Introdução: A Organização Mundial da Saúde estimou para o ano de 2008 aproximadamente 1.38 milhões de casos novos de câncer de mama no mundo e 458 mil mortes. A maioria dos casos (56%) e das mortes (64%), ocorrendo em países economicamente desenvolvidos. Apesar dos avanços e do diagnostico precoce, um número significativo de mulheres com tumores da mama operáveis apresentando evolução desfavorável vêm à sucumbir devido ao surgimento de doença metastática. Uma melhor compreensão da heterogeneidade do tumor e das características microambientais subjacentes, bem como dos mecanismos e as consequências das suas interações é essencial para melhorar o direcionamento das terapias existentes e desenvolver novos agentes terapêuticos para o câncer. Objetivos: Descrever as características clínicas, anatomopatológicas e imuno-histoquímicas de um grupo de pacientes com câncer de mama operável, e estudar o impacto destas características no estadiamento da doença, sobrevivência livre de recorrência e sobrevivência global. Além disto, analisar as potenciais correlações existentes entre estas características. Métodos: Estudo de coorte retrospectiva de base hospitalar envolvendo 86 mulheres com câncer primário de mama, submetidas a tratamento entre julho de 1999 e dezembro de 2004, no Serviço de Mastologia do Hospital de Clinicas de Porto Alegre. Dados clinicopatológicos e imuno-histoquimicos (RE, RP, HER2, Ki67 e p53) foram coletados dos registros hospitalares. Expressão do VEGF, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2 foram analisadas através de imuno-histoquimica. Variáveis contínuas foram analisadas pelo coeficiente de correlação de Spearman, ou pelo teste não paramétrico U de Mann-Whitney e H de Kruskal-Wallis, quando comparadas com variáveis categóricas. Variáveis categóricas foram analisadas pelo teste 2 de Pearson. Estimativas da probabilidade de sobrevivência foram obtidas pelo estimador não paramétrico de Kaplan-Meier e pelo semiparamétrico modelo de regressão de Cox. Comparação entre as curvas de sobrevivência foi realizada pelo teste estatístico de log-rank. O IC foi calculado em 95% e valores p< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Resultados: A sobrevivência livre de recorrência em 5 e 10 anos foi de 82,2% e 68%, e a global foi de 90,2% e 82,9%, respectivamente. Número de linfonodos positivos (p= 0,00; p= 0,03), diâmetro tumoral (p= 0,01; p= 0,01) e estádio (p= 0,00; p= 0,02) são fatores de risco isolado para recorrência e óbito, respectivamente. Superexpressão de HER2 é um fator de risco isolado para recorrência (p= 0,04). Existe uma correlação positiva significativa entre: VEGF e MMP-9 (rs: 0,246; p= 0,023); TIMP-2 e MMP-2 (rs: 0,358; p= 0,001). Também foram encontradas associações significativas entre as variáveis: a) VEGF e receptor de progesterona positivo (p= 0,045); b) TIMP-2 e idade ≥ 50 anos (p= 0,002), e diâmetro ≤ 2,0 cm (p= 0,016); c) TIMP-1 e menarca ≤ 12 anos (p= 0,038); d) Maior diâmetro e alto grau histológico (2: 19,3; p= 0,004), invasão vascular (2: 12,6; p= 0,006), status do linfonodo axilar (2: 8,6; p= 0,035), número de linfonodos metastáticos (2: 7,2; p= 0,028), e recidiva a distancia (2: 4,0; p= 0,046); e) Invasão vascular e status do linfonodo axilar, e número de linfonodos metastáticos, ambos com 2: 24,7; p= 0,000. Conclusões: O número de linfonodos positivos, diâmetro tumoral, e estádio foram identificados como fatores de risco isolado para a ocorrência de recidiva e óbito. A superexpressão de HER2 é fator de risco isolado para a ocorrência de recidiva da doença. Novas pesquisas devem ser realizadas, com padronização de procedimento e um maior número de casos para melhor caracterização da doença. / Background: The World Health Organization estimated approximately 1.38 million new breast cancer cases and 458,000 deaths worldwide for 2008. Most of these (56% of new cases and 64% of deaths) occur in economically developed countries. In Brazil, approximately 52,000 new cases are predicted for 2013. Better understand the heterogeneity of the tumor and microenvironmental characteristics around you, as well as the mechanisms and consequences of their interactions is essential to improve the targeting of existing therapies and develop new therapeutic agents for cancer. Objectives: The aim of this study was to describe the clinical, anatomopathological and immunohistochemical characteristics of a group of patients with operable breast cancer, and investigate the impact of these characteristics on disease staging, disease-free survival and overall survival. In