Zellen enthalten zahlreiche Enzyme, deren Reaktionen von molekularem Sauerstoff abhängen. Oft sind deren aktive Zentren tief im inneren des Proteins verborgen, was die Frage nach spezifischen Zugangskanälen, die den Sauerstoff gezielt zum Ort der Katalyse leiten, aufwirft. In der vorliegenden Arbeit wird dies am Beispiel der 12/15-Lipoxygenase, als ein typisches Beipiel Sauerstoff verbrauchender Enzyme, untersucht. Die Sauerstoffverteilung innerhalb des Proteins wurde bestimmt und mögliche Routen für den Sauerstoffzugang definiert. Zu diesem Zweck wurden theoretische Untersuchungen eng mit Experimenten verzahnt. Zuerst wurden Molekulardynamik Simulationen des Proteins in Lösung durchgeführt. Aus den Trajektorien konnte die dreidimensionale Verteilung der Freien Enthalpie für Sauerstoff berechnet werden. Die Analyse der günstigsten Pfade in dieser Energielandschaft führte zur Identifikation von vier Sauerstoffkanälen im Protein. Alle Kanäle verbinden die Proteinoberfläche mit einem Gebiet hoher Sauerstoffaffinität am aktiven Zentrum. Diese Region liegt bezüglich des Substrats gegenüber dem Eisenzentrum, wodurch eine strukturelle Erklärung für die Reaktionsspezifität des Enzyms gegeben ist. Der katalytisch bedeutsamste Weg des Sauerstoffs kann durch L367F Austauschmutation blockiert werden, was zu einer stark erhöhten Michaelis-Konstante für Sauerstoff führt. Diese experimentell nachgewiesene Blockade konnte, mit Hilfe entsprechender Molekulardynamik Simulationen, durch eine Umordnung eines Wasserstoffbrücken-Netzwerks von Wassermolekülen innerhalb des Protein im Detail erklärt werden. Die Ergebnisse ermöglichen den Schluss, dass die Hauptroute für Sauerstoff zum aktiven Zentrum des Enzyms einem Kanal folgt, der aus vorübergehend verbundenen Hohlräumen besteht. Hierbei unterliegt das Öffnen und Schließen des Kanals der Dynamik der Proteinseitenketten. / Cells contain numerous enzymes utilizing molecular oxygen for their reactions. Often, their active sites are buried deeply inside the protein which raises the question whether there are specific access channels guiding oxygen to the site of catalysis. In the present thesis this question is investigated choosing 12/15-lipoxygenase as a typical example for such oxygen dependent enzymes. The oxygen distribution within the protein was determined and potential routes for oxygen access were defined. For this purpose an integrated strategy of structural modeling, molecular dynamics simulations, site directed mutagenesis, and kinetic measurements has been applied. First, molecular dynamics simulations of the protein in solution were performed. From the trajectories, the 3-dimensional free-energy distribution for oxygen could be computed. Analyzing energetically favorable paths in the free-energy map led to identification of four oxygen channels in the protein. All channels connect the protein surface with a zone of high oxygen affinity at the active site. This region is localized opposite to the non-heme iron providing a structural explanation for the reaction specificity of this lipoxygenase isoform. The catalytically most relevant path can be obstructed by L367F exchange which leads to a strongly increased Michaelis constant for oxygen. This experimetally proven blocking mechanism can, by virtue of molecular dynamics studies, be explained in detail through a reordering of the hydrogen bonding network of water molecules. As a conclusion, the results provide strong evidence that the main route for oxygen access to the active site of the enzyme follows a channel formed by transiently interconnected cavities whereby the opening and closure is governed by sidechain dynamics.

The major part of this thesis describes the asymmetric synthesis of β- and γ-amino alcohols through the combination of ruthenium catalyzed racemization and enzymatic kinetic resolution. The dynamic kinetic resolution, DKR, protocol for chlorohydrins was improved by employing Bäckvall’s catalyst, which is a base activated racemization catalyst, in combination with Burkholderia cepacia lipase. These optimized conditions broadened the substrate scope and improved the yields and ee’s of the obtained chlorohydrin acetates. The utility of the method was demonstrated in the synthesis of (S)-salbutamol. In the second part of the thesis, DKR was utilized in the enantio-determining step of the total synthesis of (R)-duloxetine. Optimized DKR conditions, combining Bäckvall’s catalyst together with Candida antarctica lipase B, afforded a β-cyano acetate in high yield and ee. (R)-Duloxetine was accessible through synthetic alterations of the enantioenriched β-cyano acetate in high overall yield. A dynamic kinetic asymmetric transformation, DYKAT, protocol to obtain enantio- and diastereomerically pure γ-amino alcohols was developed. In a first step N-Boc-aminoketones were obtained in high enantiomeric purity through a proline-catalyzed Mannich reaction. Subsequent in situ reduction coupled with a highly efficient DYKAT yielded γ-amino acetates in high dr and ee. The γ-amino alcohols were available through simple hydrolysis/deprotection with retained stereochemistry. In the final part of the thesis a heterogeneous bifunctional catalytic system is reported, which combines the catalytic properties of transition metal-catalyzed racemization with enzymatic acylation. A novel ruthenium-phosphonate complex was synthesized and then covalently anchored to the active site of solid supported Candida antarctica lipase B. The partially inhibited beads proved to be catalytically active both in racemization as well as enzymatic acylation. / At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 2: In press. Paper 3: Epub ahead of print.

La D-fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBPA) catalyse la réaction réversible d'aldolisation dans la voie métabolique du glucose, c'est-à-dire l'interconversion du dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et du D-glyceraldéhyde 3-phosphate (G3P) en D-fructose 1,6-bisphosphate (FBP). Les aldolases sont regroupées en deux classes selon le mécanisme réactionnel : la classe I, dont fait partie l'enzyme humaine, catalyse la réaction en passant par la formation d'un intermédiaire covalent (base de Schiff), alors que les aldolases de classe II sont des métalloenzymes - un cation métallique divalent est requis pour son activité catalytique. L'aldolase de classe II, absente des mammifères, se retrouve notamment chez des agents pathogènes, par exemples Mycobacterium tuberculosis (tuberculose), Giardia lamblia (giardiase), Escherichia coli (infections diverses) et Helicobacter pylori (ulcère et cancer gastrique). Cette distribution en fait une cible potentielle dans la découverte de médicaments. La conception d'inhibiteurs spécifiques pour l'aldolase de classe II requiert une fine connaissance de sa catalyse enzymatique et de sa structure tridimensionnelle. Cette connaissance demeure incomplète, alors que l'ensemble des structures de complexes enzyme-inhibiteur ou enzyme-intermédiaire ne supporte pas une partie du mécanisme publié dans la littérature. Nous étudions le rôle catalytique de deux résidus situés chacun sur une boucle de surface mobile de l'aldolase de classe II de H. pylori et impliqués dans des étapes d'échange de proton. Les mutants simples H180Q et E142A ont été caractérisés cinétiquement et cristallisés pour la détermination de structure sur la base de la diffraction aux rayons X. Les structures cristallines des mutants complexés à des intermédiaires réactionnels ont été résolues. La déprotonation du groupe hydroxyle en C4 du FBP initie le clivage de la liaison en C3-C4 du cétohexose, première étape du mécanisme catalytique de rétro-aldolisation. Nos résultats identifient His180, sur la boucle beta6-alpha8, comme responsable de cet échange de proton. Ce résidu est un ligand de l'ion de zinc dans la structure native; le changement conformationnel observé suite à l'amarrage du phosphate en C1 de FBP libère His180 pour permettre le clivage. L'ion de zinc migre par la suite vers le site actif afin de faciliter la liaison du substrat et la stabilisation de l'intermédiaire énediolate. Nos résultats vont à l'encontre de l'hypothèse publiée précédemment sur le rôle catalytique de Asp82 dans cet échange de proton du groupe hydroxyle en C4, le rôle de ce dernier résidu se limitant plutôt au maintien de