

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.