La symbiose légumineuse-rhizobium a une importance majeure pour les écosystèmes terrestres puisqu'elle permet à la plante hôte de fixer l'azote atmosphérique. L'interaction initiale entre le poil absorbant de la plante hôte et son partenaire bactérien repose sur un dialogue moléculaire complexe. L'évènement de signalisation le plus précoce, détecté immédiatement après la perception des facteurs Nod bactériens, est un influx de Ca2+, accompagné d'une inhibition de la pompe à proton et d'un efflux de Cl- conduisant à une dépolarisation de la membrane plasmique. Cette dépolarisation provoque un efflux de K+ permettant le repolarisation de la membrane. L'objectif de ce travail a été d'identifier des acteurs moléculaires de cette signalisation électrique en utilisant Medicago truncatula comme légumineuse modèle. Dans un premier temps, nous avons identifié un répertoire de gènes candidats à partir de l'analyse du transcriptome du poil absorbant obtenu par RNA-Seq. Nous avons alors exprimé différents candidats (2 canaux anioniques, 1 canal cationique potentiel de la famille CNGC et 1 canal potassique) dans des ovocytes de xénope pour tester leur fonctionnalité (dans ce système) et préciser leurs propriétés de transport. Nous nous sommes alors focalisés sur l'analyse de la fonction in planta du gène codant le canal potassique (démontré comme étant de type rectifiant sortant) en précisant son patron d'expression par transgenèse et sa fonction par génétique inverse. L'absence d'expression fonctionnelle de ce gène se traduit par la disparition complète du courant potassique voltage-dépendant sortant des cellules de M. truncatula. Les premières analyses indiquent que cette perte de fonction n'inhibe pas la capacité de nodulation de la plante mais l'affecte significativement. Elle impacte également la régulation de l'ouverture stomatique de la plante mais n'a pas d'effet sur la translocation de K+ dans la sève xylémienne racinaire vers les parties aériennes. / The legume-rhizobium symbiosis is of crucial importance in terrestrial ecosystems because it allows the plant to assimilate atmospheric nitrogen. The establishment of the interaction between plant root hairs and their symbiotic bacterial partners relies on complex signaling mechanisms. The earliest detected event, immediately triggered by root hair perception of Nod-factors, is a Ca2+ influx, proton pump inhibition and efflux of Cl- resulting in depolarization of the cell membrane. This depolarization is followed by K+ efflux, allowing repolarization of the cell membrane. The general objective of this work is to identify the molecular mechanisms underlying this electrical signaling by using the legume model Medicago truncatula. In a first step, we identified candidate ion channels and transporters by analyzing the root hair transcriptome obtained by RNA-Seq. Then, several candidate genes (1 member from the CNGC channel family, 1 from the Shaker K+ channel family and 2 from the SLAC anion channel family) were expressed in Xenopus oocytes to check their activity in this heterologous system and determine their functional properties. Then, we focused on the gene encoding the Shaker channel, shown to mediate outwardly-rectifying voltage-gated K+ selective currents. We analyzed its expression pattern using a GUS construct and its function in planta by phenotyping a loss-of-function mutant pant. A first set of experiments has shown that the loss-of-function mutation does not suppress the plant nodulation capacity but significantly depresses it. It also affects the control of stomatal aperture upon water stress but let unchanged K+ secretion into the xylem sap in roots and translocation towards the shoots.

La mise en place des interactions symbiotiques, existant entre les Légumineuses et des microorganismes, sont des processus finement régulés, tant sur le plan moléculaire que cellulaire. Dans le cas de la symbiose avec des bactéries fixatrices d'azote, ou rhizobia, ces modifications se déroulent dans les poils racinaires. Plusieurs arguments tendent à montrer que la perception de contraintes mécaniques pourrait avoir un rôle dans la régulation de ces étapes. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à une famille de protéines impliquées dans la mécanotransduction: les MSL (MscS-Like). Il s'agit de canaux capables de s'ouvrir en réponse à une tension mécanique appliquée sur la membrane plasmique. Nous avons exploré leurs fonctions dans les poils racinaires, lors de la mise en place de la symbiose entre la légumineuse modèle Medicago truncatula et des rhizobia. Des études in silico du génome de M. truncatula nous ont permis de définir la famille des MtMSL. Les analyses de l'expression de ces candidats ont montré que seuls deux d'entre eux sont transcrits dans les poils racinaires: MtMSL2.1 et MtMSL2.4, ce dernier étant majoritaire. Néanmoins, leur expression ne semble pas modifiée par un traitement aux facteurs Nod, molécules bactérienne induisant les premières étapes de la signalisation symbiotique. Parallèlement, des analyses en microscopie confocale, indiquent la présence de MtMSL2.4 à la membrane plasmique et dans des endomembranes. De plus, des mesures électrophysiologiques ont confirmé leur nature de canal à forte conductance activé par la tension de membrane. Enfin, plusieurs analyses phénotypiques ont été menées sur des mutants Mtmsl2.4, tant sur différents aspects de l'interaction avec les rhizobia, que sur la croissance racinaire ou celle des poils racinaires, pour laquelle une méthode de mesure semi-automatique a été développée. Cependant aucune différence avec les contrôles n'a pu être observée. Ces résultats laissent penser que le canal mécanosensible MtMSL2.4 aurait un rôle lors d'autres phénomènes qu'il serait intéressant de découvrir. / The first steps of symbiosis occurring between Legumes and microorganisms are highly regulated processes, both at the molecular level and at the cellular level. During symbiosis with nitrogen fixing bacteria, called rhizobia, these modifications occur in root hairs. Several arguments have shown that mechanical constraints may regulate these steps. Hence, the involvement of physical sensors during these early events is worth considering. We focused here on one of these sensor families, the MSL (MscS-Like). These proteins are channels able to open upon mechanical stretching. We look for their role during first steps of symbiosis between the model Legumes Medicago truncatula and rhizobia. In silico studies of M. truncatula's genome allowed us to define a MtMSL family. Transcript analyses showed that only two of them were expressed in root hairs: MtMSL2.1 and MtMSL2.4, the latter being the most expressed. However, this expression is not modified by Nod factor treatments; molecules produced by rhizobia that induces the first symbiotic signalization steps. In parallel, confocal microscopy analyses show plasma membrane and endomembrane localization of MtMSL2.4. Moreover, electrophysiological measurements confirmed that this candidate is a high conductance channel mechanically activated. Finally, we performed several phenotypical studies with Mtmsl2.4 mutants in different conditions. No differences were observed between the mutants and WT during rhizobia symbiotic interaction and root growth. There were also no differences observed in root hair development, for which a partly automatic measurement system was set up. These results suggest MtMSL2.4 may have a role in other phenomena, which could be interesting to understand further.

