Introdução: A célula NK possui uma importante função no sistema imune inato de defesa primária contra vírus e patógenos e também realiza a imunovigilâcia tumoral. Muitos estudos clínicos tem avaliado o uso dessas células na imunoterapia adotiva. A expansão e a ativação da célula NK requer sinais e estímulos para manter a sua sobrevivência. Atualmente existem muitos protocolos para a expansão e ativação da célula NK, porém não existe uma definição do melhor método para uso clínico. Objetivo: O estudo tem como objetivo avaliar a melhor forma para expansão das células NK isoladas de células mononucleares do sangue de cordão umbilical e placentário.Método: Foram avaliadas cinco diferentes condições para expansão de células NK de mononucleares isoladas do sangue do cordão umbilical e placentário. Foram testados protocolos utilizando as interleucinas (IL), IL-2, IL-3, IL-15; com ou sem a presença do co-cultivo com células-tronco mesenquimais do cordão umbilical (CTM-CU) e, também o co-cultivo com células apresentadoras de antígeno artificiais ligadas a IL-21 à membrana (mbIL21 APC). Resultados: Os protocolos utilizando co-cultivo com APC mbIL21 foram superiores aos demais quanto à capacidade de expansão de células NK (CD3-, CD56+, CD16+). O protocolo de co-cultura de APC, CTM-CU e estímulo com IL-2 apresentaram um aumento significativo de NK (CD3-, CD56+, CD16+) quando comparado ao protocolo de APC/IL-2 sem CTM-CU (p<0,05). Conclusão: A expansão ex vivo de células NK na presença das APC e CTM-CU apresentaram uma proporção estatisticamente superior de célula NK CD16+ quando comparada com condições de cultivo com apenas a APC, tendo essas células NK potencial para utilização na imunoterapia adotiva associada com anticorpos monoclonais ou anticorpos bi-específicos. / Background: Natural killer (NK) cells play a major role in innate immunity, especially against viral pathogens, and are also a part of the immune surveillance of tumors. Several clinical trials have evaluated the use of these cells for adoptive cell immunotherapy. Ex vivo expansion of NK cells, however, is a complex process which requires multiple cell signals to ensure cell survival, proliferation, and activation. There are many protocols used for NK cell expansion and activation, however, there is a lack of evidence regarding which method is the most effective for clinical grade NK cells expansion. Objective: The main purpose of this study is to evaluate an optimal protocol for the ex vivo expansion of NK cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells (CB-MNC). Methods: Five different conditions for the expansion of umbilical cord-derived NK cells were evaluated. Each protocol was a different combination of interleukins (IL-2, IL-3, and IL-15) with or without the presence of feeder cells or artificial antigen presenting cells (aAPCs). Feeder cells utilized were umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSC), and aAPCs were membrane-bound IL-21 artificial APCs (mbIL21 aAPCs). Results: Protocols employing mbIL21 aAPCs demonstrated greater expansion of natural killer cells (CD3- CD56+) than the other protocols. The protocol employing aAPCs, IL-2 and UC-MSC feeder cells had a statistically significant higher proportion of CD16+ NK cells when compared to the protocol without the MSC feeder cells, but there was no significant difference in the expansion of total natural killer cells concerning these two protocols. Conclusion: Ex vivo expansion of NK cells in the presence of aAPCs and UC-MSC feeder cells yielded a significant higher proportion of CD16+ NK when compared to the aAPCs only culture condition, and could be a better product for NK adoptive immunotherapy in conjunction with monoclonal or bi-specific antibodies.

O transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (alo-TCTH) é uma opção de tratamento para uma variedade de doenças neoplásicas e não neoplásicas, principalmente de origem hematológica sendo doença do enxerto-contra-hospedeiro (DECH) a sua principal complicação. As células Natural Killer (NK) são os primeiros linfócitos a se recuperarem após o TCTH. Além da capacidade de promover o efeito enxerto-versus-leucemia (EVL), as células NK do doador parecem capazes de promover a pega do enxerto e de prevenir o desenvolvimento da DECH. As células NK compreendem aproximadamente 10% dos linfócitos do sangue periférico e são caracterizadas fenotipicamente pela expressão do antígeno de superfície CD56 (CD, cluster of differentiation) e pela ausência de CD3 (CD56+CD3-). O subtipo de células NK CD56dim (baixa densidade do antígeno) é naturalmente mais citotóxico que o subtipo CD56bright (alta densidade do antígeno) o qual é caracterizado pela capacidade de produção de citocinas. Com base nisso, o objetivo do trabalho é avaliar a presença de células NK nos dias 7, 14, 21 e 28 após o TCTH alogênico e autólogo, caracterizando sua frequência, seu imunofenótipo e a sua capacidade de produzir fatores de crescimento hematopoético e citocinas relacionadas. / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is an option of treatment for a variety of neoplastic and non-neoplastic diseases and graft-versus-host disease (GVHD) is its main complication. Natural Killer cells (NK) are the first lymphocytes to recover after HSCT. In addition to the ability to promote graft versus leukemia effect (GVL), donor NK cells appear to be capable of promoting engraftment and preventing the development of GVHD. NK cells comprise approximately 10% of peripheral blood lymphocytes and are characterized phenotypically by the expression of the CD56 surface antigen and absence of CD3 (CD56 + CD3-). The CD56dim (low density of antigen) NK cell subtype is naturally more cytotoxic than the CD56bright (high density of antigen) subtype which is characterized by the ability to produce cytokines. Based on this, the objective of the study is to evaluate the presence of NK cells on days 7, 14, 21 and 28 after allogeneic and autologous HSCT, characterizing their frequency, their immunophenotype and their capacity to produce hematopoietic growth factors and related cytokines.