addition, the potential correlations between these characteristics were analyzed. Methods: This is a hospital-based retrospective cohort study of 86 women with primary breast cancer, subjected to surgical and adjuvant treatment between July 1999 and December 2004. Clinicopathological and immunohistochemical (ER, PR, HER2, Ki67 e p53) data were collected from hospital records. The expression of VEGF, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 was analyzed using the immunohistochemical technique. Continuous variables were assessed with Spearman’s rank correlation coefficient, or the non-parametric Mann-Whitney U or Kruskal-Wallis H tests. Pearson’s 2 test was employed to asses categorical variables. The possibility of survival was estimated using the non-parametric Kaplan-Meier estimator and the semiparametric Cox regression model. Survival curves were compared using the statistical log-rank test. CI was calculated at 95% and p values <0.05 were considered statistically significant. Results: Disease-free survival at 5 and 10 years was 82.2% and 68%, and overall survival 90.2% and 82.9%, respectively. Number of positive lymph nodes (p= 0.00; p= 0.03), tumor diameter (p= 0.01; p= 0.01) and stage (p= 0.00; p= 0.02) were isolated risk factors for relapse and death, respectively. HER2 overexpression was an isolated risk factor for relapse (p= 0.04). There was a significant positive correlation between: VEGF and MMP-9 (rs: 0.246; p= 0.023) and TIMP-2 and MMP-2 (rs: 0.358; p= 0.001). Significant associations were also recorded between the following variables: a) VEGF and progesterone receptor-positive status (p= 0.045); TIMP-2 and age ≥ 50 years (p= 0.002) and diameter ≤ 2.0 cm (p= 0.016); c) TIMP-1 and menarche ≤ 12 years (p= 0.038); d) greater diameter and high histologic grade (2: 19.3; p= 0.004), vascular invasion (2: 12.6; p= 0.006), axillary lymph node status (2: 8.6; p= 0.035), number of metastatic lymph nodes (2: 7.2; p= 0.028) and distant relapse (2: 4.0; p= 0.046); e) vascular invasion and axillary lymph node status and number of metastatic lymph nodes, both with 2: 24.7 and p= 0.000. Conclusion: Number of positive lymph nodes, tumor diameter, and stage were identified as isolated risk factors for relapse and death. HER2 overexpression is an isolated risk factor for the occurrence of relapse. Further studies are needed, with standardization of the procedure and a larger number of cases, for better characterization of the disease.

Photorhabdus é um gênero de enterobactérias simbiontes de Heterorhabditis, um gênero de nematoides entomopatogênicos. Dentre as enzimas secretadas por P. luminescens TTO1, destaca-se PrtA, uma metaloprotease que pertence a subfamília das serralisinas. PrtS, uma protease capaz de induzir uma forte resposta de melanização no inseto, foi identificada em P. temperata Az29 mas não em P. luminescens TTO1. Neste trabalho foram detectadas e caracterizadas bioquimicamente algumas proteases secretadas pelo isolado MN7 de P. luminescens luminescens. Foram detectadas duas atividades mais proeminentes: uma de 50 kDa, e outra de 38 kDa. Com o sequenciamento do genoma desta bactéria, pudemos confirmar a presença no genoma de genes codificando proteínas de alta identidade com as descritas PrtA e PrtS, de massas similares às detectadas nas nossas zimografias. As proteases são inibidas por inibidores específicos de metaloproteases. P. luminescens MN7 apresenta secreção, portanto, de uma protease já descrita algumas vezes, e de outra presente apenas em P. temperata Az29. / Photorhabdus is a genus of Enterobacteriaceae, symbionts of Heterorhabditis, a genus of entomopathogenic nematodes. Among the enzymes secreted by P. luminescens TTO1 stands out PrtA, a metalloprotease that belongs to the subfamily of serralysins. PrtS, a protease capable of inducing a strong melanotic response from the insect, was identified in P. temperata Az29 but not in P. luminescens TTO1. In this work were detected and characterized biochemically few isolated proteases secreted by P. luminescens luminescens MN7. Two most prominent activities were detected: one with 50 kDa and one with 38 kDa. With the sequencing of the genome of MN7, we could confirm the presence in the genome of genes encoding proteins with high identity to PrtA and PrtS already described, with similar masses to those detected in our zimographies. These proteases are inhibited by specific inhibitors of metalloproteases. P. luminescens MN7 secretes a protease already described a few times, and other present only in P. temperata Az29.