L’architecture du système racinaire des légumineuses est déterminée par la croissance des racines et leur capacité à former des racines latérales et des nodosités symbiotiques fixatrices d’azote en fonction des conditions environnementales. Chez la légumineuse modèle Medicago truncatula, nous avons mis en évidence que les phytohormones gibbérellines (GAs) et leur voie de signalisation – médiée par trois protéines MtDELLAs présentant des profils d’expression redondants – jouent un rôle clé dans la régulation du développement du système racinaire. En conditions non-symbiotiques, les GAs régulent négativement la croissance racinaire en réprimant l’activité méristématique et l’élongation cellulaire, et inhibent la formation des racines latérales. En conditions symbiotiques, le rôle des GAs et de leur voie de signalisation est double : au niveau de l’épiderme, les protéines MtDELLAs régulent positivement l’infection par les bactéries symbiotiques Rhizobia en interagissant de façon directe avec la voie de signalisation des facteurs Nod bactériens. Au niveau du cortex, les GAs régulent négativement l’organogénèse des nodosités. Les phytohormones cytokinines (CKs) et leur récepteur MtCRE1 étant essentiels pour initier la nodulation, l’interaction entre les voies de signalisation GA et CK a été analysée en parallèle. Les CKs régulent le niveau de GAs bioactives en modulant l’expression des gènes de leur métabolisme de manière dépendante du récepteur aux CKs MtCRE1. Réciproquement, les GAs régulent les gènes du métabolisme CK et le niveau de CKs bioactives de manière dépendante des MtDELLAs. Par ailleurs, une forme activée de MtDELLA complémente partiellement le phénotype de nodulation du mutant cre1 et lie le promoteur de MtCRE1, indiquant que les voies de signalisation GA et CK régulent la nodulation en étroite association. / Legume root system architecture is determined by both root growth and their ability to form lateral roots and nitrogen-fixing symbiotic nodules, depending on environmental soil conditions. In the model legume Medicago truncatula, we have shown that the phytohormones gibberellins (GAs) and their signaling – involving three MtDELLA proteins with redundant expression patterns – play a crucial role in the regulation of the root system development. In non-symbiotic conditions, GAs negatively regulate root growth through the repression of meristematic activity and cell elongation, and inhibit lateral root formation. In symbiotic conditions, GA and their signaling pathway play a dual role: in the root epidermis, MtDELLA proteins positively regulate infection by symbiotic bacteria Rhizobia, by directly interacting with the bacterial Nod factor signaling pathway. In the root cortex, GAs negatively regulate nodule organogenesis. The phytohormones cytokinins (CKs) and their receptor MtCRE1 being essential for the initiation of nodulation, we additionally analyzed the crosstalk between GA and CK signaling. CKs regulate the bioactive GA pool, controlling the expression of GA-metabolic genes, depending on the MtCRE1 receptor. In turn, GAs regulate CK-metabolic genes and the bioactive CK pool, depending on MtDELLAs. In addition, a dominant version of a MtDELLA partially complements the nodulation phenotype of the cre1 mutant and binds to the MtCRE1 promoter. These results indicate that GA and CK signaling pathways closely interact to regulate nodulation.

Les légumineuses sont capables de s’associer en symbiose avec des bactéries du sol Rhizobium. Cette interaction culmine par la formation d’un nouvel organe racinaire appelé nodule, à l’intérieur duquel les bactéries différentiées fixent l’azote atmosphérique sous une forme assimilable par la plante hôte. La mise en place de cette association repose sur un dialogue moléculaire entre les deux partenaires, faisant intervenir des signaux bactériens lipo-chitooligosaccharidiques appelés Facteurs Nod (FNods). Chez la légumineuse modèle Medicago truncatula, la perception de ces signaux symbiotiques au niveau de l’épiderme racinaire, initie une voie de signalisation qui conduit à des oscillations calciques nécessaires pour l`activation de gènes de la plante hôte, tel le gène marqueur ENOD11. Il a été montré que les facteurs de transcription ERF ERN1/ERN2, étroitement apparentés, agissent comme des activateurs directs de la transcription d’ENOD11, via leur liaison à la séquence cis régulatrice NFbox. Le mutant ern1 est de manière cohérente requis pour l’activation d’ENOD11 en réponse aux FNods mais également au cours des étapes suivantes d’infection et de développement nodulaire. Cependant, ce mutant présente un phénotype symbiotique partiel soulevant la question d’une redondance fonctionnelle, qui pourrait être attribuée à la présence du facteur ERN2, étroitement apparenté. Ainsi, au cours de ma thèse, j’ai étudié la relation fonctionnelle entre les facteurs ERN1/ERN2 par de approches diverses visant à déterminer leur expression et fonctions relatives au cours de la symbiose rhizobienne. Mon travail de thèse a dans tout d’abord porté sur l’étude des profils d’expression spatio-temporels de gènes ERN au cours de la symbiose rhizobienne, corroborée par la dynamique de localisation cellulaire des protéines de fusions ERN. Ces facteurs sont exprimés de manière séquentielle mais aussi conjointe aux cours de la signalisation FNods et l’infection rhizobienne. Par la suite, des expériences de complémentation croisée, dans le fond mutant ern1, ont montré qu’ERN2 peut remplacer ERN1 pour l’induction d’ENOD11 en réponse aux FNods et pour la formation de nodules, dès lors