O câncer de próstata é o segundo câncer mais comum entre homens, uma vez que tanto a incidência como a mortalidade aumentam exponencialmente após a idade de 50 anos. As células Natural Killer (NK) fazem parte do sistema imune inato e reconhecem moléculas de HLA de classe I na célula alvo, através de seus receptores de membrana, chamados killer immunoglobulin-like-receptors (KIR). O objetivo desse estudo foi avaliar a associação entre os genes KIR e HLA em pacientes com câncer de próstata e grupo controle. Genotipamos 200 pacientes com diagnóstico de câncer de próstata e 185 pacientes saudáveis para os genes KIR e HLA classe I por PCR-SSP. Quando comparados os grupos, não foram encontradas diferenças significativas para HLA-C do grupo 1 e do grupo 2, HLA-Bw4, HLA-A3 e A11. Nenhuma diferença foi observada na frequência dos genes KIR nos pacientes com câncer de próstata e nos controles. Esses resultados sugerem que não há potencial papel para o sistema dos genes KIR no câncer de próstata. / Prostate cancer is the second most common cancer among men, since both incidence and mortality exponentially increases in men over fifty years of age. Natural killer cells (NK) are part of the innate immune system recognizing class I HLA molecules on target cells through their membrane receptors, called killer immunoglobulin-like receptors (KIR). The aim of our study was to evaluate the association between the KIR genes and HLA alleles in patients with prostate cancer and healthy controls. Two hundred prostate cancer patients and 185 healthy controls were typed for HLA class I and KIR genes by PCR-SSP. When both groups were compared, no significant differences were found for HLA-C group 1 and group 2, HLA-Bw4, HLA-A3 and A11. No difference was seen either in KIR frequency between patients with prostate cancer and controls. In conclusion, our data suggests no potential role for the KIR gene system in prostate cancer.

O câncer de próstata é o segundo câncer mais comum entre homens, uma vez que tanto a incidência como a mortalidade aumentam exponencialmente após a idade de 50 anos. As células Natural Killer (NK) fazem parte do sistema imune inato e reconhecem moléculas de HLA de classe I na célula alvo, através de seus receptores de membrana, chamados killer immunoglobulin-like-receptors (KIR). O objetivo desse estudo foi avaliar a associação entre os genes KIR e HLA em pacientes com câncer de próstata e grupo controle. Genotipamos 200 pacientes com diagnóstico de câncer de próstata e 185 pacientes saudáveis para os genes KIR e HLA classe I por PCR-SSP. Quando comparados os grupos, não foram encontradas diferenças significativas para HLA-C do grupo 1 e do grupo 2, HLA-Bw4, HLA-A3 e A11. Nenhuma diferença foi observada na frequência dos genes KIR nos pacientes com câncer de próstata e nos controles. Esses resultados sugerem que não há potencial papel para o sistema dos genes KIR no câncer de próstata. / Prostate cancer is the second most common cancer among men, since both incidence and mortality exponentially increases in men over fifty years of age. Natural killer cells (NK) are part of the innate immune system recognizing class I HLA molecules on target cells through their membrane receptors, called killer immunoglobulin-like receptors (KIR). The aim of our study was to evaluate the association between the KIR genes and HLA alleles in patients with prostate cancer and healthy controls. Two hundred prostate cancer patients and 185 healthy controls were typed for HLA class I and KIR genes by PCR-SSP. When both groups were compared, no significant differences were found for HLA-C group 1 and group 2, HLA-Bw4, HLA-A3 and A11. No difference was seen either in KIR frequency between patients with prostate cancer and controls. In conclusion, our data suggests no potential role for the KIR gene system in prostate cancer.