Submitted by ANTONIO BACCARO null (antbaccaro@bol.com.br) on 2017-10-18T15:24:30Z No. of bitstreams: 1 Versão final Tese Doutorado 3 agosto 2017 Final - Antonio Baccaro Resumo ok.pdf: 1139639 bytes, checksum: 4b20e04d1939d61e79ee5c360ae47acc (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-10-23T18:59:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 baccaro_a_dr_bot.pdf: 1139639 bytes, checksum: 4b20e04d1939d61e79ee5c360ae47acc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-23T18:59:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 baccaro_a_dr_bot.pdf: 1139639 bytes, checksum: 4b20e04d1939d61e79ee5c360ae47acc (MD5) Previous issue date: 2017-08-28 / Introdução: A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica que acomete não apenas articulações, mas também outros órgãos, como por exemplo, o coração. A inflamação sistêmica exerce papel fundamental no desenvolvimento do acometimento articular e extra-articular. Dessa forma, existe risco aumentado para doença coronariana em pacientes com AR. É possível acometimento direto do coração desencadeando o processo de remodelação cardíaca, como a hipertrofia e alterações de geometria cardíaca, que podem passar anos sem causar sintomas. Outra característica particular da AR e também relacionada com a inflamação crônica é o fato de apresentarem composição corporal com fenótipo mais voltado para o sobrepeso, mas com a possibilidade de terem massa muscular reduzida. A obesidade, por si, já eleva o risco para acometimento cardíaco, entretanto, pouco se sabe sobre a participação de variáveis da composição corporal e de alguns marcadores inflamatórios na remodelação cardíaca de pacientes com AR. Objetivos: Avaliar se variáveis da composição corporal e inflamação, avaliada por metalopreteaases (MMP-2 e MMP-9), associam-se à remodelação e função cardíaca. Metodologia: Foram estudados 71 pacientes com AR, submetidos a avaliação clínica, antropométrica, da composição corporal por bioimpedância e densitometria de dupla emissão de radiação X, avaliação cardiológica por ecocardiografia transtorácica, avaliação da atividade inflamatória por DAS-28 e dosagem da atividade das metaloproteases. A regressão logística e linear foi realizada para avaliar a associação das variáveis com remodelação ventricular. Essas equações foram ajustadas por fatores que sabidamente influenciam na remodelação cardíaca, como hipertensão, DAS-28, idade, sexo. Resultados: A maioria dos pacientes são do sexo feminino, em média apresentam atividade leve da doença, sobrepeso e alta frequência de hipertensão. Em relação aos diagnósticos nutricionais, 90% apresentam porcentagem de gordura acima do normal, 20% apresentam porcentagem de gordura acima do normal e massa magra menor que P25%, e 14,6% apresentam sarcopenia, a razão entre água intracelular e extracelular sugerem hipervolemia. Ao avaliarmos os pacientes de acordo com a atividade da doença, observa-se que a MMP-9 está mais elevada em Abstract 3 paciente com atividade moderada e os pacientes com doença em atividade leve apresentam maior massa de gordura. O IMC, sarcopenia, porcentagem de gordura acima do normal e massa magra abaixo do P25% não explicaram a remodelação ventricular. A massa magra avaliada pelo DEXA associou-se com maior espessura relativa da parede e massa ventricular, mas a gordura não se associou a esses desfechos. A MMP-9 aumentou em 3,4 vezes o risco para aumento da ERP. Conclusão: A provável associação entre massa magra corporal e massa cardíaca provavelmente se deve a maior massa de água desses pacientes. Os métodos disponíveis não permitem a avaliação da água isolada da massa muscular. A MMP- 9 é um dos marcadores mais estudados nas articulações, mas percebe-se que sua concentração sérica também poderia associar-se a desfechos extracardíacos. / Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that affects not only joints, but also other organs, such as the heart. Systemic inflammation plays a fundamental role in the development of joint and extraarticular involvement. Thus, there is an increased risk for coronary disease in patients with RA. Direct heart involvement can be triggered by the process of cardiac remodeling, such as hypertrophy and changes in cardiac geometry, which can go years without causing symptoms. Another particular feature of AR and also related to chronic inflammation is the fact that they present a body composition with a phenotype more focused on being overweight, but with the possibility of having reduced muscle mass. Obesity, by itself, already raises the risk for cardiac involvement, however, little is