qu’il est exprimé sous le contrôle du promoteur d’ERN1. Ceci indique que ces facteurs ont des activités biologiques similaires et suggère que l’absence de complémentation d’ern1 par le facteur endogène ERN2 est probablement liée à une régulation transcriptionnelle différentielle de la part de leurs promoteurs. Enfin, nous avons initié la caractérisation phénotypique de nouvelles lignées mutées au niveau du gène ERN2, dans le but d’identifier les fonctions spécifiques de ce facteur au cours de la nodulation. A travers l’analyse d’une lignée Tilling (ern2.1) présentant une mutation ponctuelle dans le domaine de liaison à l’ADN, nous avons mis en évidence un rôle d’ERN2 dans la progression des cordons d’infection au niveau du cortex racinaire. Des études moléculaires ont permis de montrer que l’acide aminé muté est un résidu conservé et important pour la topologie du domaine de liaison à l’ADN, mais également pour l’activité transcriptionnelle d’ERN2 sur ENOD11. Contrairement à ern1, le mutants ern2.1 et ern2.2 (mutant d’insertion) sont capables de former des nodules. Néanmoins, l’infection nodulaire apparait dans les deux cas parfois défectueuse, conduisant à une sénescence précoce. Ces résultats démontrent qu’ERN2 remplit aussi des rôles spécifiques au cours de la nodulation, qui ne sont pas entièrement complémentés par ERN1. Il semblerait donc que les facteurs ERN contrôlent des étapes communes et divergentes de l‘infection rhizobienne, ERN1 ayant un rôle prépondérant dans l`initiation et progression de l’infection tandis qu’ERN2 aurait un rôle secondaire, plus centré dans la progression des cordons. La lignée double mutant ern1ern2.1, ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude de la redondance fonctionnelle entre ces deux facteurs au cours des symbioses racinaires / Legumes are able to associate in symbiosis with Rhizobia bacteria in the soil, which culminates in the formation of a new organ referred to as the root nodule, within which differentiated bacteria fix nitrogen to the benefit of the host plant. The establishment of this association relies on a molecular dialogue between the two partners, involving bacterial lipo-chitooligosaccharide signals called Nod factors (NF). In the model legume Medicago truncatula, the perception of these symbiotic signals in the root epidermis, initiates a signaling pathway that leads to calcium oscillation responses required for the activation of downstream genes such as the well-characterized ENOD11. Previously, ERN1 and the closely-related ERN2 transcription factors (TFs) were reported as direct activators of ENOD11 via binding to the NFbox regulatory unit. In addition, phenotypic analysis of the ern1 knockout mutant has confirmed the importance of ERN1 not only during NF signaling but also throughout subsequent infection and nodule development stages. Nevertheless, the ern1 mutant displays a less severe phenotype compared to plants mutated in other NF signaling genes, raising the question of a possible functional redundancy with the endogenous closely-related ERN2 factor. My PhD project was focused on the study of the functional relationship between ERN1 and ERN2 TFs. By using a variety of strategies we aimed at determining both ERN expression profiles and relative functions during nodulation. We first examined the spatio-temporal expression profiles of these genes during rhizobial symbiosis and correlated this with the dynamics of cellular localization of ERN fusion proteins. These analyses revealed that these factors possess both common and distinct expression profiles, correlated with cell-type specific and dynamic in vivo protein accumulation, tightly associated with rhizobial pre-infection and subsequent infection stages in M. truncatula. Further cross-complementation studies in the ern1 mutant background showed that, when ERN2 is expressed under the control of the ERN1 promoter, it can fully restore the ern1 phenotype regarding NF-elicited ENOD11 activation and nodule formation. This indicates that these factors have similar biological activities and suggests that the incapacity of endogenous ERN2 to complement the ern1 mutant is mainly due to differences in their promoter activities. Finally, we also initiated a phenotypic characterization of M. truncatula ern2 mutant lines, in order to get a better insight into ERN2 specific functions during nodulation. The phenotypic analysis of a Tilling line (ern2.1) carrying a point mutation in a conserved amino acid in the ERN2 DNA binding domain, revealed a role for ERN2 during infection thread progression in the root cortex. Further molecular studies demonstrated that this mutated amino acid in the Tilling line is conserved and required for optimal DNA binding domain topology and transcriptional activity of ERN2 on its target ENOD11 gene. In addition, the ern2.1 line and a second ern2.2 insertional mutant line are both capable of forming nodules, in contrast to the ern1 mutant. Nevertheless, these nodules are partly infection defective leading to premature senescence. These findings provide evidence that ERN2 possesses specialized functions during nodulation that cannot be fully complemented by ERN1. This suggests that ERN possess common and divergent functions, ERN1 having a predominant role in rhizobial infection initiation and progression while ERN2 having a secondary and more centered role during infection thread progression. The ern1ern2.1 double mutant line, recently generated during my PhD, opens new perspectives to further study the functional relationship between ERN TFs during root endosymbioses.