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T02:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Copi_Cecilia_M.pdf: 12156283 bytes, checksum: 93ce542963e020dcfb1af6c2bf9d5283 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante a gestação normal em primatas e em roedores observa-se o acúmulo de linfócitos natural killer no ambiente uterino (uNK). A funções comprovadas das células uNK estão relaciondas com o reconhecimento das células trofoblásticas alogênicas e produção de citocinas imunomoduladoras do ambiente uterino que garantem o sucesso da gestação. Além da produção de citocinas envolvidas na homeostase do ambiente uterino, as uNK produzem e estocam nos seus grânulos moléculas citotóxicas como a perforina e granzimas. Estas moléculas estão envolvidas na resposta imune inata das células NK, com potencial de promover a lise de células alvo. Porém, se ocorre a ativação desta atividade citolítica, ou mesmo se as uNK promovem a secreção deste arsenal de moléculas citolíticas no ambiente uterino em gestação normal, ou em casos de interrupção da gestação, não são conhecidas. Os conhecimentos nesta área não avançam pelas limitações éticas de estudar experimentalmente o ambiente uterino em gestantes humanos e a falta de modelos experimentais estabelecidos em animais laboratoriais. No presente trabalho, propos-se utilizar o modelo experimental de indução de lesões embrionárias para provocar o desequilíbrio do ambiente uterino e avaliar as alterações nas células uNK. Para tanto, foram utilizados camundongos prenhes no 9° dia de gestação que foram submetidas à procedimentos cirúrgicos de lesão do embrião. Amostras uterinas dos sítios de desenvolvimento embrionários de animais de gestação normal, dos animais com embriões lesionados nos intervalos de 10, 30 e 60 minutos póslesão, e dos animais manipulados cirurgicamente sem a lesão embrionária foram coletados e processados para avaliações através de métodos citoquímicos e imunocitoquímicos em microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os sítios uterinos de embriões lesionados apresentaram reação hiperêmica na região mesometrial já aos 10 minutos pós-lesão, que se acentuava nos períodos mais longos de pós-lesão. As células uNK presentes nesta região apresentaram alteração na reatividade pela citoquimica de lectina DBA e immunocitoquímica com a anti-perforina, sendo evidente a gradual redução na intensidade das reações no decurso do tempo pós-lesão. Na análise ultra-estrutural verificou-se a desestruturação dos grânulos lisossomo-secretores, sendo notória a perda do conteúdo do compartimento secretor evidenciada pela reação com o azul-cuprolínico. O compartimento lisossomal do grânulo embora sofra também uma desestruturação pronunciada, mantêm a reatividade para anti-catepsina D, sugerindo a preservação de parte da sua funcionalidade. A perda do conteúdo do compartimento secretor, notadamente a perforina e os proteoglicanos no período de 10 minutos pós-lesão, sugere a degranulação das uNK e portanto a ativação da atividade citotóxica destas células, numa resposta aguda frente ao desequilíbrio do ambiente uterino afetado pela lesão embrionária. Porém, não foi constatado qualquer indício morfológico da ocorrência da degranulação através do mecanismo exocitose-símile ou ainda, o efeito da ação citolítica sobre as células circunjacentes às uNK ativadas / Abstract: In the uterine environment during normal pregnancy of primates and rodents is seen the accumulation of natural killer lymphocites (uNK). The confirmed functions of uNK cells are related to recognition of allogeneic trophoblast cells and production of immunomodulating cytokines of uterine environment that assure the successful pregnancy. Besides the production of cytokines related to homeostasis of uterine environment, the uNK produce and store citotoxic molecules of perforin and granzymes in their granules. These molecules are involved in the innate immune response of NK cells with potential to promote lysis of target cells. However, whether the lytic activity is triggered or even the uNK promotes the secretion of these sets Df cytolitic molecules into the uterus of normal pregnancy or in the miscarriages are not known. The advances of knowledge in this field are slow down due to ethical limitation of experimental studies with human pregnant uterus and lack of well established experimental models in laboratory animal. In the present work it was proposed to use the experimental model of induction of embryo lesions to promote the unbalance of uterine environment and evaluated the changes in uNK cells. Pregnant mice on 9° gestational day were submitted to surgical procedure of embryo lesion and uterine samples from these embryo lesioned sites were collected after 10, 30 and 60 minutes, as did the normal pregnant and sham operated animais. The samples were processed for cytochemical and immunocytochemical evaluations in light and transmission electron microscopy. The embryo lesioned uterine sites showed hyperemic reaction in the mesometrial region as soon as 10 min after lesion which increased as increased the time lapse after lesion. The uNK cells found in these regions showed reactivity changes with DBA lectin cytochemistry and with anti-perforin immunocytochemistry, being noticed the gradual reduction on reaction intensities on course of time after lesion. In the ultrastructural analysis were seen the disruptions of secretory-Iysosomes granules with notorious lost of secretory compartment contents as were evidenced by cuprolinic blue cytochemical reaction. In spite of structural organization of lysosome compartment of the granules was also affected it was maintained the anti-cathepsin D positive reaction which suggest the preservation