known about the participation of body composition variables and some inflammatory markers in the cardiac remodeling of RA patients. Objectives: To evaluate whether body composition and inflammation variables, evaluated by metalloptreteaases (MMP-2 and MMP-9), are associated with remodeling and cardiac function. Methodology: A total of 71 patients with RA underwent clinical, anthropometric evaluation of the body composition by bioimpedance and dual emission X-ray densitometry, cardiac evaluation by transthoracic echocardiography, evaluation of inflammatory activity by DAS-28 and dosage of metalloprotease activity. Logistic and linear regression were performed to evaluate the association of variables with ventricular remodeling. These equations were adjusted by factors known to influence cardiac remodeling, such as hypertension, DAS-28, age, sex. Results: Most of the patients are female, on average they have mild disease activity and are overweight, with a high frequency of hypertension. In relation to nutritional diagnoses, 90% had a percentage of fat above normal, 20% had fat percentage above normal and lean mass lower than P25%, and 14.6% presented sarcopenia, the ratio between intracellular and extracellular water suggest hypervolemia. When evaluating the patients according to the activity of the disease, it is observed that MMP-9 is higher in patients with moderate activity and patients with disease in mild activity have higher fat mass. BMI, sarcopenia, percentage of fat above normal and lean mass below P25% did not explain ventricular remodeling. The lean mass assessed by DEXA was associated with a greater relative thickness of the wall and ventricular mass, but fat was not associated with these outcomes. MMP-9 increased by 3.4 times the risk for increased PRS. Conclusion: The probable association between lean body mass and heart mass is probably due to the greater body mass of these patients. The available methods do not allow the evaluation of water isolated from muscle mass. MMP-9 is one of the most studied markers in the joints, but it is perceived that its serum concentration could also be associated with extracardiac outcomes.

Introdução: A Organização Mundial da Saúde estimou para o ano de 2008 aproximadamente 1.38 milhões de casos novos de câncer de mama no mundo e 458 mil mortes. A maioria dos casos (56%) e das mortes (64%), ocorrendo em países economicamente desenvolvidos. Apesar dos avanços e do diagnostico precoce, um número significativo de mulheres com tumores da mama operáveis apresentando evolução desfavorável vêm à sucumbir devido ao surgimento de doença metastática. Uma melhor compreensão da heterogeneidade do tumor e das características microambientais subjacentes, bem como dos mecanismos e as consequências das suas interações é essencial para melhorar o direcionamento das terapias existentes e desenvolver novos agentes terapêuticos para o câncer. Objetivos: Descrever as características clínicas, anatomopatológicas e imuno-histoquímicas de um grupo de pacientes com câncer de mama operável, e estudar o impacto destas características no estadiamento da doença, sobrevivência livre de recorrência e sobrevivência global. Além disto, analisar as potenciais correlações existentes entre estas características. Métodos: Estudo de coorte retrospectiva de base hospitalar envolvendo 86 mulheres com câncer primário de mama, submetidas a tratamento entre julho de 1999 e dezembro de 2004, no Serviço de Mastologia do Hospital de Clinicas de Porto Alegre. Dados clinicopatológicos e imuno-histoquimicos (RE, RP, HER2, Ki67 e p53) foram coletados dos registros hospitalares. Expressão do VEGF, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2 foram analisadas através de imuno-histoquimica. Variáveis contínuas foram analisadas pelo coeficiente de correlação de Spearman, ou pelo teste não paramétrico U de Mann-Whitney e H de Kruskal-Wallis, quando comparadas com variáveis categóricas. Variáveis categóricas foram analisadas pelo teste 2 de Pearson. Estimativas da probabilidade de sobrevivência foram obtidas pelo estimador não paramétrico de Kaplan-Meier e pelo semiparamétrico modelo de regressão de Cox. Comparação entre as curvas de sobrevivência foi realizada pelo teste estatístico de log-rank. O IC foi calculado em 95% e valores p< 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Resultados: A sobrevivência livre de recorrência em 5 e 10 anos foi de 82,2% e 68%, e a global foi de 90,2% e 82,9%, respectivamente. Número de linfonodos positivos (p= 0,00; p= 0,03), diâmetro tumoral (p= 0,01; p= 0,01) e estádio (p= 0,00; p= 0,02) são fatores de risco isolado para recorrência e óbito, respectivamente. Superexpressão de HER2 é um fator de risco isolado para recorrência (p= 0,04). Existe uma correlação positiva significativa entre: VEGF e MMP-9 (rs: 0,246; p= 0,023); TIMP-2 e MMP-2 (rs: 0,358; p= 0,001). Também foram encontradas associações significativas entre as variáveis: a) VEGF e receptor de progesterona positivo (p= 0,045); b) TIMP-2 e idade ≥ 50 anos (p= 0,002), e diâmetro ≤ 2,0 cm (p= 0,016); c) TIMP-1 e menarca ≤ 12 anos (p= 0,038); d) Maior diâmetro e alto grau histológico (2: 19,3; p= 0,004), invasão vascular (2: 12,6; p= 0,006), status do linfonodo axilar (2: 8,6; p= 0,035), número de linfonodos metastáticos (2: 7,2; p= 0,028), e recidiva a distancia (2: 4,0; p= 0,046); e) Invasão vascular e status do linfonodo axilar, e número de linfonodos metastáticos, ambos com 2: 24,7; p= 0,000. Conclusões: O número de linfonodos positivos, diâmetro tumoral, e estádio foram identificados como fatores de risco isolado para a ocorrência de recidiva e óbito. A superexpressão de HER2 é fator de risco isolado para a ocorrência de recidiva da doença. Novas pesquisas devem ser realizadas, com padronização de procedimento e um maior número de casos para melhor caracterização da doença. / Background: The World Health Organization estimated approximately 1.38 million new breast cancer cases and 458,000 deaths worldwide for 2008. Most of these (56% of new cases and 64% of deaths) occur in economically developed countries. In Brazil, approximately 52,000 new cases are predicted for 2013. Better understand the heterogeneity of the tumor and microenvironmental characteristics around you, as well as the mechanisms and consequences of their interactions is essential to improve the targeting of existing therapies and develop new therapeutic agents for cancer. Objectives: The aim of this study was to describe the clinical, anatomopathological and immunohistochemical characteristics of a group of patients with operable breast cancer, and investigate the impact of these characteristics on disease staging, disease-free survival and overall survival. In addition, the potential correlations between these characteristics were analyzed. Methods: This is a hospital-based retrospective cohort study of 86 women with primary breast cancer, subjected to surgical and adjuvant treatment between July 1999 and December 2004. Clinicopathological and immunohistochemical (ER, PR, HER2, Ki67 e p53) data were collected from hospital records. The expression of VEGF, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 was analyzed using the immunohistochemical technique. Continuous variables were assessed with Spearman’s rank correlation coefficient, or the non-parametric Mann-Whitney U or Kruskal-Wallis H tests. Pearson’s 2 test was employed to asses categorical variables. The possibility of survival was estimated using the non-parametric Kaplan-Meier estimator and the semiparametric Cox regression model. Survival curves were compared using the statistical log-rank test. CI was calculated at 95% and p values <0.05 were considered statistically significant. Results: Disease-free survival at 5 and 10 years was 82.2% and 68%, and overall survival 90.2% and 82.9%, respectively. Number of positive lymph nodes (p= 0.00; p= 0.03), tumor diameter (p= 0.01; p= 0.01) and stage (p= 0.00; p= 0.02) were isolated risk factors for relapse and death, respectively. HER2 overexpression was an isolated risk factor for relapse (p= 0.04). There was a significant positive correlation between: VEGF and MMP-9 (rs: 0.246; p= 0.023) and TIMP-2 and MMP-2 (rs: 0.358; p= 0.001). Significant associations were also recorded between the following variables: a) VEGF and progesterone receptor-positive status (p= 0.045); TIMP-2 and age ≥ 50 years (p= 0.002) and diameter ≤ 2.0 cm (p= 0.016); c) TIMP-1 and menarche ≤ 12 years (p= 0.038); d) greater diameter and high histologic grade (2: 19.3; p= 0.004), vascular invasion (2: 12.6; p= 0.006), axillary lymph node status (2: 8.6; p= 0.035), number of metastatic lymph nodes (2: 7.2; p= 0.028) and distant relapse (2: 4.0; p= 0.046); e) vascular invasion and axillary lymph node status and number of metastatic lymph nodes, both with 2: 24.7 and p= 0.000. Conclusion: Number of positive lymph nodes, tumor diameter, and stage were identified as isolated risk factors for relapse and death. HER2 overexpression is an isolated risk factor for the occurrence of relapse. Further studies are needed, with standardization of the procedure and a larger number of cases, for better characterization of the disease.