Parmi les contraintes abiotiques la salinité est considérée comme un problème majeur, qui affecte le fonctionnement des plantes, en particulier leur croissance et leur rendement. Afin d’étudier le contrôle génétique de la tolérance à la salinité chez Medicago truncatula, plante modèle de la famille des légumineuses, deux expérimentations ont été réalisées. La première expérimentation visait à étudier l’effet de la contrainte saline sur différents paramètres morpho-physiologiques pour un panel de génotypes de M. truncatula afin de déterminer les traits de phénotypage pour la tolérance à la salinité. Les génotypes A17, TN1.11, DZA315.16, A20, TN1.12 et F83005.5 ont été sélectionnés parmi des lignées originaires de différents pays méditerranéens, qui ont été déjà séquencées (http://www1.montpellierinra.fr/BRC-MTR/mauguio/mauguio.php). Les génotypes ont été étudiés sous 6 traitements salins (0, 30, 60, 90,120 et 150 mM NaCl) dans un essai factoriel sous forme de blocs complets aléatoires en trois répétitions. L’analyse de la variance montre des différences significatives entre les niveaux de salinité et une interaction entre les génotypes et les traitements salins concernant la plupart des caractères étudiés. Le génotype « DZA315.16 » présente les valeurs les plus importantes concernant les effets principaux pour les caractères morphologiques alors que « TN1.11 » présente les valeurs les plus faibles. La projection verticale de la surface foliaire de la plante (Leaf Area=LA), significativement corrélée à la biomasse des plantes, apparaît comme un trait d’intérêt pour le phénotypage de la tolérance à la salinité. La concentration saline la mieux adaptée pour démontrer les différences parmi les lignes étudiées se situe entre 90 et 120 mM NaCl. Le génotype « TN1.11 » contrairement à « DZA315.16 » et à « Jemalong-A17 » présente un maintien de la surface foliaire de la plante en réponse à la salinité. Pour la deuxième expérimentation, une population de cent lignées recombinantes (Recombinant Inbred Lines=RILs) produite par le croisement entre « TN1.11 » et « Jemalong-A17 » a été retenue pour l’analyse du contrôle génétique de la tolérance à la salinité. Les RILs ont été développés par la méthode de descendant mono graines (Single Seed descent= SSD) jusqu’ à la génération F6 à l’INP-ENSAT, France. Le plan d’experimentation est « Spli plots » , sous forme de blocs randomisés avec trois répétitions et deux conditions : traitement salin (100 mM NaCl) et témoin (eau). L’expérience a été menée pour déterminer la variabilité génétique et pour identifier les QTLs contrôlant les caractères morphologiques et physiologiques chez la population des lignées recombinantes (RILs). L’analyse de la variance a montré une large variation génétique et une ségrégation transgressive pour les caractères étudiés. La différence entre la moyenne des RILs et la moyenne de leurs parents n’est pas significative concernant tous les caractères étudiés dans les deux conditions, ce qui montre que les RILs utilisées dans notre expérimentation sont représentatives de toutes les lignées recombinantes possibles du croisement « TN1.11 x Jemalong-A17 ». 21 QTLs ont été détectés dans la condition témoin et 19 QTLs ont été identifiés sous contrainte saline (100 mM NaCl). Le pourcentage de la variance phénotypique expliqué par les QTLs varie entre 4.60% et 23.01%. Certains de ces QTLs sont spécifiques à la condition saline, ce qui démontre l’existence du contrôle génétique de la tolérance à la salinité chez M. truncatula ; tandis que les autres ne sont pas spécifiques et contrôlent un même caractère dans les deux conditions. Des QTLs superposés concernant différents caractères ont été aussi observés. Les résultats fournissent des informations importantes en vue de futures analyses fonctionnelles de la tolérance à la salinité chez M.truncatula et pour d’autres espèces voisines. / Among abiotic stresses salinity is considered as a serious problem affecting plant functions especially growth and yield. In order to study the genetic control of salt stress in the model legume Medicago truncatula, two experiments were performed. The first experiment was conducted to study the effect of salt stress on some morpho-physiological parameters in M. truncatula genotypes and to determine the eventual use of some traits as tolerance criteria. Genotypes including A17, TN1.11, DZA315.16, A20, TN1.12 and F83005.5 are selected through a sequenced lines collection (http://www1.montpellierinra.fr/BRC-MTR/mauguio/mauguio.php) which are originated from different Mediterranean countries. Genotypes were studied under 6 salinity treatments (0, 30, 60, 90,120 and 150 mM NaCl) in a factorial design based on randomized complete blocks with three replications. Analysis of variance show significant differences among genotypes, salinity levels and interaction between genotypes and salt treatments for most of studied traits. “DZA315.16” genotype presents the highest main effect values for morphological traits whereas”TN1.11” has low values. Vertically projected leaf area (LA); show the highest variability through all studied salt concentrations. The best concentration to find differences between parental lines is 90 to 120 mM Nacl. A segregating population of recombinant inbred lines (100 RILs) of M.truncatula derived from a cross between TN1.11 and Jemalong-A17 was used for the second experiment. RILs were developed by single-seed descent until F6 generation at the INP-ENSAT, France. The experiment was undertaken to determine the genetic variability and to identify QTLs controlling several traits related to plant growth and physiology, in the population of recombinant inbred lines (RILs). Analyses of variance showed a large genetic variation and transgressive segregation for the traits studied. The difference between the mean of RILs and the mean of their parents was not significant for all of the traits in both conditions, showing that the RILs used in our experiment are representative of the possible recombinant lines from the cross TN1.11 x A17. A total of 21 QTLs were detected under control and 19 QTLs were identified under 100mM salt stress conditions. The percentage of total phenotypic variance explained by the QTLs ranged from 4.60% to 23.01%. Some of the QTLs were specific for one condition, demonstrating that the genetic control of a traits differed under control and salt stress conditions. Some others are non-specific and control a trait in both conditions. Overlapping QTLs for different traits were also observed. The results provide important information for further functional analysis of salt tolerance in M. truncatula

Les Légumineuses ont développé une interaction symbiotique avec des bactéries du sol, les rhizobia, qui fixent l’azote atmosphérique et le transfèrent à la plante sous forme assimilable.Cette interaction a lieu, au sein des nodosités, des organes racinaires où les bactéries intracellulaires se différencient en bactéroïdes. Chez Medicago truncatula, ces bactéroïdes correspondent à un stade de différentiation terminale corrélée à une endoréplication de leur génome, une augmentation de la taille des cellules, une modification des membranes et une faible capacité à se propager. Cette différentiation est induite par des facteurs de la plante appelés NCR (Nodule-specific Cysteine Rich). Les peptides NCRs ressemblent à des défensines, des peptides antimicrobiens ayant une activité antimicrobienne in vitro, tuant des bactéries. Ainsi, un élément clef dans la différenciation des bactéroïdes est la protéine bactérienne BacA, un transporteur membranaire qui confère une résistance contre l’activité antimicrobienne des peptides. Dans le cadre de ce travail de thèse, j’ai montré que l'expression des NCR est soumise à une régulation stricte et qu’ils sont activés dans trois vagues dans les cellules symbiotiques polyploïdes.Les mécanismes de contrôle par la plante sur les rhizobia intracellulaires demeurent à ce jourpeu connus et le seul modèle étudié, au début de ce travail de thèse, restait l'interaction entre M. truncatula et S. meliloti. Je me suis donc intéressée à la symbiose de certaines Légumineuses tropicales du genre Aeschynomene appartenant au clade des Dalbergoïdes où jemontre qu’ils utilisent une classe différente de peptides riches en cystéine (NCR-like) pour induire la différenciation des bactéroïdes. Ce mécanisme est analogue à celui décrit précédemment chez Medicago qui était jusqu'à présent supposé être limitée aux légumineuses appartenant au clade des IRLC. J’ai également montré que Bradyrhizobium, symbionte d’Aeschynomene possèdent un transporteur de type ABC homologues à BacA de Sinorhizobium nommé BclA. Ce gène permet l'importation d'une variété de peptides comprenant des peptides NCR. En l'absence de ce transporteur, les rhizobiums sont incapables de se différencier et de fixer l'azote.Cette étude a permis d'élargir nos connaissances sur l'évolution de la symbiose en montrant qu’au cours de l’évolution, deux clades de Légumineuses relativement éloignés (IRLC et Dalbergoïdes) aient convergé vers l’utilisation de peptides de l’immunité innée afin de contrôler leur symbionte bactérien et d’en tirer un bénéfice maximal au cours de l’interaction symbiotique. / The ability of legumes to acquire sufficient nitrogen from the symbiosis with Rhizobium relies on the intimate contact between the endosymbiotic, intracellular rhizobia, called bacteroids, and their host cells, the symbiotic nodule cells. A well-studied example is the symbiotic nitrogen fixing bacterium Sinorhizobium meliloti, which nodulates the legume Medicago truncatula. Nodules of M. truncatula produce an enormous diversity of peptides called NCRs which are similar to antimicrobial peptides (AMPs) of innate immune systems. These NCRs are involved in maintaining the homeostasis between the host cells in the nodules and the large bacterial population they contain. Although many NCRs are genuine AMPs which kill microbes in vitro, in nodule cells they do not kill the bacteria but induce them into the terminally differentiated bacteroid state involving cell elongation, genome amplification, membrane fragilization and loss of cell division capacity. Protection against the antimicrobial action of NCRs by the bacterial BacA protein is critical for bacteroid survival in the symbiotic cells and thus for symbiosis. As a part of my PhD thesis, I have shown that the differentiation of the symbiotic cells in M. truncatula is associated with a tremendous transcriptional reprogramming involving hundreds of genes, mainly NCR genes, which are only expressed in these cells. Although the extensive work on the model M. truncatula/S. meliloti, little is known how the plant controls its intracellular population and imposes its differentiation into a functional form, the bacteroids in other symbiotic systems.In my PhD work, I provide several independent pieces of evidence to show that tropical legumes of the Aeschynomene genus which belong to the Dalbergoid legume clade use a different class of cysteine rich peptides (NCR-like) to govern bacteroid differentiation. This mechanism is similar to the one previously described in Medicago which was up to now assumed to be restricted to the advanced IRLC legume clade, to which it belongs. I have also shown that the Bradyrhizobium symbionts of Aeschynomene legumes possess a multidrug transporter, named BclA, which mediates the import of a diversity of peptides including NCR peptides. In the absence of this transporter, the rhizobia do not differentiate and do not fix nitrogen. BclA has a transmembrane domain of the same family as the transmembrane domain of the BacA transporter of Rhizobium and Sinorhizobium species which is known to be required in these rhizobia to respond to the NCR peptides of IRLC legumes. Again this is a mechanism which is analogous to the one described in S. meliloti the symbiont of Medicago.This study broaden our knowledge on the evolution of symbiosis by showing that the modus operandi involving peptides derived from innate immunity used by some legumes to keep their intracellular bacterial population under control is more widespread and ancient than previously thought and has been invented by evolution several times.

The nutrient exchange between plant and fungus is the key element of the arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis. The fungus improves the plant’s uptake of mineral nutrients, mainly phosphate, and water, while the plant provides the fungus with photosynthetically assimilated carbohydrates. Still, the knowledge about the mechanisms of the nutrient exchange between the symbiotic partners is very limited. Therefore, transport processes of both, the plant and the fungal partner, are investigated in this study. In order to enhance the understanding of the molecular basis underlying this tight interaction between the roots of Medicago truncatula and the AM fungus Rhizophagus irregularis, genes involved in transport processes of both symbiotic partners are analysed here. The AM-specific regulation and cell-specific expression of potential transporter genes of M. truncatula that were found to be specifically regulated in arbuscule-containing cells and in non-arbusculated cells of mycorrhizal roots was confirmed. A model for the carbon allocation in mycorrhizal roots is suggested, in which carbohydrates are mobilized in non-arbusculated cells and symplastically provided to the arbuscule-containing cells. New insights into the mechanisms of the carbohydrate allocation were gained by the analysis of hexose/H+ symporter MtHxt1 which is regulated in distinct cells of mycorrhizal roots. Metabolite profiling of leaves and roots of a knock-out mutant, hxt1, showed that it indeed does have an impact on the carbohydrate balance in the course of the symbiosis throughout the whole plant, and on the interaction with the fungal partner. The primary metabolite profile of M. truncatula was shown to be altered significantly in response to mycorrhizal colonization. Additionally, molecular mechanisms determining the progress of the interaction in the fungal partner of the AM symbiosis were investigated. The R. irregularis transcriptome in planta and in extraradical tissues gave new insight into genes that are differentially expressed in these two fungal tissues. Over 3200 fungal transcripts with a significantly altered expression level in laser capture microdissection-collected arbuscules compared to extraradical tissues were identified. Among them, six previously unknown specifically regulated potential transporter genes were found. These are likely to play a role in the nutrient exchange between plant and fungus. While the substrates of three potential MFS transporters are as yet unknown, two potential sugar transporters are might play a role in the carbohydrate flow towards the fungal partner. In summary, this study provides new insights into transport processes between plant and fungus in the course of the AM symbiosis, analysing M. truncatula on the transcript and metabolite level, and provides a dataset of the R. irregularis transcriptome in planta, providing a high amount of new information for future works. / In der arbuskulären Mykorrhiza (AM) Symbiose werden die Wurzeln fast aller Landpflanzen von Pilzen der Abteilung Glomeromycota besiedelt. Der Pilz erleichtert der Pflanze die Aufnahme von Mineralien, hauptsächlich Phosphat, und Wasser. Im Gegenzug versorgt die Pflanze ihn mit Photoassimilaten. Trotz der zentralen Bedeutung der Austauschmechanismen zwischen Pilz und Pflanze ist nur wenig darüber bekannt. Um die molekularen Grundlagen der Interaktion zwischen den Wurzeln der Leguminose Medicago truncatula und dem arbuskulären Mykorrhizapilz Rhizophagus irregularis besser zu verstehen, werden hier die Transportprozesse, die zwischen den Symbiosepartnern ablaufen, näher untersucht. Die zellspezifische Regulation der Transkription potentieller M. truncatula Transporter Gene in arbuskelhaltigen und nicht-arbuskelhaltigen Zellen mykorrhizierter Wurzeln wird bestätigt. Ein Modell zur möglichen Verteilung von Kohlenhydraten in mykorrhizierten Wurzeln, nach dem Zucker in nicht-arbuskelhaltigen Zellen mobilisiert und symplastisch an arbuskelhaltige Zellen abgegeben werden, wird vorgestellt. Die Analyse eines Mykorrhiza-induzierten Hexose/H+ Symporter Gens, MtHxt1, liefert neue Einsichten in die Mechanismen der Kohlenhydratverteilung in mykorrhizierten Pflanzen. Metabolitanalysen von Wurzeln und Blättern einer knock-out Mutante dieses Gens zeigen dessen Einfluss auf den Kohlenhydrathaushalt der ganzen Pflanze und auf die Interaktion mit dem Pilz. Die Metabolitzusammensetzung von M. truncatula wird durch die Mykorrhiza Symbiose signifikant beeinflusst. Darüber hinaus werden durch Transkriptomanalysen die molekularen Grundlagen der AM Symbiose auf der Seite des Pilzes analysiert. Arbuskeln wurden mittels Laser Capture Mikrodissektion direkt aus mykorrhizierten Wurzeln isoliert. Über 3200 pilzliche Transkripte weisen in diesen Arbuskeln im Vergleich zu extraradikalen Geweben ein deutlich verändertes Expressionslevel auf. Unter diesen Transkripten sind auch sechs zuvor unbekannte Gene, die für potentielle Transporter codieren und mit großer Wahrscheinlichkeit eine Rolle im Nährstoffaustausch zwischen Pilz und Pflanze spielen. Während die Substrate von drei potentiellen MFS Transportern noch unbekannt sind, spielen zwei potentiellen Zuckertransporter möglicherweise eine Rolle im Transport von Kohlenhydraten in Richtung des Pilzes. Zusammengefasst bietet diese Arbeit neue Einsichten in Transportprozesse zwischen Pilz und Pflanze im Laufe der AM Symbiose. M. truncatula Transkript- und Metabolitlevel werden analysiert und die Transkriptomanalyse von R. irregularis liefert einen umfassenden Datensatz mit einer großen Menge an Informationen zu der noch unzureichend erforschten pilzlichen Seite der Symbiose für folgende Arbeiten.

Medicago truncatula est une Légumineuse établissant une interaction symbiotique avec une bactérie tellurique de la famille des Rhizobiacées, Sinorhizobium meliloti. Cette interaction induit l’organogénèse racinaire d’un nouvel organe, la nodosité dans laquelle s’établit un microenvironnement propice à la différenciation de S. meliloti en bactéroïde fixateur du diazote atmosphérique. Ce dernier réduit ainsi le N2 atmosphérique en ammonium, assimilé ensuite par la plante hôte. Cette réduction étant très endergonique M. truncatula fournit aux bactéroïdes des substrats carbonés issus de la photosynthèse. Cependant, cette interaction n’est pas pérenne, du fait de la mise en place d’un processus de sénescence ; processus conduisant à la lyse des bactéroïdes et des cellules hôtes végétales. Cependant, à l’heure actuelle, ce processus de rupture symbiotique reste largement méconnu. Afin de mieux caractériser ce processus de sénescence, nous avons développé de nouveaux outils cytologiques permettant par microscopie confocale de suivre in vivo la viabilité, mais également le fonctionnement des bactéroïdes au sein de la cellule hôte végétale. Ces nouvelles approches cytologiques pourraient ainsi offrir de nouvelles perspectives pour une caractérisation plus précise du déroulement du processus de sénescence nodositaire. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons également cherché à déterminer l’implication de deux cystéines protéases dans la mise en place du processus de sénescence nodositaire. Une des caractéristiques de ce processus de sénescence est une hausse de l’activité protéolytique, notamment des activités cystéine protéases. L’analyse transcriptomique par cDNA-AFLP du processus de sénescence nodositaire (Van de Velde et al. 2006) a pu mettre en évidence 508 gènes différentiellement exprimés dont deux cystéines protéases, MtCP6 et MtVPE. L’analyse spatio-temporelle de MtCP6 et MtVPE, par fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS, a permis de mettre en évidence l’induction de ces deux gènes lors du processus de sénescence nodositaire aussi bien développementale qu’induit par un traitement abiotique ou lors d’une interaction symbiotique non efficace. De plus, nous avons pu démontrer, par génétique inverse, que la diminution de l’expression de ces deux protéases retarde la mise en place du processus de sénescence, alors que leur expression précoce conduit à la promouvoir. Enfin, l’étude par microscopie confocale de la localisation subcellulaire de ces protéases par fusion traductionnelle avec la GFP, démontre leur adressage aux bactéroïdes. Nos données tendent donc à démontrer le rôle clef de MtCP6 et de MtVPE dans le processus de sénescence nodositaire, où ces protéases pourraient participer directement au déclenchement d’une dégradation des bactéroïdes. / Medicago truncatula is a leguminous plant establishing a symbiotic interaction with the bacteria Sinorhizobium meliloti. This symbiosis leads to the de novo development of root nodules involved in biological nitrogen fixation. However, this symbiotic interaction is time limited and an early senescence appears in mature nodule entailing the formation of a senescence zone (zone IV). This degradation process occurs earlier in comparison to senescence of the whole plant. During nodule developmental senescence of plant host cells, a gradual degradation process induces a loss of vacuole and peribacteroid membrane (PBM). But this nodule degradation process still remains to be unravelled. To increase our understanding of the nodule senescence process, we developed new cytologic tools allowing an in vivo assessment of the viability and functioning of bacteroids within plant host cells. Therefore, these new tools provide a new insight of the nodule senescence process which may help for a finer characterization of the nodule senescence. In the M. truncatula model, a previous cDNA-AFLP analysis enlightens an upregulation of several cysteine proteinases during the transition from nitrogen fixing nodule to a senescent one; including an early expression of an SPG31-like peptidase known to be involved in leaf senescence (MtCP6) and a Vacuolar Processing Enzyme described as a plant caspase-like protein (MtVPE) involved in mechanisms similar to hypersensitive response in A. thaliana. In planta spatiotemporal analysis of the expression of these two cysteine proteinases using promoter:reporter gene GUS confirmed their expression during natural senescence at the junction between the nitrogen fixing zone (zone III) and the senescence zone (zone IV). Therefore, to acquire a better insight into the role of these cysteine proteases during the senescence program, we knocked down by RNAi the expression of each gene specifically at the interzone III-IV. Depletion of these transcripts induced a drastic increased of N2 fixation and nodule size. Conversely, overexpression of both genes in the zone III of nodule leads to an extension of the senescence zone. Confocal microscopy images of protein:GFP fusions showed that both proteinases are addressed to bacteroids within plant host cells. Our data revealed that MtCP6 and MtVPE are key players of the nodule senescence process and may be directly involved in symbiosome degradation.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_carlos_guilherme_trombetta.pdf: 330167 bytes, checksum: 5a38bcc52578770096c0de7f2e2e8078 (MD5) Previous issue date: 2013-12-02 / The Brazilian agriculture, in order to achieve high levels of mass production on pastures, requires a prior planning in its installation, which is very important, because only then it will be possible to obtain fields without invasive plants and seeds, showing high force, appropriate germination and establishment in shortest possible time for the vegetative canopy. Among the problems faced for the appropriate installation of a pasture are the low quality of seed in purity and germination, as well as the presence of invasive weeds and the low force associate of seeds. On this base, the main objective of this research is to evaluate the physiological quality of the seeds of genus Brachiaria and Medicago, as well as the reply to the different managements proposed in order to overcome the dormancy. Three studies were performed: the first evaluated the physical and physiological quality, and vegetative growth in five different lots of Brachiaria brizantha cv. BRS Piatã, evaluating the reply to the stimulus of overcoming the dormancy and different tests of the evaluation of force, with the objective of evaluating the consistent observations to purity and germination expressed in different lots. The results disclosed that most of the lots show the minimum purity and they are in agreement to the laws, however expressing low crop value. The association with high temperature and cold stress potentiated in some lots the germination, with significant increase for the association to potassium nitrate for germination and force in many observations. The second study consisted on the study of seeds of Medicago spontaneously naturalized in the state of Rio Grande do Sul, to which proceeded the consistent evaluations of physiological quality of seeds, with the objective to analyze different methods of overcoming dormancy in seeds with coloring and time of contrasting storage and to infer the influence on physiological attributes related to seed force of alfalfa. The treatments used differed from the witness expressing that the species is responsive to treatments used, with the highest averages found to germination in treatments that use manual sandpaper, with the dark coloring showing higher germination than clear coloring in certain treatments. The third study consisted on the physiological quality and growth analysis in field conditions, for four commercial species of genus Brachiaria and one of genus Medicago in search of undertake analysis and identification of the materials with better performance in the establishment of vegetative canopy in conditions in the northern region of Rio Grande do Sul. The low perceptual of physiological quality of forage seeds found in this study shows the need to increase the research to identify genotypes with good force of germination index, to attend the growing demand of the farmer sector. The seeds of genus Brachiaria and Medicago can express high level of dormancy, harming the minimum quality standards required, save exceptions that reached above the minimum establishment standards, being the final consumer the responsible for requiring quality seeds. / A agropecuária brasileira, para alcançar altos níveis de produção de massa nas pastagens, necessita de um planejamento prévio em sua instalação, o que é de fundamental importância, pois só assim será possível obter campos livres de invasores e sementes apresentando alto vigor, adequada germinação e estabelecimento em menor tempo possível do dossel vegetativo. Dentre os problemas enfrentados para a instalação adequada de uma pastagem, esta a baixa qualidade de sementes em pureza e germinação, bem como a presença de plantas daninhas invasores e o baixo vigor associado às sementes. Com base nisto, esta pesquisa teve como objetivo geral avaliar a qualidade fisiológica das sementes pertencentes ao gênero Brachiaria e Medicago, assim como a resposta aos diferentes manejos de superação de dormência propostos. Foram realizados três trabalhos: o primeiro tratou de avaliar a qualidade física, fisiológica e crescimento vegetativo de cinco distintos lotes de Brachiaria brizantha cv. BRS Piatã, avaliando a resposta a estímulos de superação de dormência e diferentes testes de avaliação do vigor, com o objetivo de avaliar as observações condizentes a pureza e expressão de germinação de distintos lotes. Os resultados revelaram que a maioria dos lotes apresenta pureza mínima e está de acordo com a legislação, entretanto, expressando baixo valor cultural. A associação com altas temperaturas e estresse por frio potencializou em alguns lotes a germinação, com aumento significativo para a associação com nitrato de potássio condizente para a germinação e vigor em grande número de observações. O segundo trabalho condiz com o estudo de sementes de um acesso de Medicago naturalizado espontaneamente no estado do Rio Grande do Sul, ao qual procederam as avaliações condizentes à qualidade fisiológica das sementes, com o objetivo de analisar diferentes métodos de superação de dormência em sementes com colorações e tempo de armazenamento contrastante, e inferir sobre a influencia em atributos fisiológicos relacionado ao vigor das sementes de alfafinha. Os tratamentos utilizados diferiram da testemunha, expressando que a espécie é responsiva aos tratamentos utilizados, com as maiores médias encontradas para germinação em tratamentos que utilizaram lixa manual, com a coloração escura apresentando germinação maior que a clara em determinados tratamentos.O terceiro trabalho condiz com a qualidade fisiológica e análise de crescimento em condições de campo, para quatro espécies comerciais do gênero Brachiaria e uma do gênero Medicago na busca de proceder a análise e identificação dos materiais com melhor desempenho de estabelecimento de dossel vegetativo nas condições da região do norte do Rio Grande do Sul. Os baixos percentuais da qualidade fisiológica das sementes forrageiras encontradas neste estudo demonstram que é necessário ampliar as pesquisas para identificação de genótipos com bom índice de vigor e germinação, para atender a crescente demanda do setor pecuarista. As sementes do gênero Brachiaria e Medicago podem vir a expressar altos níveis de dormência, prejudicando os padrões mínimos de qualidade exigida, salvas as exceções que alcançam padrões superiores aos mínimos estabelecidos, cabendo ao consumidor final exigir sementes de qualidade.