of part of its functionality. The secretory compartment contents lost, notably the perforin and proteoglycans at 10 min after embryo lesion suggest degranulations of uNK and therefore an acute response of these cells by activation of citotoxic activity, under effects of unbalance of uterine environment affected by embryo lesion. However, it was not detected any morphological evidence of degranulation by exocytosis-like mechanism or even, the cytolitic effect on neighbor cells around the activated uNK cells / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T08:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torello_CristianeOkuda.pdf: 8596128 bytes, checksum: e07457446c814c5f191e0c629491876d (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neste trabalho, investigamos os efeitos do extrato padronizado de Rhodiola rosea L. (ERR) sobre a resposta imunohematopoética de camundongos infectados com Listeria monocytogenes. Os resultados demonstram que o ERR aumenta a resistência dos animais frente uma dose letal de Listeria quando administrado profilaticamente nas doses de 100 e 250 mg/kg por sete dias consecutivos anteriores à inoculação. Paralelamente, reversão da mielossupressão induzida pela infecção, concomitante ao aumento na atividade de células natural killers (NK) e na produção das citocinas TNF-a, IFN-? e fatores estimuladores de colônias foram observados. Os resultados obtidos demonstram que o ERR compartilha da habilidade de regular positivamente os desequilíbrios hematopoiéticos e imunológicos envolvidos nos estágios iniciais da infecção com L. monocytogenes. Estes efeitos podem ser atribuídos à recuperação no equilíbrio da resposta hematopoiética através da produção de IL-1a e IL-6 pelas células estromais no microambiente medular e também da produção de fatores estimuladores de colônias a partir das 24 horas de infecção, promovendo aumento no número de progenitores de macrófagos e granulócitos na medula óssea. Além disso, a eficácia do ERR também depende do aumento na produção das citocinas TNF-a e IFN-?, do aumento na atividade funcional das células NK e polarização da resposta celular para Th1. Juntos, estes efeitos contribuem para o aumento na resistência a L. monocytogenes. / Abstract: In this work, we have investigated the effects of Rhodiola rosea L. extract (ERR) in Listeria monocytogenes infected mice. Our results demonstrated that ERR protects mice from a lethal dose of L. monocytogenes, when administered prophylactically at 100 and 250 mg/kg, for seven consecutive days prior to the infection. In addition, prevention of myelosuppression induced by infection, concomitant to increasing natural killers (NK) cells activity and production of TNF-a, IFN-? and colony-stimulating factors were observed. The results showed that ERR share the ability of regulating positively the hematopoietic and immunological unbalance involved in the initial stages of infection with this pathogen. These effects could be attributed to recovering of the hematopoietic response through the production of IL-1a and IL-6 by stromal cells in the bone marrow microenvironment and the production of colony-stimulating factors at 24 hours of infection, promoting an increase in the number of granulocytes and macrophages progenitors in the bone marrow microenvironment. Moreover, the efficacy of ERR depends on high levels of TNF-a and IFN- ?, increased NK cells activity and polarization to Th1 response. Together, these effects contribute to increasing resistance to L. monocytogenes. / Universidade Estadual de Campi / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lippe_ElianaMaraOliveira_M.pdf: 15998840 bytes, checksum: c90882b20fd79172ca6324e555698016 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o sucesso da implantação e do desenvolvimento embrionário no útero de humanos e roedores decorre de interações íntimas entre as células de origem materna e fetal, com a intermediação de citocinas e mediadores químicos em fino balanço estabelecendo um diálogo entre as diferentes populações celulares da interface materno-fetal. Este diálogo envolve do lado fetal as células trofoblásticas e do lado materno o estroma decidualizado, vasos sanguíneos e células leucocitárias do endométrio, numa complexa rede de sinalizações cujos mecanismos são apenas parcialmente conhecidos. Desequilíbrios neste balanço de sinalizações podem resultar na interrupção da gravidez sendo particularmente intrigante a participação das células natural killer uterinas (uNK) que constituem uma população linfocitária que estão presentes em grande quantidade no ambiente uterino exclusivamente durante a gestação. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão e participação das isoformas das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) como potencial indutor do desequilíbrio da homeostasia do microambiente uterino na interface materno-fetal envolvendo a produção do óxido nítrico (NO). Foram utilizados camundongos no 8° e 10° dia de gestação (dg) normal e grupos de animais cujos embriões foram lesionados mecanicamente por intervenção cirúrgica ou inoculados com lipopolissacarídios (LPS). Amostras uterinas de sítios embrionários foram coletadas nos períodos de 1, 2 e 6 horas pós-lesão mecânica, ou, 6 horas após inoculação com LPS e processados de acordo com as técnicas rotineiras para embebição em parafina, assim como, processados para obtenção de homogeneizados teciduais da região mesometrial destes sítios embrionários. Cortes de parafina foram submetidos à reação citoquímica com a lectina Dolichos biflorus (DBA) e às reações imunocitoquímicas para as isoformas iNOS, eNOS e nNOS e, para IFNa. Foram realizadas SDS-PAGE dos homogeneizados teciduais e Western-blot com os anticorpos