Orientador: Sara T. Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T12:14:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pranke_PatriciaHelenaLucas_M.pdf: 3795822 bytes, checksum: fba966483775191a766c241619c01e17 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: No presente trabalho foram analisados 10 pacientes com EIH e seus familiares através do estudo das proteínas totais em SDS-P AGE (Sistema Fairbanks 3,5-17% e Sistema Laemmli 12%), estudo da auto-associação de heterodímeros de espectrina e digestão tríptica da espectrina. Seis destas famílias apresentaram defeito na auto-associação dos heterodímeros de espectrina, sendo dois casos de Sp a 1150-46, três famílias com Sp a 1165e uma família com uma ß-espectrina encurtada, conforme evidenciado por técnica de westem-blotting com anticorpo anti-ß espectrina. Numa das famílias com Sp a 1165, um dos pacientes apresentou também uma ß-espectrina alongada, mas esta associação não determinou maior gravidade da doença ou aumento dos dímeros de espectrina. Uma família e um paciente apresentaram deficiência de proteína 4.1 e em dois casos não foi possível detectar, pela metodologia empregada, o defeito proteico. Nos pacientes Sp a 1165 kDa a pesquisa de heteroduplex após a amplificação do exon 4 do DNA genômico da cadeia alfa da espectrina demonstrou o aparecimento de uma banda com migração retardada nas três famílias estudadas sugerindo a duplicação do codon TTG. Em uma paciente Sp a 1150-46 kDa o sequenciamento do exon 6 da cadeia a-sp mostrou uma mutação de ponto CTG leu -+ CCG pro em um alelo no codon 260. Este é o primeiro estudo das alterações proteicas da ElH na população brasileira. A ß-espectrina alongada observada neste trabalho é o segundo caso descrito na literatura enquanto que a ß-espectrina "truncada" é, provavelmente, a menor ß-sp já descrita. O estudo da auto-associação dos heterodíineros de espectrina foi também levado a efeito em 26 pacientes com doenças cujo aparecimento de eliptócitos no esfregaço de sangue periférico era freqüente (7 LMC, 6 mielofibrose, 5 anemia ferropriva, 3 anemia megaloblástica e 5 anemia falciforme). Destes, um paciente com LMC apresentou aumento de dímeros de espectrina sugerindo, neste caso, um prejuízo na auto-associação de heterodímeros de espectrina / Abstract: The aim of this work was to study the protein defects in Hereditary Elliptocytosis (HE) in a brazilian population and to analyse the self-association of spectrin in patients without HE whose elliptocytes are frequently observed. Red cell membrane of ten patients with HE and their rei atives were investigated by SDS-PAGE (Fairbanks' system 3,5-17% and Laemmli's system 12%), by non denaturing gels for spectrin heterodimer self-association study and by the tryptic digestion of spectrin. Six families presented a defect in the spectrin self-association: two had Sp a I/50-46, three with Sp a I/65 and one with a "truncated" ß-spectrin as observed by westem-blotting using anti-ß espectrin antibody. In one family with Sp a I/65, one patient presented also a elongated ß-espectrin but this association did not increase the amount of spectrin dimers or the clinical severity of the disease. One family and one patient presented a deficiency of protein 4.1 and in two families, the protein defect was not detected by the approach used in this study.In the Sp a I/65 kDa patients, the analysis of heteroduplex after amplification of exon 4 of the genomic DNA for the a-spectrin chain revealed the appearance of a slower migrating band in the three families studied suggesting the duplication of codon TTG. In one patient with Sp a I/50-46 kDa the sequencing of exon 6 of the a-sp chain showed a point mutation CTG leu - CCG pro in an allele in codon 260. As far as we know, this is the first study of red cell membrane in hereditary elliptocytosis in a brazilian population. The elongated ß -spectrin observed in this study is the second case described in the literature and the truncated ß-spectrin probably corresponds to the smaller ß-sp already described.The study of the spectrin heterodimer self-association was also performed in 26 patients with diseases in which elliptocytes are frequently observed in peripheral blood smears (7 CML, 6 myelofibrosis, 5 iron deficiency anemia, 3 megaloblastic anemia and 5 sickle cell disease). Only one patient with CML had increased IeveIs of the spectrin dimer, which suggested a defect in the spectrin heterodimer self-association / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Estágio realizado na CUF - Químicos Industriais e orientado pelo Doutor Paulo Alexandre Pereira Araújo / Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2010

Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