l'intégrité structurale du site actif. La libération du G3P nouvellement produit est suivie de la protonation stéréospécifique de l'intermédiaire énediolate générant le DHAP. La libération du DHAP complète ainsi le cycle catalytique. La protonation de l'intermédiaire énediolate est effectuée par l'intermédiaire du résidu Glu142, situé sur la boucle beta5-alpha7, ce qui concorde avec des études cinétiques publiées sur d'autres FBPA de classe II. Ces études ont attribué le même rôle à ce résidu conservé entre homologues. Nous avons par la suite établi un protocole de simulation de dynamique moléculaire pour évaluer le repliement de ladite boucle et ainsi comprendre le mode d'action du résidu Glu142. Des détails mécanistiques de l'étape de clivage s'ajoutent à nos connaissances actuelles; des questions subsistent quant à leur implication au reste de la catalyse. En attribuant un rôle crucial à la boucle beta6-alpha8 dans la catalyse et non limité à la liaison de substrats, cette boucle des aldolases de classe II peut devenir une cible dans le développement d'inhibiteurs. De plus, la migration de l'ion de zinc non dépendante de ligand suggère la possibilité de chélater et restreindre l'ion loin du site actif. / Fructose-1,6-bisphosphate aldolase catalyzes the reversible aldol reaction in glucose metabolism interconverting dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and D-glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) into D-fructose 1,6-bisphosphate (FBP). Aldolases are furthermore classified based on their reaction mechanism: class I aldolase (e. g. human aldolase) forms a covalent Schiff base intermediate with substrate, whereas class II aldolase utilizes a divalent metal cation in catalysis. Class II aldolase is commonly found in pathogenic organisms such as Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis), Giardia lamblia (giardiasis), Escherichia coli (diverse infections) and Helicobacter pylori (ulcer and gastric cancer) but not in mammals. This distribution makes class II aldolase a potential target for drug discovery. Structure driven drug design depends on an explicit knowledge of the reaction mechanism of class II aldolase and its three-dimensional structure. Our current knowledge is lacking; existing aldolase crystal structures with reaction intermediates and with competitive inhibitors are not coherent with proposed mechanisms in literature. The present study focuses on the catalytic role of two residues, each located on a mobile loop of H. pylori class II aldolase and each implicated in a critical proton transfer step. Single mutants H180Q and E142A were characterized enzymatically and crystallized for X-ray structure determination. Crystal structures of reaction intermediates formed with substrate were determined. The catalytic mechanism requires proton abstraction at the FBP C4 hydroxyl group to initiate C3-C4 bond cleavage, first step of the retroaldol reaction. Our data supports His180 situated on the mobile loop beta6-alpha8, as the residue responsible for this proton transfer. Notably, His180 chelates the zinc ion in the native structure. The structural change induced due to C1 phosphate binding of FBP releases His180 to promote cleavage. Displacement of the catalytic zinc ion ensues, facilitating substrate binding and subsequent stabilization of the enediolate intermediate. Our results do not support the previous hypothesis of a catalytic role for Asp82 in C4 hydroxyl group proton abstraction; it rather plays an important role in maintaining structural integrity for active site binding. Displacement of the nascent aldehyde G3P and concomitant stereospecific protonation of the enediolate species generates the obligate triose phosphate, DHAP. Dissociation of DHAP from the active site completes the catalytic cycle. The residue responsible for initiating enediolate protonation was identified as residue Glu142, situated on mobile loop beta5-alpha7, and this is in agreement with previous kinetic studies of enediolate protonation in other class II aldolases, attributing the same role to this conserved residue. We devised a molecular dynamic simulation method to follow the catalytic loop folding event, further investigating details of the role of Glu142 in catalysis. We gained further knowledge of the cleavage event, although work remains to elucidate missing details of the catalysis and integrate our findings. By attributing a role in catalysis to loop beta6-alpha8 not limited to substrate binding, this loop of class II aldolases becomes a potential target in drug design. In addition, ligand independent zinc ion migration suggest it is possible to chelate the metal and restrain it far from the active site.

La résistance aux antibiotiques est une menace sérieuse pour la santé publique. En effet, si on ne change pas rapidement notre consommation excessive d'antibiotiques, la situation actuelle va se dégrader jusqu'à basculer dans une ère dite "post-antibiotique", dans laquelle plus aucun antibiotique ne sera efficace contre les infections microbiennes. Bien que ce phénomène de résistance apparaît naturellement, l'utilisation abusive d'antibiotiques accélère le processus. De plus, la présence de pathogènes multi-résistants neutralise l'effet des traitements existants et dans le cas de chirurgies courantes (césariennes, transplantations d'organe...), la situation peut rapidement s'aggraver voire devenir mortelle. C'est pourquoi des directives, émanant des autorités sanitaires, doivent être mises en place afin de contrôler l'utilisation des médicaments, et ce, à tous les niveaux de la société, des individus au secteur agricole en passant par les professionnels de santé et les industries pharmaceutiques. Le monde de la recherche scientifique, quant à elle, doit trouver des nouvelles stratégies pour enrayer la propagation de la résistance. Dans ce contexte, cette thèse a pour objectif le développement d'une méthode de prédiction, par calculs d'énergie libre, des mutations de β-lactamases favorables à l'hydrolyse des β-lactames. Ces travaux méthodologiques ont donc conduit au développement : (1) de nouveaux paramètres pour les enzymes à zinc, implémentés dans le champ de force OPLS-AA et validés par des simulations de dynamique moléculaire sur un panel de métalloenzymes représentatives, (2) d'un protocole de paramétrisation de ligands covalents pour étudier le comportement de certains β-lactames dans CMY-136, une nouvelle β-lactamase caractérisée au laboratoire, et (3) d'un protocole de calcul d'énergie libre évalué au moyen de compétitions internationales de prédiction. Ce dernier a ensuite été utilisé pour tenter d'expliquer pourquoi la carbamylation de la sérine catalytique n'a pas lieu dans certaines oxacillinases. Au travers de ces travaux, nous avons pu améliorer significativement notre approche computationnelle et désormais tout est en place pour une exploration exhaustive des mutations possibles dans les β-lactamases. / Antibiotic resistance is a global concern threatening worldwide health. Indeed, if we don't change our overconsumption of antibiotics, the current situation could worsen until a "post-antibiotic" era in which existing treatment would be ineffective against microbial infections. Despite the natural occurrence of antibiotic resistance, the misuse of antibiotics is speeding up the process. Furthermore, presence of multi-resistant pathogens negates the effect of modern treatments and usual surgeries (caesarean sections, organ transplantations...) might be riskier in the future, or even lethal. That's why, common guidelines have to be edicted by health authorities in order to control antibiotic use at every level of society, from individuals to healthcare industry including health professionals and agriculture sector. As for scientific research, new strategies have to be considered in order to limit the spread of antibiotic resistance. In that context, the presented thesis aimed at developing a protocol to predict, by free energy calculations, β-lactamase mutations which could promote the hydolysis of β-lactams antibiotics. In order to achieve that, we developed several methodological approaches including: (1) new parameters for zinc enzymes implemented in OPLS-AA force field and thereafter validated using molecular dynamics simulations of representative zinc-containing metalloenzymes, (2) a protocol to parameterize covalent ligands in order to analyze the dynamical behavior of some β-lactams in CMY-136, a novel β-lactamase recently characterized in our laboratory, and (3) a pmx-based free energy protocol. The latter was also assessed through several international blinded prediction challenges, and finally used to find out why carbamylation of the catalytic serine is not observed in certain OXA enzymes. Throughout this work, we made significant improvements in our protocol, and now everything is in place for an exhaustive prediction of possible mutations in β-lactamases.

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