anti-iNOS, anti-eNOS e anti-nNOS. A região mesometrial dos sítios embrionários lesionados mecanicamente apresentou hiperemia após 1 hora de lesão que evoluiu para um quadro de hemorragia nos períodos posteriores. No grupo submetido ao tratamento com LPS foi observado um quadro de hiperemia no período de 6 horas. Pela citoquímica com a lectina DBA constataram-se alterações na morfologia das células uNK destes sítios, sendo notória a perda de reatividade no conteúdo dos grânulos lisosomo-secretores. As avaliações imunocitoquímica para iNOS indicaram que as células uNK, as células deciduais e as células trofoblásticas gigantes expressam iNOS constitutivamente na gestação normal, o mesmo ocorrendo com as isoformas eNOS e nNOS. Nos sítios de lesão embrionária, as células uNK apresentam acentuada redução na marcação pela imunocitoquímica para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas, com recuperação parcial após 6 horas. Estas variações não foram constatadas em outras células da interface materno-fetal. A eNOS apresentou marcações constantes nas células uNK e nas células musculares lisas, sem variações nos grupos experimentais de lesão embrionária. Pelo Western-blot foi constatada uma redução signficativa para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas pós-lesão mecânica. Estes resultados demonstraram que as células uNK respondem às alterações do ambiente uterino induzido pela lesão embrionária ou pelo LPS, com rápida mobilização das isoformas iNOS e nNOS possivelmente na produção do NO. O NO liberado por estas células pode ser a causa da alteração da permeabilidade ou lesão vascular da região mesometrial provocando a hiperemia e hemorragia. A mobilização da atividade da iNOS nas células uNK não parece ser dependente do IFN-a. e portanto não ocorre o envolvimento das células dendríticas nesta via de sinalização / Abstract: The successful embryo implantation and development in human and rodents uteri is dependent of intimate interaction between maternal and fetal cells, with intervening of fine balance of cytokines and chemical mediators on cross-talks between cells in the maternal-fetal interface. This dialogue involves the cells of decidualized stroma, blood vessels and leukocytes from endometrium of maternal side and the trophoblast cells from embryo in a complex signaling network which mechanism is only partially understood. Unbalance of these signals could outcome in miscarriage being intriguing the participation of uterine natural killer cells (uNK) that com pose lymphocyte population accumulate in the uterine environment specifically during pregnancy. The aim of this work was to evaluated the participation of nitric oxide synthase (NOS) enzymes isoforms which arise in nitric oxide (NO) production, as potential inducer of unbalance of homeostasis in the uterine environment. It was used normal pregnant mice on 8° and 10° gestational days and groups of animais which embryos were surgically lesioned or inoculated with lipopolyssacharide (LPS). Uterine samples were colleted after 1, 2 and 6 hs of embryo lesion or 6hs after LPS inoculation and processed for conventional paraffin embedding, as so as, for tissue homogenates of mesometrial region from this uterine sites. Paraffin sections were processed for Dolichos biflorus (DBA) lectin cytochemistry and immunocytochemistry for iNOS, eNOS, nNOS and IFN-a. SDS-PAGE and Western blot were performed with tissue homogenates using anti-iNOS, anti-eNOS and antinNOS. The mesometrial region of embryo lesioned uterine sites showed hyperemia after 1 hr lesion and increased to hemorrhage after that. In the LPS treated animais was seen hyperemia after 6hr. The DBA cytochemistry showed morphological changes in the uNK cells found in this embryo lesioned sites being noticeable the lost of reactivity in the secretory-Iysosome granules contents. The immunocytochemical for iNOS pointed out the uNK, decidual and trophoblast cells expressing iNOS constitutively in the normal pregnancy, as did the eNOS and nNOS. In the embryo damaged sites the uNK cells showed remarkable reduction in the iNOS and nNOS labeling after 1 and 2 hr with partial recuperation after 6 hr. These variations were not seen in other cells. The eNOS showed constant labelling on uNK cells and smooth muscle cells without changes in the experimental groups of embryo lesion or treated with LPS. By Western blot, it was noted significant lowering for iNOS and nNOS in the periods of 1and 2 hr after lesion. These results showed acute response of uNK cells against the changes of uterine environment induced by embryo lesion and LPS treatment, with fast mobilization of iNOS and nNOS isoforms possibly in the production of NO. The NO released from these cells could be the cause of changes on vascular permeability or even lesion of blood vessels localized in the mesometrial region wich results in hyperemia and hemorrhage. The iNOS activation of uNK cells does not seem dependent of IFN-a and therefore without commitmentof dendritic cells in this signaling pathway / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T15:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Farias_AlineMacedo_M.pdf: 19526520 bytes, checksum: dc55dc97ad91bfacd185ea4b6bfb7e81 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o sucesso da implantação e desenvolvimento embrionário em animais de placentação do tipo hemocorial requer além da presençafísica do embrião/feto,uma dinâmica de alterações seqüenciais na interface materno-fetal do útero gestante. Tais alterações são mediadas e controladas pelas ações sincronizadas de uma série de fatores de efeito endócrino, parácrino e autócrino, com o comprometimento de diversas células presentes nesta interface. Dentre as peculiaridades do útero gestante, o recrutamento e o acúmulo de células uNK têm sido apontado como de fundamental importância na modulação da homeostase da interface materno-fetal para o desenvolvimento normal da gestação. Por outro lado, a complexidade das múltiplas interações célula-célula e citocinas-células que modulam a interação materno-fetal, dificulta a compreensão plena dos mecanismos envolvendo a participação das células uNK na imunomodulação do útero gestante. Portanto, procuram-se por procedimentos que permitam as análises do comportamento das células uNK em condiçõesexperimentais controladas,assim como, elucidar tanto as vias da ativação, quanto da inibição das atividades moduladorasdestas células na gestação. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer um modelo experimental de cultivo de células uNK avaliando desde a viabilidade das células isoladas do útero de camundongos gestantes e, testando diversas condições para manipulação e manutenção in vitro destas células. Foram aprimorados os procedimentos de isolamento positivo e purificação das células uNK de camundongos pelo método da esfera magnética revestida com lectina DBA. Foram conduzidos testes quanto aos efeitos dos componentes da matriz extracelular -fibronectina, laminina e colágeno I na sobrevida destas células e, quanto aos efeitos isolados e combinados das interleucinas IL-2, IL-15 e GM-CSF e, das quimiocinas MIP-1j3e CXCL10. Para otimização dos procedimentos destes ensaios, foi desenvovido um protocolo de cultivo em micro-spots, visando manipular células em escala mínima (5x103 células) com reprodutibilidade e sensibilidade que permitisse a padronização dos ensaios in vitro. Dentre os componentes da matriz extracelular testados, a fibronectina proporcionou a manutenção de maior número de células viáveis pelo período de até sete dias de cultivo, enquanto a citocina IL-15 promoveu a diferenciação das células uNK notadamente pelo aumento de grânulos citoplasmáticos. A quimiocina MIP-1j3 induziu a migração de células in vitro, enquanto a CXCL10 teve um efeito inibidor desta ação do MIP-1j3. Por outro lado, as análises quantitativas mostraram que a combinação da CXCL10 e IL-15 manteve o maior número de células uNK aderidas ao substrato de fibronectina em períodos prolongados de cultura, alem de promover a diferenciação destas células. A integridade e viabilidade das células uNK pode ser comprovada pela amplificação de transcriptomas isoladas de 5x103 células através do RT-PCR. Porém, as reações imunocitoquímicas com anti-PCNA não demonstraram qualquer atividade proliferativa nas células uNK mantidas nestas condições de cultivo.Estes resultados demonstram a adequação deste protocolo de cultivo em microspot para diversos ensaios in vitro com as células uNK isoladas de camundongos mesmo em pequenas quantidades e, um protocolo inovador para estudos da fisiologia destas células em situações experimentais controladas / Abstract: The success of embryo implantation and development in the animais of hemochorial type placentation requires beside the presence of the embryo/fetus properly,a dynamic sequential changes at the maternal-fetal interface in the pregnant uterus. These changes are mediated and controlled by synchronized actions of many endocrine, paracrine and autocrine factors with commitment of several cells present at this interface. Among the peculiar features of normal pregnant uterus, the uNK cells recruitment and accumulation has been hallmarked as essential to modulate the maternal-fetal interface homeostasis. Otherwise, the complexity of multiple cell-cell and cytokine-cells interactions involved at the maternal-fetal interaction of pregnant uterus, make difficult the fully understanding of mechanisms related to the participation of uNK cells in the immunomodulation of pregnant uterus. Therefore, it is widely expected to establish and experimental procedures that benefit the analysis of uNK cells behavior under controlled condition and those allowing elucidation of both activation and inhibition of modulator activities of these cells. The present work aimed to establish an experimental model of uNK cells culture evaluating since the viability of isolated from pregnant mouse uterus and testing several conditions for in vitro manipulation and maintenance of these cells. There were improved the procedures of positive isolation and purification of mouse uNK cells by OSAlectin coated magnetic-beadmethod. Tests regarding the effects of extracellular matrix components - fibronectin, lamminin and collagen I on surviving of these cells and effects of interleukin IL-2, IL-15 and GM-CSF and, chemokines MIP-1[3and CXCL10 alone or in combination were perfomerd.To optimize the procedures of these in vitro assays, it was set up a protocol of micro-spot culture for manipulation of minimal scale (5.103cells) of cells with reproducibility and sensibility. Among the extracellular matrix components, the fibronectin promoted the maintenance of highest proportion of viable cells during seven days culture, while the cytokine IL15 induced the uNK cell differentiation noticeable by increasing of cytoplasmatic granules. The chemokine MIP-1[3induced the cell migration in vitro, while CXCL-10 inhibited the effect on MIP-1[3.On the other hand, the quantitative analysis showed the combination of CXCL-10 and IL-15 maintained the largest number of uNK cells for longest time adhered on fibronectin-coated cultures, as so as, the differentiation of these cells. However, the PCNA immunocytochemistry did not show any proliferation activity of uNK cells in culture. The integrity and viability of uNK cells in culture was confirmed by RT-PCR of transcriptomes obtained from 5.103 cells. These results confirm the adequacy of micro-spot