El trasplante de membrana amniótica (TMA) ha demostrado en los últimos años ser eficaz en el tratamiento de distintas patologías de la superficie ocular. Sin embargo, los trabajos publicados recogen series cortas de pacientes y con periodos de seguimiento breves. Hemos analizado los resultados obtenidos en todos los casos intervenidos por el autor mediante TMA durante los años 1999 y 2000, incluyendo estudios histológicos tras el trasplante en algunos de los receptores.El primer trabajo analiza los resultados obtenidos con el TMA en 53 casos de patología corneal y conjuntival, utilizando distintas formas de implante y con un periodo de seguimiento medio de 32 meses (rango 24-48 meses). Tras la resección de lesiones conjuntivales extensas el injerto de membrana amniótica (MA) consiguió la epitelización completa, con mínima formación de cicatrices residuales, en el 100% de los casos. En las úlceras corneales tróficas, degeneraciones estromales cálcicas, y los defectos epiteliales el TMA se mostró como un procedimiento terapéutico eficaz y una alternativa quirúrgica útil en aquellos casos en los que el tratamiento médico fracasa. Los resultados obtenidos fueron estables durante el periodo de seguimiento realizado. En ninguno de los casos intervenidos se observaron complicaciones intraoperatorias ni postoperatorias. En el segundo trabajo se analiza la eficacia y seguridad del recubrimiento con MA en el tratamiento de los defectos epiteliales persistentes sin respuesta al tratamiento médico. El recubrimiento con MA se mostró muy eficaz cuando el implante se mantuvo en la superficie corneal durante dos o más semanas, siendo el principal problema en estos pacientes el desprendimiento precoz de la membrana. De entre los distintos tipos de implante ensayados el recubrimiento de la córnea asociado a una lente de contacto terapéutica fue el que mantuvo durante más tiempo el implante. En el tercer estudio se describen los hallazgos histológicos encontrados tras el injerto de membrana amniótica en la córnea de dos pacientes que varios meses después del TMA precisaron de un trasplante de córnea. En ambos casos la membrana amniótica consiguió una epitelización completa y de características histológicas normales y, tras su reabsorción, el espacio ocupado inicialmente por la membrana fue sustituido por un estroma neoformado de características fibróticas. En la córnea avascular no se evidenció ningún tipo de reacción inflamatoria ni de rechazo alrededor del injerto y el proceso de reabsorción fue lento, probablemente a expensas de los queratocitos activados. En presencia de neovascularización estromal y de inflamación crónica subyacente la reabsorción se produjo de manera más rápida por la abundante presencia de células inflamatorias en la zona. En el cuarto trabajo se demuestra como el injerto de MA puede conseguir la regeneración de zonas extensas de conjuntiva incluso sobre un lecho escleral severamente isquémico. / In recent years amniotic membrane transplantation (AMT) has shown to be effective in the treatment of different patologies of the ocular surface. Nevertheless, the published articles usually consist of short series of patients with brief follow-up periods. We have reviewed the results obtained in all the cases operated on by the author with AMT during the year 1999 and 2000, including histological studies after the transplantation in some of the patients.The first paper analyzes the results obtained with the AMT in 53 cases of corneal and conjuntival pathology, using different forms of implantation with a mean follow-up of 32 months (range 24-48 months). After the resection of extensive conjunctival lesions the amniotic membrane (AM) graft achieved complete epithelialization, with minimal scarring, in 100 % of the cases. In the eyes with neurotrophic corneal ulcer, calcific degeneration, and persistent epithelial defects, the AMT appears to be an effective procedure and represents an aditional therapeutic alternative when conservative medical treatments fail. The obtained results were stable during the follow-up period. No intraoperative or postoperative complications ocurred in any of the 53 cases operated.The second paper analyzes the efficacy and safety of the AM patch in the treatment of persistent epithelial defects without response to the medical treatment. The AM patch proved to be effective when the implant was maintained on the corneal surface for two or more weeks, being the main problem in these patients the early detachment of the membrane. Among the different types of implantation tested, the technic of covering the entire cornea associated with a therapeutic contact lens achieved longer duration of the AM.The third study describes the histopathologic findings in the cornea of two patients who required a corneal transplantation several months after an AM graft. In both cases a complete epithelialization was observed over the basement membrane of the AM. In the cornea with avascular stroma no inflammatory reaction or graft rejection was seen. In this case the process of reabsorption was slow, probably at the expense of the activated keratocytes. In the cornea with stromal neovascularization the AM was rapidly reabsorbed because of the presence of abundant inflammatory cells. Once reabsorbed, the AM was replaced by a new fibrotic stroma, which was different to that found in the rest of the cornea but which helped to maintain corneal thickness.The fourth paper demonstrates that AM graft can be useful even in the regeneration of conjunctiva over large areas of ischemic sclera.

Orientador: Deilson Elgui Oliveira / Resumo: Durante processos patológicos como o câncer, a atividade migratória de células neoplásicas aumenta, sendo um passo crítico para a disseminação dessas células a órgãos distantes. O processo migratório dessas células depende da formação de protrusões citoplasmáticas chamadas invadopódios, através da nucleação e polimerização de actina e degradação da matriz extracelular (MEC). A MEC é uma rede complexa de proteínas que fornece sustentação e moléculas sinalizadoras responsáveis pela homeostase dos tecidos. Dentre essas proteínas, a fibronectina (FN) é uma glicoproteína multiadesiva fundamental no comportamento celular normal e apresenta-se aumentada no tecido tumoral. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a influência da FN, isolada ou em associação com componentes da membrana basal, no processo migratório de células tumorais prostáticas, com ênfase no mecanismo de formação dos invadopódios. Para isso, as linhagens celulares LNCaP e PC-3 foram divididas nos seguintes grupos experimentais: Controle, FN solúvel (10µg/mL), FN coating (10µg/mL), FN+Geltrex e Geltrex com exposição aos componentes por 4 dias. Nas células LNCaP, foi possível observar alterações morfológicas dos grupos expostos a FN (solúvel, coating e em associação com Geltrex) com diminuição na área celular em comparação ao grupo controle. A proliferação celular aumentou nos grupos com recobrimento da superfície (FN coating, FN+Geltrex e Geltrex). Também foi possível observar a diminuição na taxa de motilidade dess... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: During pathological processes like cancer, the migratory activity of neoplasic cells increases, being a critical step for the dissemination of these cells to distant organs. The migratory process depends on the formation of cytoplasmic protrusions called invadopodia, through actin polymerization and extracellular matrix degradation (ECM). ECM is a complex protein network that provides support and molecules responsible for tissue homeostasis. Among these proteins, fibronectin (FN) is an essential adhesive glycoprotein in normal conditions however, is unregulated in tumor tissue. The objective of this study was to evaluate the influence of FN, alone or in association with basement membrane (BM) components, within migratory process of prostatic tumor cells, with emphasis on the mechanism of invadopodia. For this, the LNCaP and PC-3 cell lines were divided into the following experimental groups: Control, FN soluble (10μg / mL), FN coating (10μg / mL), FN + Geltrex and Geltrex. Exposure time was established into 4 days. We could observe morphological alterations of the groups exposed to FN in LNCaP cells, with a decrease in the cellular area in comparison to the control group. Cell proliferation was increased in the groups with surface coating (FN coating, FN + Geltrex and Geltrex). It was also possible to observe a decrease in the motility rate of these cells in all the exposed groups. Key proteins expression important to invadopodia formation (Cortactin, Dynamin-2 and Actin-F) w... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os tripomastigotas metacíclicos de Trypanosoma cruz; expressam as glicoproteínas de superfícies GP82 e GP90 de maneira estágio-específica, as quais estão implicadas na invasão da célula hospedeira. Embora as proteínas não sejam expressam e os RNAm GP82 e GP90 fracamente detectáveis em epimastigotas, ensaios de transcrição em núcleos isolados mostraram que eles são transcritos constitutivamente nos dois estágios. Este resultado indica que o acúmulo de transcritos nas formas metacíclicas não é devido a um aumento na transcrição dos genes GP82 e GP90. Para investigar se a estabilidade dos RNAm seria a responsável pelas diferenças nos níveis destes RNAm, parasitas foram tratados com actinomicina D ou cicloheximida. Quando tratados com actinomicina D, as meia-vidas dos transcritos GP82 e GP90 foram maiores que 8 h em tripomastigotas metacíclicos e menor que 0,5 h e 2 h em epimastigotas, respectivamente. Na presença de cicloheximida, os níveis de RNAm GP82 e GP90 caíram levemente, enquanto que em epimastigotas os níveis destes RNAm aumentaram após 8 h de tratamento. Este efeito sugere um mecanismo de estabilização atuando em tripomastigotas metacíclicos e de desestabilização em epimastigotas, os quais parecem ser mediados por elementos presentes na 3' -UTR destes transcritos. Nós mostramos que a 3'-UTR da GP82 gera uma expressão maior do gene repórter GFP em tripomastigotas metacíclicos do que em