Dans un contexte actuel qui tend vers une réduction d’intrants dans les systèmes de culture et une relance de la production de protéines végétales pour réduire la dépendance alimentaire de la France, la culture des légumineuses constitue une alternative. Les légumineuses à graines offrent une source riche en protéines pour l’alimentation animale et humaine. Au sein de l'UMR1347 Agroécologie, le pôle "déterminismes Génétiques et Environnementaux de l’Adaptation des Plantes à des Systèmes de culture Innovants" (GEAPSI) étudie via une approche multidisciplinaire (génétique, écophysiologie, physiologie moléculaire) l’adaptation des espèces végétales, et notamment des légumineuses aux contraintes environnementales. Ces travaux de thèse ont été réalisés au sein de l'équipe "Étude des Mécanismes Moléculaires" qui s'intéresse plus particulièrement à des critères de qualité de la graine (teneur en protéine, taille de graine) et au déterminisme génétique de ces caractères chez la plante modèle Medicago truncatula en vue d'un transfert de connaissances vers l'espèce cible Pisum sativum. Chez les légumineuses, la taille de la graine est déterminée par la capacité de l’embryon à se diviser lors de l’embryogenèse et à accumuler des réserves lors du remplissage. Aux stades précoces du développement, l’assimilation de nutriments est réalisée majoritairement par les tissus qui entourent l’embryon: l’albumen et le tégument. Les recherches menées visent à évaluer la contribution de l’albumen dans le développement de la graine chez M. truncatula. Nous avons révélé plusieurs gènes DOF (DNA-binding with One zinc Finger) comme étant exprimé dans ce tissu. Ils appartiennent à une large famille de facteurs de transcription impliqués dans de nombreux processus biologiques mais dont les rôles restent à préciser. Un de ces gènes, nommé DASH pour Dof Affecting Seed embryogenesis and Hormone metabolism, est exprimé préférentiellement dans l’albumen lors de l’embryogenèse. Des mutants TILLING et Tnt-1 isolés pour ce facteur de transcription sont affectés dans le développement de la graine (avortement à environ 10 jap). La cytologie du développement aux stades précoces (6 à 10 jap) a révélé que l’expression de ce gène dans l’albumen est requise pour un développement normal de l’embryon, démontrant le rôle de l’albumen dans le contrôle de l’embryogenèse chez les légumineuses. Une étude comparative du transcriptome des gousses de dash vs sauvage a permis d’émettre des hypothèses quant à la fonction du gène DASH. Une dérégulation du métabolisme hormonal, en particulier de l’auxine, a été mise en évidence et plusieurs gènes cibles potentiels de ce facteur de transcription ont été sélectionnés. Une comparaison du transcriptome des trois tissus de la graine à 12 jap a été réalisée chez la lignée sauvage de référence (Jemalong, A17). Elle a permis de préciser la localisation tissulaire de ces gènes cibles putatifs, de mettre en évidence des voies métaboliques plus spécifiques de l’albumen et de proposer des hypothèses quant à la fonction de ce tissu dans le développement de la graine. / In the current context, which necessitates a reduction in inputs in crop systems and boosting of production of plant proteins to reduce France’s dependency on feed imports,, growing legumes represents an alternative. Grain legumes are major sources of proteins for animal and human nutrition. In the UMR1347 Agroécologie, the objectives of the study group "déterminismes Génétiques et Environnementaux de l’Adaptation des Plantes à des Systèmes de culture Innovants" (GEAPSI) are to promote legume cultivation and adaptation to environmental stresses, via multidisciplinary approaches (genetics, ecophysiology, molecular physiology). This thesis project was carried out in the "Étude des Mécanismes Moléculaires" team, particularly interested in seed quality traits such as protein content or seed size and identification of genes implicated in variations of these trait s. Experiments were performed using Medicago truncatula as a model species for legumes with a view to transferring the information to the target crop species Pisum sativum.Legume seed size is determined by the embryo’s capacity to divide during embryogenesis and to accumulate reserves during seed filling. At early developmental stages, nutrient assimilation occurs predominantly in embryo-surrounding tissues: the endosperm and seed coat. This thesis project aims to evaluate the endosperm contribution to seed development in M. truncatula. We have shown several DOF (DNA-binding One Zinc Finger) genes to be expressed in this tissue. They belong to a large family of transcription factors implicated in numerous biological processes, but whose role remain to be elucidated. One of these genes, termed DASH for Dof Affecting Seed embryogenesis and Hormone metabolism, is expressed preferentially in the endosperm during embryogenesis. TILLING and TnT1 mutants isolated for this transcription factor are affected in seed development (abortion at 10 DAP). The cytology of development at early stages (6 to 10 DAP) revealed that the expression of this gene in the endosperm is required for the normal development of the embryo, demonstrating the role of the endosperm in the control of embryogenesis in legumes. A comparative transcriptomics study of dash vs wild-type pods allowed us to suggest hypothesis about the function of the DASH gene. Evidence for a deregulation of hormone metabolism, in particular for auxin, was obtained, and several potential target genes of this transcription factor were selected. A comparison of the transcriptome of the three tissues of the seed at 12 DAP was carried out for the reference wild-type line (Jemalong A17). This allowed the tissue localization of the target genes, to reveal metabolic pathways preferentially expressed in the endosperm, and to propose hypotheses about the role of this tissue during seed development.