culture as new insight using small number of uNK cells for in vitro assays and the establishment of required conditions to maintain these cells in primary culture to study their physiology under controlled experimental conditions / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:21:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Degaki_KarinaYumi_M.pdf: 2877669 bytes, checksum: b1e725db393d6287fab125efb8b00e16 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As células natural killer uterinas (uNK) atuam na modulação da interface materno-fetal e homeostasia do útero gestante, sem desencadear a atividade citolítica típica de uma resposta imune inata. Contudo, ao provocar uma lesão cirúrgica no embrião (LCE) ocorrem alterações no comportamento das células uNK de camundongos e possível indução da atividade citolítica. O presente trabalho avaliou a expressão gênica de mediadores relacionados tanto com a ativação, quanto efetores da atividade citotóxica das células uNK no útero gestante de camundongos frente à anomalia provocada pela LCE. Foram avaliadas as expressões dos genes perforina, granzima-A, IFN-y, IL-15, IL-18, TNF-a, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L através do RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) semi-quantitativo, a partir do RNAtotal obtido de homogenados teciduais da região mesometrial (RM) dos sítios uterinos de camundongos no 9º dia de gestação normal e grupos de animais submetidos à LCE nos períodos de 0,5, 1, 2, 6, 12 e 24 horas pós-LCM e, de RNA obtido de células uNK isoladas de animais gestantes normais. Foram investigadas também as diferenças nas expressões dos genes DAP12, IFN-??e TNF-a ?em RNA extraídos de células uNK imaturas e maduras microdissecadas de criocortes da RM pela microscopia de captura a laser (LCM) e avaliadas pelo qRT-PCR (quantitative Real Time-PCR). Os resultados do RT-PCR confirmam a expressão de todos os genes avaliados nos homogenados da RM e nas células uNK isoladas não foram detectadas apenas os genes da IL-15 e IL-2. Pela análise semi-quantitativa dos amplicons do RT-PCR os genes das proteínas citolíticas, granzima-A e perforina, juntamente com citocinas pró-inflamatórias IFN- y ?e TNF-a ?apresentaram aumentos significativas em 1h após a LCE e redução para níveis próximos do animal normal nos períodos após 6h da LCE. O aumento na expressão destes genes relacionado com a resposta imune inata das células NK, sugere uma rápida mudança do comportamento das células uNK em resposta à LCE, cujas ativações podem envolver a expressão do gene DAP12 que também mostra tendências de aumento nos mesmos períodos pós-LCE. Por outro lado, a expressão dos genes IL-15, IL-2, IL-18 e IL-6 relacionada com a migração, proliferação e diferenciação das células uNK não teve uma variação significativa entre as amostras de gestação normal e pós-LCE. Do sistema Fas/FasL, a redução significante do FasL resulta na regulação negativa da indução de morte celular por apoptose das células uNK, podendo prolongar a viabilidade destas células no ambiente uterino alterado pela LCE. Estes resultados comprovam que a LCE induz uma rápida regulação positiva da expressão dos genes relacionados com mecanismos de citotoxicidade da resposta imune inata das células uNK. Pelas análises dos genes DAP12, TNF-??e IFN-y ?através do qRT-PCR do RNA extraído de células uNK isoladas pela LCM identificaram-se diferenças nas expressões destes genes entre as células uNK imaturas e maduras classificadas atualmente por critérios morfológicos. As diferenças de expressões comprovam a ocorrência de subpopulações com heterogenidade funcional não atribuível apenas a subtipos de estágios de diferenciação celular e com possíveis domínios de distribuição específica no ambiente uterino / Abstract: The uterine natural killer cells (uNK) actively modulate the maternal-fetal interface and homeostasis of pregnant uterus, without triggering the typical cytolytic activity of innate immune response. However, experimentally induced embryo lesion in the pregnant mouse uterus, changes the uterine homeostasis with commitment of uNK cell and possible induction of its cytolytic activity. The present work evaluated the gene expression of mediators related either to the activation and effectors molecules of uNK cells cytotoxic activity. It was evaluated the genes of perforin, granzyme-A, IFN-y, IL-15, IL-18, TNF-a, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), using RNA isolated from normal pregnant mice uterus on gestational day (gd) 9 and after 0.5, 1, 2, 6, 12 and 24h of abnormal pregnancy provoked by surgical lesion of the embryo (SLE) and also from RNA obtained from uNK cells isolated from normal pregnant mice. Differences in the DAP12, IFN-??and TNF-a ?genes expressions were also investigated with RNA isolated from immature and mature subtypes of uNK cells dissected from cryosections of mesometrial regions in the laser capture microscope (LCM) and evaluated by quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR). The results of RT-PCR confirmed the expression of all genes evaluated in the uterine tissue homogenates and in the uNK cells were not detected the only expression of IL-15 and IL-2 genes. By semi-quantitative analysis of RT-PCR amplicons, the genes of cytolytic proteins, granzymes-A and perforin all together with pro-inflammatory cytokines IFN-y ?and TNF-a ?showed significant increasing at 1h after SLE and decreasing to the level near of normal pregnancy after 6h of SLE. The increasing expression of these genes related to innate immune response of NK cells suggest the quick changes of uNK cells behavior in response to the SLE, which activation could involve the expression of DAP12 gene that also showed increasing at the