epimastigotas. Consistente com este achado, análises de "northern blot" mostram que os RNAm GP82 e GP90 são mobilizados para os polissomas e conseqüentemente traduzidos apenas em tripomastigotas metacíclicos. Estes resultados sugerem que a estabilidade destes RNAm envolve interações com elementos regulatórios positivos e negativos na 3' -UTR. Estudos para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na estabilidade dos RNAm GP82 e GP90 estão em progresso em nosso laboratório. / Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes express the developmentally regulated GP82 and GP90 glycoproteins, which are implicated in host cell invasion. Although GP82 and GP90 mRNAs and proteins are not present and the mRNAs barely detectable in epimastigotes, nuclear run-on analysis showed that they are transcribed in both stages. This result indicates that accumulation of transcripts in metacyclic forms is not due to increased transcription of the GP82 and GP90 genes. To investigate whether mRNA stability may be responsible for the differences in the steady-state levels of these mRNAs, parasites were treated with actinomycin D or cycloheximide. When treated with actinomycin D, the half-lives estimated for GP82 and GP90 transcripts were longer than 8 h in metacyclic trypomastigotes and less than 0.5 h and 2 hours in epimastigotes, respectively. In the presence of cycloheximide, the levels of GP90 and GP82 mRNA decayed slightly after 8 h in metacyclic trypomastigotes, whereas in epimastigotes the levels of these mRNAs increased. This effect suggests a stabilizing mechanism acting in metacyclic trypomastigotes and a destabilizing mechanism in epimastigotes which could be mediated by an element present in the 3’-UTR of the transcripts. We show that the 3’-UTR of GP82 causes higher expression of the green fluorescent protein reporter gene in metacyclic trypomastigotes than in epimastigotes. Consistent with this finding, northern blot analysis showed that GP82 and GP90 mRNAs were mobilized to polysomes and consequently translated, but only in metacyclic trypomastigotes. These results suggest that the stability of these mRNAs involves interactions between positive and negative regulatory elements in the 3’-UTR. Work is ongoing to better understanding the mechanisms involved in changes in GP82 and GP90 mRNA stability. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-03-10T13:16:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 jose_correa_ioc_dout_2007.pdf: 7604915 bytes, checksum: 254c899732de570995b8f8b6f7061ca5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Endocitose em células eucarióticas é o processo de internalização de macromoléculas por diferentes vias, com diversas proteínas associadas, através do brotamento de vesículas na membrana plasmática e endereçamento destas vesículas a compartimentos endosomais no citoplasma. Os tripanosomatídeos são protozoários flagelados patogênicos de grande importância médica e veterinária que apresentam diferentes formas adaptativas ao longo de seu ciclo de vida. Estes parasitas estão estruturalmente organizados dentro de um arcabouço de microtúbulos subpeliculares, o que dificulta invaginações de membrana na maior parte do corpo celular. Entretanto, este arcabouço é descontinuado na região da bolsa flagelar, de onde o flagelo emerge do corpo. Formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi apresentam além da bolsa flagelar uma segunda invaginação de membrana, o citóstoma/citofaringe, uma estrutura sustentada por microtúbulos especializados que participa ativamente no processo de endocitose. Esta tese teve por objetivo investigar as vias endocíticas presentes nos dois sítios competentes para a captação de nutrientes (bolsa flagelar e citóstoma) de epimastigotas de T. cruzi. Após incubação dos parasitas a 4oC ou 28oC com albumina, transferrina e LDL conjugadas a ouro coloidal e posterior processamento para microscopia eletrônica de transmissão (MET), foram observadas vesículas endocíticas revestidas brotando da bolsa flagelar. Análise do conteúdo protéico dos protozoários detectou a expressão de clatrina, confirmada por citometria de fluxo e análise in silico da base de dados genômicos do T. cruzi. Por microscopia confocal localizou-se a expressão de clatrina na bolsa flagelar dos parasitas... (...) Como transferrina foi visualizada em vesículas sem revestimento localizadas majoritariamente no citóstoma, frações de membrana detergente-resistentes foram purificadas por fracionamento celular e o conteúdo lipídico foi analizado por cromatografia, sendo