Lesão hepática é uma das complicações decorrentes de pancreatite aguda (PA) e mostra uma correlação positiva com a gravidade da doença. Recentemente foi demonstrado que tratamento com solução hipertônica (SH) reduz inflamação e mortalidade na PA. O presente trabalho investigou os efeitos de SH na modulação do estresse oxidativo, apoptose e remodelamento tecidual no fígado durante a PA. Ratos machos foram divididos em quatro grupos: C animais que não foram submetidos à PA ou tratamento; past animais submetidos à indução de PA e que não receberam tratamento; pas animais submetidos à PA e tratados com solução fisiológica (NaCl 0.9%); pah animais submetidos à indução de PA e que receberam SH (NaCl 7.5%). PA foi induzida pela injeção retrógrada de ácido taurocólico (2.5%) no ducto bilo-pancreático. Após 4, 12 e 24 horas os animais foram sacrificados para coleta das amostras de interesse (fígado e plasma) submetidas a ensaios para análise de expressão (western blot e PCR) de Óxido Nítrico Sintase induzível (iNOS), metaloproteinases (MMP) -2 e -9, Heat Schock Protein (HSP) 47, 60, 70 e 90, colágenos tipos I e III, caspases 2 e 9, APAF-1 e AIF, formação de nitrotirosina (imunohistoquímica), peroxidação lipídica (TBARs), atividade de alaninoaminotransferase (ALT), produção de nitrito/nitrato (Reação de Griess) e das citocinas TNF-, IL-1, IL-6 e IL-10 (ELISA). O tratamento com SH reduziu significantemente o estresse oxidativo hepático com a redução da expressão gênica de iNOS (p<0,01 vs. pas), dos níveis de nitrito/nitrato (P<0,01 vs. pas), liberação de ALT (p<0,01 vs. pas) e inibição da formação de peroxinitrito após 12 horas da indução de PA. Conseqüentemente, a expressão de HSP70 não foi ativada devido à proteção hepática causada pela administração de SH. A expressão e atividade de MMP-9 aumentaram significativamente nos grupos pas e past, entretanto o tratamento com SH manteve os níveis basais (p<0,05 vs. past, pas). Aumento da expressão de HSP47 e alterações na expressão de colágeno indicaram intenso remodelamento de matriz extracelular nos grupos não tratados ou tratados com solução fisiológica, permanecendo semelhante ao controle no grupo pah. Não ocorreram mudanças significativas na expressão das proteínas envolvidas no processo apoptótico. A SH diminui o estresse oxidativo no período crítico da PA, resultando na diminuição da lesão hepática e do remodelamento tecidual, mantendo dessa forma a integridade de matriz extracelular / It has been shown an hepatic injury following pancreatitis and a positive correlation with severity of the disease. Hypertonic Solution (HS) reduced morbidity and mortality in experimental pancreatitis. We hypothesize that hypertonic solution resuscitation of acute pancreatitis (AP) may exert antiinflammatory effects by modulating hepatic oxidative stress, apoptosis and matrix extracellular remodeling in liver. Wistar rats were divided in four groups: C- control animals not subjected to insult or treatment; NT- subjected to pancreatitis induction and receiving no treatment; NS- subjected to pancreatitis induction and receiving normal saline (0.9% NaCl); HSsubjected to pancreatitis induction and receiving hypertonic saline (7.5% NaCl). AP was induced by retrograde infusion of 2,5% sodium taurocholate into the pancreatic duct transduodenally. At 4, 12 and 24 h following pancreatitis induction, liver tissue samples were assayed in order to analyse expression of metalloproteinases (MMPs) -2 and -9, iNOS, collagens (type I and III), Heat Shock Proteins (HSPs) 47, 60, 70 and 90, caspases -2 and -7, APAF-1 and AIF, production of the cytokines TNF-, IL-1, IL-6 and IL-10, Nitrite/nitrate and ALT, Lipid peroxidation and formation of Nytrotirosine. Hypertonic solution resuscitation significantly modulates the oxidative stress in liver by reduction of iNOS gene expression (p<0,01 vs. NS), nitrite and nitrate levels (p<0,01 vs. NS), lipid peroxidation (p<0,05 vs. NT), ALT release (p<0,01 vs. NS) and peroxinitrite inhibition after 12 hours of pancreatitis induction. Consequently, the HSP70 production has not been activated due to the hypertonic solution effect in hepatic protection. At 4 h and 12 h, MMP-9 expression and activity increased in the NS and NT groups, although remaining at basal levels in the HS group (p<0.05 vs. past, pas). At 12 h, MMP-2 expression increased in the NS group (p<0.05 vs. c) but not in the HS group. At 4 h after pancreatitis induction, HSP47 expression increased in the NS and NT groups. Greater extracellular matrix remodelling occurred in the NS and NT groups than in the HS group, probably as a result of the hepatic wound-healing response to repeated injury. However, the collagen content in hepatic tissue remained at basal levels in the HS group. The proteins involved in apoptosis remained unchanged in all groups. Hypertonic saline is hepatoprotective, since it decreases oxidative stress in the critical time resulting in diminished liver damage, reducing hepatic remodelling, maintaining the integrity of the hepatic extracellular matrix during pancreatitis. Hypertonic saline-mediated regulation of MMP expression might have clinical relevance in pancreatitis-associated liver injury