same period after SLE. On the other hand, the expression of IL-15, IL-2, IL-18 and IL-6 genes related to the migration, proliferation and differentiation of uNK cells did not showed significant differences among the SLE samples and normal pregnancy. The significant decreasing of FasL after SLE could down regulate the triggering of apoptotic cell death pathway in the uNK cells and therefore, increasing the viability of these cells in the uterine microenvironment affected by SLE. These results prove that SLE induces fast up-regulation genes expression related to the cytotoxic pathway of uNK cells innate immune response ability. Based on analysis of qRT-PCR of DAP12, TNF-a ?and IFN-y ?genes performed with RNA obtained from uNK cells dissected in the LCM, it was identified differences in the expression of these genes between now a days classified as immature and mature forms of uNK cells. These expressions differences attest the occurrence of functionally heterogeneous subpopulations of uNK cells not restricted to the differentiation stages and possible specific distribution domains in the uterine environment / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T00:13:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Calgarotto_AndranaKarla_D.pdf: 1646916 bytes, checksum: ca2ab5d61b64cf7aa060ac3c410f1029 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Neste trabalho avaliamos os efeitos de compostos derivados do nitroestireno, NTS1 e NTS2, sobre a resposta imunohematopoética de camundongos normais e portadores do tumor ascítico de Ehrlich (TAE). O estudo dos mecanismos envolvidos no tratamento de camundongos com NTS1 e NTS2 frente às alterações induzidas pelo TAE mostra efeitos imunológicos distintos dos dois compostos. O composto NTS1 induziu aumentos significativos na atividade de células NK, na proliferação de células mononucleares esplênicas e na produção de citocinas com padrão Th1 (IL-2 e IFN-?) liberadas por células mononucleares do baço. Em contrapartida, a atividade de NTS2 esteve relacionada com ativação macrofágica. Nossos resultados demonstram que o tratamento com NTS2 promove aumento significativo nos níveis de TNF-a e IL-1 no sobrenadante da cultura de macrófagos peritoneais. Outro efeito importante de NTS2 sobre macrófagos peritoneais foi o estímulo na produção de NO2-. Além dos parâmetros imunológicos citados, avaliamos, os efeitos de NTS1 e NTS2 sobre o crescimento e diferenciação de precursores hematopoéticos. Tanto NTS1 como NTS2 foram capazes de reverter a mielossupressão provocada pela evolução do tumor, além de aumentar a atividade estimuladora de colônias (CSA) no soro de camundongos Balb/c. Os resultados obtidos demonstram que os compostos compartilham da habilidade de regular positivamente os desequilíbrios hematopoéticos e imunológicos envolvidos na evolução temporal do TAE. A partir disso, testamos a capacidade dos compostos no processo de diferenciação mielocítica utilizando um sistema de cultura ex- vivo no qual células humanas CD34+ foram tratadas com NTS1 e NTS2. Nossos resultados apresentaram atividade dose-dependente de NTS1 e NTS2 na proliferação e viabilidade de células CD34+. Além de aumentar significativamente o número de progenitores mielóide comum e para granulócitos de macrófagos. Os compostos apresentaram diferentes efeitos durante o processo de diferenciação. Inibiram a formação de neutrófilos maduros, porém, NTS1 aumentou significativamente a produção de metamielócitos e NTS2 de monócitos. Estes efeitos fenotípicos na proliferação e na diferenciação observados após o tratamento com NTS1 e NTS2 podem estar relacionados com a via p38MAPK e o fator transcricional CEBP-a / Abstract: In this work, we have investigated the effects of two nitrostirene derivatives compounds, NTS1 and NTS2, in the immune-hematopoeitic system in normal and Ehrlich ascites tumor (EAT)-bearing mice. The study of the mechanisms involved in the treatment produced by the NTS1 and NTS2 against induced alterations by EAT were different, showing significant improvements in the NK cells activity, proliferation and Th1 (IL-2 and INF-?) by mononuclear spleen cells. On the other hand, NTS2 activity was related to macrophage activation. Our results show that treatment with NTS2 promotes significant increase in the TNF-a and IL-1 levels in supernatants of the cultures of peritoneal macrophages. Another important effect of NTS2 on peritoneal macrophage was the stimulation in the production of NO2-. Beyond immunological parameters, we investigated the NTS1 and NTS2 effects on hematopoietic progenitors. Treatment with NTS1 and NTS2 protected the host of myelosuppression caused by tumor development and increase the colony-stimulating activity (CSA) in the serum of Balb/c mice. The results showed that NTS1 and NTS2 share the ability of regulating positively the hematopoietic and immunological unbalance involved in the TAE development. Concerning their effects on myelopoiesis, we investigated the compounds utilizing an ex-vivo differentiation system in which umbilical cord blood derived CD34+ cells were treated with NTS1 and NTS2. Our results show that NTS1 and NTS2 have concentration dependent effects on proliferation and viability of CD34+ cells. Moreover, NTS1 and NTS2 significantly increase common myeloid and granulocyte/macrophage progenitors. The compounds have differential effects on terminal differentiation, inhibiting mature neutrophil, however, NTS1 significantly increased metamyelocytes and NTS2 monocytes. The phenotypic effects on proliferation and differentiation observed after NTS1 and NTS2 treatment can be explained by changes in p38MAPK cell signaling and with CEBP-a transcription factor / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia