Platelets play an important role in haemostasis by mediating blood clotting at sites of blood vessel damage. Platelets, also participate in pathological conditions including thrombosis and inflammation. Upon vessel damage, two glycoprotein receptors, the GPIb-IX-V complex and GPVI, play important roles in platelet capture and activation. GPIb-IX-V binds to von Willebrand factor and GPVI to collagen. This initiates a signalling cascade resulting in platelet shape change and spreading, which is dependent on the actin cytoskeleton. This thesis aimed to develop and implement different super-resolution microscopy techniques to gain a deeper understanding of the conformation and location of these receptors in the platelet plasma membrane, and to provide insights into their signalling pathways. We suggest direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) and structured illumination microscopy (SIM) as the best candidates for imaging single platelets, whereas expansion microscopy (ExM) is ideal for imaging platelets aggregates. Furthermore, we highlighted the role of the actin cytoskeleton, through Rac in GPVI signalling pathway. Inhibition of Rac, with EHT1864 in human platelets induced GPVI and GPV, but not GPIbα shedding. Furthermore, EHT1864 treatment did not change GPVI dimerisation or clustering, however, it decreased phospholipase Cγ2 phosphorylation levels, in human, but not murine platelets, highlighting interspecies differences. In summary, this PhD thesis demonstrates that; 1) Rac alters GPVI signalling pathway in human but not mouse platelets; 2) our newly developed ExM protocol can be used to image platelet aggregates labelled with F(ab’) fragments / Thrombozyten, spielen in der Hämostase eine entscheidende Rolle, indem sie die Blutstillung bei Gefäßverletzung vermitteln. Sie sind jedoch auch an pathologischen Prozessen wie zum Beispiel der Thrombose und Entzündungen beteiligt. Bei einer Gefäßverletzung spielen zwei Glykoproteinrezeptoren eine wichtige Rolle bei der Adhäsion und Aktivierung von Thrombozyten: der GPIb-IX-V-Komplex und GPVI. GPIb-IX-V bindet an den von-Willebrand-Faktor und GPVI an Kollagen. Dies initiiert eine Signalkaskade, die zu einer Änderung der Morphologie der Thrombozyten führt, welche vom Aktin-Zytoskelett abhängig ist. Ziel dieser Doktorarbeit war die Entwicklung und Anwendung verschiedener hochauflösender Mikroskopietechniken, um ein tieferes Verständnis der Konformation und Lokalisation dieser Rezeptoren in der Plasmamembran der Thrombozyten zu erlangen und Einblicke in ihre Signalwege zu gewinnen. Hierbei etablierten wir dSTORM und die structured illumination microscopy (SIM) als die geeignetsten Methoden für die mikroskopische Untersuchung einzelner Thrombozyten, während die Expansionsmikroskopie (ExM) ideal für die Darstellung von Thrombozytenaggregaten ist. Darüber heben unsere Ergebnisse zur Funktion von Rac im GPVI Signalweg die wichtige Rolle des Aktin-Zytoskeletts hervor. Die Hemmung von Rac mit EHT1864 in menschlichen Thrombozyten induzierte das Abscheiden (shedding) von GPVI und GPV, nicht jedoch von GPIbα. Darüber hinaus blieb die GPVI Dimerisierung und GPVI-Clusterbildung durch EHT1864-Behandlung unverändert, jedoch verringerte sich die Phosphorylierung der Phospholipase Cγ2 in humanen, aber nicht in murinen Thrombozyten, was Unterschiede zwischen den Spezies aufzeigt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass; 1) Rac den GPVI Signalweg in humanen aber nicht in murinen Thrombozyten beeinflusst; 2) unser neu entwickeltes ExM-Protokoll zur Darstellung von F(ab’)-Fragment markierten Thrombozytenaggregaten verwendet werden kann.

Glycoprotein receptor VI (GPVI) is the major collagen receptor in platelets. Ligand binding induces GPVI clustering, which initiates a tyrosine kinase-based signalling cascade via an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). GPVI has been shown to play roles in both the initiation and growth of thrombi, although GPVI deletion is not associated with significant bleeding. Therefore, targeting the GPVI pathway is a potential route to overcome the bleeding risk associated with current therapies. G6b-B is a glycoprotein receptor with restricted expression to platelets membrane surface that inhibits platelet activation by ITAM receptors. Crosslinking with G6b-B antibodies prevents platelet activation. We hypothesize that it will be possible to overcome the bleeding risk of current antithrombotics, which target other platelet activation pathways, by inhibiting GPVI-mediated pathway molecules or activating G6b-B using novel biologics, such as Affimers. To inhibit the GPVI pathway we generated novel anti-human GPVI monoclonal antibodies (mAbs) and their F(ab) fragments (developed prior to the start of this project by Emfret Analytics Würzburg, Germany). The aim was to determine their mode of action and to which epitopes or regions of the protein they bind. Four new anti-GPVI mAbs and their F (ab) fragments were characterised. Among the mAbs, E7 was the only antibody to fully block GPVI activity. A9 caused a minor inhibition suggestive of either direct competition for the CRP binding site, binding close enough to cause steric hindrance to its binding. GPVI-mediated platelet activation was inhibited by all four F(ab) fragments suggesting these have potential as a novel α-GPVI therapy. Structural characterization of these anti-GPVI mAbs (E12, E7, E2, D3 and A9) with GPVI was assessed with three complementary approaches, namely bio-layer interferometry (BLI), crystallography, and epitope mapping. BLI showed that none of the mAbs are monomer or dimer specific. Crystallographic studies were not successful and will need further future optimisation. GPVI chimeras were generated to identify that the mAbs were binding to the GPVI D1 domain, which is the ligand binding domain. Additional studies will be needed for a full structural characterization of these mAbs bound to GPVI which protein-based therapeutics are required to demonstrate during their development phase. Our other aim was to develop new biologics (Affimers) to target and activate the ITIM- receptor G6b-B, which constitutively inhibits platelet activation by ITAM-like receptors. The potential antithrombotic effect of G6b-B and whether G6b-B stimulation could lead to less reactive platelets, reducing the risk, or severity of thrombosis has not been extensively studied until now. Here we targeted for the first time an inhibitory pathway to downregulate GPVI by targeting G6b-B. Three Affimers were identified to bind G6b- B. Preliminary functional studies showed that these Affimers did not induce G6b-B to inhibit platelet activation through the GPVI activation pathway in classical in vitro platelet function assays (namely aggregometry). However, preliminary in vitro flow studies with Affimer 24 showed some potential to influence thrombus size on CRP coated surfaces. In conclusion, in this thesis we provide an insight of the first functional and structural characterization of new mAbs targeting human GPVI, with some showing potential as good candidates for antiplatelet therapy. Additionally, we show the first attempt to target an inhibitory pathway as anti-platelet therapy by developing Affimers against G6b-B. Further research is needed to explore whether G6b-B stimulation could lead to less reactive platelets reducing the risk, or severity of thrombotic disease without causing substantial bleeding. / Glykoproteinrezeptor VI (GPVI) ist der wichtigste Kollagenrezeptor in Blutplättchen. Die Ligandenbindung induziert die GPVI-Clusterbildung, die eine Tyrosinkinase-basierte Signalkaskade über ein Immunrezeptor-Tyrosin-basiertes Aktivierungsmotiv (ITAM) initiiert. Es wurde gezeigt, dass GPVI sowohl bei der Initiierung als auch beim Wachstum von Thromben eine Rolle spielt, obwohl eine GPVI-Deletion nicht mit signifikanten Blutungen verbunden ist. Daher ist die Ausrichtung auf den GPVI-Weg ein potenzieller Weg, um das Blutungsrisiko zu überwinden, das mit aktuellen Therapien verbunden ist. G6b-B ist ein Glykoproteinrezeptor mit eingeschränkter Expression auf der Membranoberfläche von Blutplättchen, der die Aktivierung von Blutplättchen durch ITAM-Rezeptoren hemmt. Die Quervernetzung mit G6b-B-Antikörpern verhindert die Thrombozytenaktivierung. Wir gehen davon aus, dass es möglich sein wird, das Blutungsrisiko aktueller Antithrombotika zu überwinden, die auf andere Thrombozytenaktivierungswege abzielen, indem GPVI-vermittelte Signalwegmoleküle gehemmt oder G6b-B mit neuartigen Biologika wie Affimers aktiviert werden. Um den GPVI-Weg zu hemmen, haben wir neuartige monoklonale Anti-Human-GPVI-Antikörper (mAbs) und ihre F(ab)-Fragmente generiert (entwickelt vor Beginn dieses Projekts von Emfret Analytics Würzburg, Deutschland). Ziel war es, ihre Wirkungsweise zu bestimmen und an welche Epitope oder Regionen des Proteins sie binden. Vier neue Anti-GPVI-mAbs und ihre F(ab)-Fragmente wurden charakterisiert. Unter den mAbs war E7 der einzige Antikörper, der die GPVI-Aktivität vollständig blockierte. A9 verursachte eine geringfügige Hemmung, was entweder auf eine direkte Konkurrenz um die CRP-Bindungsstelle hindeutet, und bindet nahe genug, um eine sterische Hinderung seiner Bindung zu verursachen. Die GPVI-vermittelte Blutplättchenaktivierung wurde durch alle vier F(ab)-Fragmente gehemmt, was darauf hindeutet, dass diese ein Potenzial als neuartige α-GPVI-Therapie haben. Die strukturelle Charakterisierung dieser Anti-GPVI-mAbs (E12, E7, E2, D3 und A9) mit GPVI wurde mit drei komplementären Ansätzen bewertet, nämlich Bio-Layer-Interferometrie (BLI), Kristallographie und Epitop-Mapping. BLI zeigte, dass keiner der mAbs monomer- oder dimerspezifisch ist. Kristallographische Studien waren nicht erfolgreich und müssen in Zukunft weiter optimiert werden. GPVI-Chimären wurden erzeugt, um zu identifizieren, dass die mAbs an die GPVI-D1-Domäne binden, die die Ligandenbindungsdomäne ist. Zusätzliche Studien werden für eine vollständige strukturelle Charakterisierung dieser an GPVI gebundenen mAbs benötigt, die proteinbasierte Therapeutika während ihrer Entwicklungsphase nachweisen müssen. Unser weiteres Ziel war die Entwicklung neuer Biologika (Affimere) zur gezielten Aktivierung des ITIM-Rezeptors G6b-B, der die Thrombozytenaktivierung durch ITAM-ähnliche Rezeptoren konstitutiv hemmt. Die potenzielle antithrombotische Wirkung von G6b-B und ob die G6b-B-Stimulation zu weniger reaktiven Blutplättchen führen könnte, was das Risiko oder die Schwere einer Thrombose verringert, wurde bisher nicht umfassend untersucht. Hier zielten wir zum ersten Mal auf einen inhibitorischen Weg, um GPVI herunterzuregulieren, indem wir auf G6b-B abzielten. Es wurden drei Affimere identifiziert, die G6b-B binden. Vorläufige funktionelle Studien zeigten, dass diese Affimere G6b-B nicht dazu veranlassten, die Blutplättchenaktivierung durch den GPVI-Aktivierungsweg in klassischen in vitro-Blutplättchenfunktionsassays (nämlich Aggregometrie) zu hemmen. Vorläufige In-vitro-Durchflussstudien mit Affimer 24 zeigten jedoch ein gewisses Potenzial zur Beeinflussung der Thrombusgröße auf CRP-beschichteten Oberflächen. Zusammenfassend geben wir in dieser Dissertation einen Einblick in die erste funktionelle und strukturelle Charakterisierung neuer mAbs, die auf humanes GPVI abzielen, wobei einige das Potenzial als gute Kandidaten für die Thrombozytenaggregationshemmung zeigen. Darüber hinaus zeigen wir den ersten Versuch, einen inhibitorischen Signalweg als Thrombozytenaggregationshemmer anzugreifen, indem wir Affimere gegen G6b-B entwickeln. Weitere Forschung ist erforderlich, um zu untersuchen, ob die G6b-B-Stimulation zu weniger reaktiven Blutplättchen führen könnte, wodurch das Risiko oder die Schwere einer thrombotischen Erkrankung verringert wird, ohne dass es zu erheblichen Blutungen kommt.