Orientador: Edson Rosa Pimentel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T11:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guerra_FlaviaDaRe_D.pdf: 2578763 bytes, checksum: 4d00d5fa99bb0b97be32b1a4af7e825a (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O tendão calcanear é o tendão mais acometido por ruptura, particularmente em atividades esportivas. O processo de cicatrização resulta em uma matriz extracelular (MEC) menos organizada o que reduz sua resistência à tensão e torna-o mais susceptível à recorrência de lesões. A terapia com o laser de baixa potência (LBP) tem se mostrado efetiva, porém existem resultados contraditórios com relação a seus protocolos. Propusemos-nos a avaliar os efeitos de diferentes terapias com o LBP em tendão calcanear parcialmente seccionado. Para tal foram utilizados ratos Wistar machos adultos, distribuídos em 7 grupos experimentais: G1- Tendão intacto; G2-Tendão seccionado; G3- lesão + LBP (4J/cm2-contínuo); G4- lesão + LBP (4J/cm2-20 Hz); G5- Tendão seccionado; G6- lesão + LBP (4J/cm2-contínuo); G7- lesão + LBP (4J/cm2-20 Hz até o 7º dia e 2 KHz do 8º ao 14º dia). G2, G3 e G4 foram eutanaziados no 8º dia após lesão, e G5, G6 e G7 no 15º dia. Foram realizadas as dosagens de proteínas não-colagênicas (PNC), glicosaminoglicanos (GAG) e hidroxiprolina (HOPro), além de eletroforese em gel de agarose, zimografia para MMP-2 e -9 e western blotting (WB) para colágeno I e III. O estudo estrutural foi feito por meio de lâminas coradas em hematoxilina-eosina (HE) e azul de toluidina (AT) além de análise e medidas de birrefringência por meio de microscopia de polarização. A análise funcional foi realizada por meio do Catwalk. Com relação à HOPro houve um decréscimo significativo em todos os grupos quando comparados ao G1, exceto G7. A dosagem de GAG revelou um aumento em todos os grupos exceto G5 e o gel de agarose mostrou um aumento no conteúdo de dermatan sulfado em todos os grupos transeccionados, sendo menos expressivo em G4 e G7. Nos cortes corados com AT os grupos transeccionados apresentaram maior metacromasia, em especial os grupos tratados. WB para colágeno I mostrou um aumento em G4 e G7. Quanto ao colágeno III G4 apresentou valores maiores quando comparado a G2. A zimografia para MMP-2 indicou maiores valores em G4 e G7. A MMP-9 aumentou em G3 e G4. A análise de birrefringência revelou acentuada desorganização em todos os grupos, com melhora significativa em G7. Os resultados do catwalk apontaram que, após a cirurgia os grupos que receberam o laser pulsado conseguiram apoiar melhor a pata quando comparado aos demais grupos. Nossos resultados mostram que o LBP contínuo e pulsado tem efeitos diferentes sobre o processo de reparo do tendão. O LBP pulsado atuou sobre o processo inflamatório possibilitando que o animal apoiasse melhor a pata ao caminhar e promoveu a síntese e organização do colágeno. Desta maneira acreditamos que este protocolo de tratamento pode ser adaptado para o uso em clínicas de reabilitação de maneira a acelerar o reparo e melhorar as características morfológicas, bioquímicas e funcionais deste tendão / Abstract: The Achilles tendon has a high incidence of rupture, particularly in sports activities. The healing process leads to a disorganized extracellular matrix (ECM) which reduces its tensile strength and lead to a high rate of injury recurrence. Low level laser therapy (LLLT) has been effective, but there are conflicting results regarding their protocols. Our purpose was to evaluate the effects of different therapies with LLLT in partially tenotomized Achilles tendon. Adult male Wistar rats were divided into 7 groups: G1 ? intact; G2 ? injured; G3 ? injured + LLL (4 J/cm2 continuous); G4 ? injured + LLL (4 J/cm2 ? 20 Hz); G5 ? injured; G6 ? injured + LLL (4 J/cm2 continuous); and G7 ? injured + LLL (4 J/cm2 ? 