também obtidas as concentrações de proteína e colesterol destas frações de membrana. \201CDot blots\201D das frações foram positivos para marcadores universais de jangadas de lipídios (flotilina-1 e toxina B do cólera). Por imunofluorescência co-localizou-se marcação de transferrina e de anticorpos anti-flotilina no citóstoma. Assim, propomos que a endocitose de transferrina ocorre principalmente pelo citóstoma através de um domínio de membrana detergente-resistente. Epimastigotas foram também pré-tratadas para impedir especificamente endocitose mediada por clatrina e a endocitose por cavéolas, usando-se drogas que interferem com o citoesqueleto celular, seguindo-se incubação com transferrina. Dados de MET e citometria de fluxo mostraram que a endocitose de transferrina ocorreu normalmente nas amostras onde o brotamento de vesículas revestidas com clatrina foi impedido, não sendo porém observada nas amostras onde a endocitose por cavéolas foi inibida. Análise da curva de crescimento de parasitas tratados demonstrou uma relação positiva entre interferência nos domínios de membrana detergente-resistentes e sobrevivência das células. Este conjunto de dados permitiu elaborar um modelo dos mecanismos de endocitose em epimastigotas de T. cruzi. / Endocytosis in eukaryotic cells is the in corporation process o f macromolecules, t hrough different pathways with different associated proteins, through vesicles budding at the plasma membrane and addressing of these vesicles to cytoplasmic endosomal compartments. Trypanosomatids are pathogenic flagellate protozoa of great medical and ve terinary importance that present different evolutive forms along their life cycle. These parasites are structurally organized inside a cage of subpelicular microtubules, what makes it difficult to form membrane invagination along most part of the cell body . However, this cage is missing at the flagellar pocket region, where the flagellum emerges from the cell. Epimastigote forms of Trypanosoma cruzi present besides the flagellar pocket a second membrane invagination, the cytostome/cytopharynx . This structur e is sustained by specialized microtubules that actively participate in the endocytic process. This thesis has investigated the endocytic pathways at the two competent sites for nutrient uptake (flagellar pocket and cytostome) of T. cruzi epimastigotes. Af ter parasites incubation at 28 o C with gold - conjugated albumin e , transferrin or LDL, followed by processing for transmission electron microscopy (TEM), it was possible to observe coated endocytic vesicles loaded with albumin, budding off from the flagellar pocket. Analysis of the proteic content of epimastigote forms detected the expression of clathrin, confirmed by flow cytometry and in silico analysis of the T. cruzi genomic database. Confocal microscopy allowed the visualization of the clathrin expression at the flagellar pocket. As transferrin was seen in uncoated vesicles located mainly in the cytostome, detergent - resistant membrane fractions were purified by cell fractioning and the lipidic contents was analyzed by chromatography, as well as the protein and cholesterol contents in the fractions. Dot blots of such membrane fractions were positive for lipid raft universal labels (flotillin - 1 and cholera B toxin). By immunofluorescence microscopy , transferrin and flotillin were co - localized at the cytostome . Thus we propose that endocytosis of transferrin occurs mainly through the cytostome via detergent - resistant membrane domains. Epimastigote forms were pre - treated to specifically hinder clathrin - mediated and caveolae - mediated endocytosis, by using drugs t hat impair these pathways and interfere with the cell cytoskeleton, followed by incubation with transferrin. Data from TEM and flow cytometry showed that the endocytosis of transferrin occurred normally in samples where budding of clathrin - coated vesicles was hindered, but it was not observed in samples where caveolae - mediated endocytosis was inhibited. Analysis of growth curves of treated parasites showed a relation between interference with detergent - resistant membrane domains and cell surviving. Our data allowed to elaborate a model depicting the endocytic mechanisms in Trypanosoma cruzi epimastigotes

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:42:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcio_cipitelli_ioc_mest_2014.pdf: 2535966 bytes, checksum: c480c7ecf9d9f5dabc625d7c2fd0a32c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Quimiocinas são citocinas envolvidas em processos inflamatórios e homeostásicos. Estudos in vitro vêm demonstrando a influência desses mediadores na alteração da permeabilidade endotelial na infecção pelo vírus dengue (DENV). Dengue é uma doença de amplo espectro clínico, variando desde uma infecção assintomática a casos graves, com manifestações hemorrágicas e/ou extravasamento plasmático e, em menor frequência, ao óbito de pacientes. O objetivo de nosso projeto foi avaliar o envolvimento de quimiocinas séricas presentes em pacientes infectados pelo DENV na alteração da permeabilidade transendotelial, utilizando células endoteliais primárias num sistema in vitro. Para isso realizamos estudo populacional para obtenção de amostras de sangue de casos suspeitos de dengue durante epidemia de 2013 e de indivíduos sadios. Após confirmação laboratorial, foi realizada classificação clínica dos casos segundo a OMS 2009. No soro dos pacientes e controles foi realizada quantificação dos níveis das citocinas TNF-\03B1, IL-1\03B2 e IL-10 e das quimiocinas CXCL8/IL-8, CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10 CCL5/RANTES e CX3CL1/Fractalcina por ELISA ou LUMINEX. Para os ensaios de permeabilidade, foram feitos cultivo e manutenção de células endoteliais primárias HMVEC-d para padronização do ensaio, através da medida da resistência elétrica transendotelial (TEER). Na tentativa de avaliar a contribuição das quimiocinas na medida do TEER, foram adicionados sobre monocamada de HMVEC-d com 80% de confluência em sistema Transwell, 20% de soro de pacientes pré-tratados ou não com bloqueadores de CCL4/MIP-1\03B2, CXCL10/IP-10, CX3CL1/Fractalcina, CCL5/RANTES e IgG e feito uma cinética. Brevemente, foram confirmados 181 pacientes, com predominância do DENV-4, distribuídos segundo a OMS em: 125 febre do dengue sem sinais de alarme (FD), 54 FD com sinais de alarme (FDSA) e 2 dengue grave (FDSA/Grave) De forma interessante, a infecção pelo DENV-4 sugeriu características clínicas e laboratoriais mais brandas comparadas a epidemias por outros sorotipos. Independentemente da gravidade, os pacientes DENV-4 apresentaram altos níveis de TNF-\03B1, IL-10, CCL2/MCP-1, CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 e CX3CL1/Fractalcina, mas não de IL-1\03B2 e CCL5/RANTES comparado aos controles saudáveis. Nossa estratégia para avaliar a capacidade de alterar a permeabilidade das monocamadas de HMVEC-d foi agrupar os pacientes em dois grupos, altos (n=5) e baixos (n=5) produtores de TNF-\03B1, IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8. Surpreendentemente, os níveis séricos de TNF-\03B1, IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8 parecem não influenciar a medida do TEER. Dos 10 pacientes, 4 não alteraram a medida do TEER e 6 alteraram em algum momento da cinética. O bloqueio das quimiocinas parece não ter influenciado a medida do TEER nas condições estabelecidas. Análises de correlação indicaram uma tendência dos níveis séricos de IL-1\03B2 e CXCL8/IL-8 e CX3CL1/Fractalcina protegerem a monocamada das alterações, enquanto essa proteção parece ter sido mais efetiva em relação aos níveis séricos CCL5/RANTES. O conjunto desses dados nos indica que o DENV-4 parece levar a uma dengue na forma mais branda nos pacientes, aliado a uma redução de parâmetros clínico-laboratoriais associados à gravidade. Citocinas e quimiocinas estão presentes em altos níveis séricos nestes pacientes e parecem ser autorreguladas. Dentre os mediadores inflamatórios, quimiocinas como CCL5/RANTES parece influenciar de forma impactante a alteração da permeabilidade de células endoteliais, o que não foi confirmado pelos ensaios de bloqueio, mas pela correlação direta dos níveis séricos de CCL5/RANTES com a medida do TEER / Chemokines are cytokines involved in homeostatic and inflammatory processes . In vitro studies have demonstrated the influence of these mediators in the alteration of endothelial permeability in Dengue virus (DENV) infection. Dengue is a wide clinical spectrum disease, ranging from an asympto matic infection to severe cases with hemorrhagic manifestations and / or plasma extravasation that could result in death of patients. The aim of our project was to evaluate the involvement of serum chemokines present in patients infected with DENV in chang ing the transendothelial permeability using primary endothelial cells in vitro system. To population - based study conducted to obtain blood samples from suspected dengue cases during the epidemic of 2013 and the control group. After laboratory confirmation, clinical classification was made of the cases according to the WHO 2009. In the serum of patients and controls was performed quantification of levels of the cytokines TNF - α, IL - 1β and IL - 10 and chemokines CXCL8/IL - 8, CCL2/MCP - 1, CXCL10/IP - 10, CCL5/RANTES and CX3CL1/Fractalkine by ELISA or LUMINEX. For the permeability tests were made cultivation and maintaining prim ary endothelial cell (HMVEC - d) and measuring transendothelial electrical resistance (TEER). In order to assess the contribution of chemokines i n the extent TEER were added to monolayer HMVEC - d at 80% confluence in Transwell System, 20% serum from patients pretreated or not with blocking CCL4/MIP - 1β, CXCL10/IP - 10, CX3CL1/Fractalkine, CCL5/RANTES and IgG made kinetics. Briefly, 181 patients were co nfirmed, with a predominance of DENV - 4, distributed according to the WHO in: 125 dengue fever without warning signs (FD), 54 FD with alarm signals (FDSA) an d 2 severe dengue (FDSA/Severe) . Interestingly, infection with DENV - 4 suggested clinical and laborat ory characteristics milder compared to epidemics by other serotypes. Regardless of gravity, DENV - 4 patients presented high levels of TNF - α, IL - 10, CCL2/MCP - 1, CXCL8/IL - 8, CXCL10/IP - 10 and CX3CL1/Fractalkine, but not IL - 1β and CCL5/ RANTES compared to healt hy controls. Our strategy to assess the capacity change the permeability of monolayers HMVEC - d was to group the patients into two groups, high (n = 5) and low (n = 5) TNF - α producers, IL - 1β and CXCL8 / IL - 8. Surprisingly, the serum levels of TNF - α, IL - 1β and CXCL8/IL - 8 did not significantly influence the measurement of TEER. Of the 10 patients, 4 did not alter the extent TEER and 6 changed at some point in kinetics. Blocking chemokine did not influ ence the measurement of TEER on the established conditions. Correlation analysis indicated a trend of serum levels of IL - 1β patients and CXCL8/IL - 8 and CX3CL1/Fractalkine protect monolayer of changes, while this protection appears to have been more effective with respect to serum CCL5/RANTES. These data suggest th at the DENV - 4 appears to lead to dengue in milder form in patients, combined with a reduction of clinical and laboratory parameters associated with severity. Chemokines and cytokines are present in high serum levels in these patients and seem to be autorre gulated. Among inflammatory mediators, such as chemokine CCL5/RANTES impactful seems to influence the change in permeability of endothelial cells, which was not confirmed by blocking assays, but for the direct correlation of serum levels of CCL5/RANTES wit h the measure of TEER

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:53:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luzinei_couto_ioc_mest_2014.pdf: 3229136 bytes, checksum: e00df22ea1070f548fd298cf2fe9a40c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Resultados anteriores demonstraram que a administração oral e intranasal de antígenos brutos de Leishmania (Leishmania) amazonensis (LaAg) protege parcialmente camundongos contra a infecção por L. amazonensis. No entanto, estudos de vacinação contra as espécies do subgênero Viannia, as principais espécies causadora da leishmaniose cutânea e mucosa nas Américas, têm sido dificultados pela falta de modelos experimentais de fácil manuseio que reproduzam a doença humana. Recentemente, foi demonstrado que o hamster dourado é um modelo adequado para o estudo da imunopatogênese da leishmaniose cutânea causada por L. (Viannia) braziliensis. Usando o modelo hamster, investigamos se o efeito protetor da imunização intranasal com LaAg pode ser estendido a infecção por L. braziliensis. Hamsters foram vacinados com duas doses de LaAg (10 \03BCg) intranasal (IN) ou duas doses de LaAg (20 \03BCg) por via intramuscular (IM) e duas semanas após a vacinação foram desafiados com L. braziliensis Os resultados demonstraram que a imunização com LaAg reduziu significativamente o crescimento da lesão e da carga parasitária, bem como os níveis de IgG e IgG2 no plasma. No final do experimento, 114 dias após a infecção, os hamsters que foram considerados protegidos expressaram na pele níveis semelhantes de mRNA para IFN-\03B3 e IL-10 comparados aos níveis na pele de animais não infectados, diferentemente do observado nos animais não protegidos. Comparando com a via nasal, a imunização pela via intramuscular (IM) não induziu proteção. Estes resultados demonstram pela primeira vez que a imunização pela via nasal pode induzir proteção cruzada contra a infecção por L. braziliensis / Previous results have shown that oral and intranasa l administration of crude Leishmania (Leishmania) amazonensis antigens (LaAg) partially protects mice against L. amazonensis infection. However, vaccination studies on species of the subgenus Viannia , the main causative species of cutaneous and mucos al leishmaniasis in the Americas, have been hampered b y the lack of easy-to-handle bio-models that accurately mimic the human disease. Recently, we demonstrated that the golden hamster is an appropriate model for studying the immunopathogenesis of cutaneous leishmaniasis cause d by L. (Viannia) braziliensis. Using the golden hamster model, we investigated whe ther the protective effect of intranasal immunisation with LaAg can be extended t o L. braziliensis infection. Golden hamsters vaccinated with either two intranas al (IN) doses of LaAg (10 μ g) or two intramuscular doses of LaAg (20 μ g) were challenged 2 weeks post-vaccination with L. braziliensis. The results showed that IN immunisation with LaAg s ignificantly reduced lesion growth and parasitic load as well as serum IgG and IgG2 levels. At the experimental endpoint on day 114 post-infection , IN-immunised hamsters that were considered protected expressed IFN- γ and IL10 mRNA at similar levels as uninfected skin. Unlike what was observed in animal s not protected. In contrast to the nasal route, intramuscular (IM) immunisation failed to provide protection. These results demonstrate for the first time that the nas al route of immunisation can induce cross protection against L. braziliensis infection.

Orientador : Profª. Drª. Adriane Bianchi Pedroni Medeiros / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 19/05/2015 / Inclui referências : f. 90-96 / Área de concentração: Biotecnologia agroalimentar / Resumo: Neste trabalho foi desenvolvido um processo para obtenção de um aroma frutal, cujo principal componente foi o acetato de isoamila, biossintetizado por Pichia fermentans em fermentação submersa. O perfil da produção do aroma foi estudado durante 28 horas de fermentação por HS/SPME-CG (microextração em fase sólida do "headspace") sendo que a produção máxima foi alcançada em 6h de fermentação. Estudos do processo de pervaporação foram realizados para concentrar/recuperar o aroma natural produzido. Foram testadas temperaturas da alimentação do pervaporador a 30, 45 e 60 °C. Determinou-se o fluxo total (Jt), o fluxo parcial dos componentes (Ji) e o fator de enriquecimento (?) para definir a melhor condição de recuperação do aroma natural frutal. Foi utilizada a membrana Pervap 4060-Sulzer. A temperatura selecionada foi de 45 °C. O aroma líquido obtido por pervaporação e o fermentado bruto foram submetidos à secagem em "spray dryer". Goma arábica, dextrina, maltodextrina e uma mistura de dextrina e maltodextrina foram testados como agentes encapsulantes. Os melhores resultados foram obtidos como amido modificado (20% de dextrina) seguido da mistura de dextrina (15%) e maltodextrina (15%) com eficiência de encapsulamento de 68,95% e 39,33%, respectivamente. O aroma líquido natural produzido foi aplicado em refrigerante e em coquetel (bebida tipo "Ice"). O perfil sensorial das bebidas foi avaliado por aromistas treinados e apresentaram notas frutais que remeteram a banana. / Abstract: In this work a process for obtaining a fruity aroma was developed, the main component is the isoamyl acetate, biosynthesized by Pichia fermentans in submerged fermentation. The profile of the aroma production was studied for 28 hours fermentation by HS / SPME-GC (headspace solid phase microextraction) and the maximum production was achieved in 6h SmF. Studies of the pervaporation process were performed to recover the natural aroma produced. The feed temperatures of 30, 45 and 60°C in pervaporation were tested, which were determined total flux (Jt), partial flux of components (Ji) and enrichment factor (?). The best temperature was 45 °C, within the ranges tested for membrane used (Pervap 4060-Sulzer) and recovery of the natural fruity aroma. The fermented (crude aroma) and liquid natural aroma obtained were dried in spray dryer. Arabic gum, dextrin, maltodextrin and a mixture of dextrin and maltodextrin were tested as encapsulating agents. The best agent was modified starch (20% dextrin) followed by the mixture dextrin (15%) and maltodextrin (15%), the encapsulation efficiency was 68.95% and 39.33%, respectively. The natural liquid aroma produced was applied to soda and ice cocktail. The sensory profile of the drinks was evaluated by trained flavorists, these fruity notes refers the banana flavours.