20 Hz until the 7th day and 2 kHz from 8?14 days). G2, G3 and G4 were euthanized 8 days after injury, and G5, G6 and G7 were euthanized on the 15th day. Quantification of non-collagenous protein (NCP), glycosaminoglycans (GAG) and hydroxyproline (HOPro) was performed, in addition to electrophoresis on agarose gel, zymography for MMP-2 and -9, western blotting (WB) for collagen types I and III. The structural analysis was done by hematoxylin-eosin (HE) and toluidine blue (TB) staines with in addition to birefringence measurements and analysis by polarization microscopy. Functional analysis was performed using the gait assessment of the animals in the Catwalk. Regarding HOPro there was a significant decrease in all groups when compared to the G1, except G7. The dosage of GAG showed an increase in all groups except G5 and agarose gel showed an increase in the content of dermatan sulfat in all transected groups, being less expressive in G4 and G7. In sections stained with TB the tenotomized groups showed metachromasia, particularly the treated groups. WB for collagen I showed an increase in G4 and G7. In G4 collagen III showed higher values when compared to G2. The zymography for MMPs-2 showed higher values for G4 and G7. MMP-9 increased in G3 and G4. Analysis of birefringence showed marked disorganization in all groups, with a significant improvement in G7. The catwalk results showed that after surgery, G4 had better results when compared to other groups. Our results show that the continuous and pulsed LLLT has different effects on the process of tendon repair. Pulsed laser acted on the inflammatory process improving the gait and promoting collagen synthesis and organization. Thus we believe that this treatment protocol can be adapted for use in rehabilitation clinics in order to accelerate the repair and enhance the morphological, biochemical and functional characteristics of the tendon / Doutorado / Anatomia / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

La membrane basale (MB) est une feuille dense de matrice extracellulaire spécialisée qui sépare l'épithélium du tissu sous-adjacent. La pénétration des cellules à travers les barrières des MB, c’est appelée «invasion», est un processus important pour le développement normal des tissus et dans la métastase du cancer. Beaucoup a été compris sur la génétique et la signalisation sur comment les trous sont formés dans le MB pendant de l'invasion ont été compris. Cependant, les forces physiques impliquées sont moins comprises: comment la contractilité de la myosine participe à l'élimination de la MB et comment les différents facteurs de polymérisation de l’actine et les protéines de réticulation contribuent au processus invasif. Pour répondre à ces questions, nous avons étudié un événement d'invasion dans un processus de développement, l’invasion de la cellule anchre (AC) chez Caenorhabditis elegans. La rupture de la MB par l’AC est connue pour dépendre d'une protrusion riche en actine et de l'activité des métalloprotéases (MMP), similaire à l'invasion de cellules cancéreuses. Inactivation génique par RNAi de différents activateurs et nucléateurs de la polymérisation d'actine, et l'expression spécifiquement dans l'AC d'une forme négative dominante d'un activateur du complexe Arp2/3 a montré que l'invasion de l’AC dépendes fortement des filaments ramifiés formés via l'activation WASP / WSP-1 du complexe Arp2/3. La microscopie à haute résolution a indiqué que la protrusion invasive de l’AC était densément assemblée, en accord avec l'idée que la protrusion invasive était fortement ramifiée. Nous avons également montré qu'un autre activateur du complexe Arp2/3, WAVE / WVE-1, pouvait permettre une invasion lorsque WASP / WSP-1 était absent. Les formines semblaient ne pas de jouer un rôle majeur et les protéines de réticulation d'actine étaient également dispensables pour l’invasion de l’AC. Dans les vers de type normaux, nous avons observé que l'activité de la myosine n'était pas nécessaire pour l'invasion. Cependant, il a été rapporté que les cellules cancéreuses augmentent la contractilité de la myosine pour envahir en l'absence de protéases, nous avons donc utilisé un ver sans les cinq principales MMPs du génome du ver pour tester le rôle de la myosine dans ce contexte. L'invasion de l’AC a eu lieu dans en l’absence des MMPs, mais avec un retard. L’inactivation génique par RNAi de différents composants lies à l’activité de la myosine n'a pas amélioré le défaut d'invasion. En plus, la visualisation du cytosquelette d'actine dans les vers sans MMPs a révélé que l'actine était concentrée dans la protrusion de l’AC et à peine détectable dans le cortex, ce qui rendait improbable que la contraction de la myosine du cortex aiderait la compression cellulaire à travers de la MB comme il a été reporté dans les cellules cancéreuses en l'absence de protéases. Tous ces résultats ensemble, ont montré que la cellule invasive a adapté sa polymérisation de filaments d'actine ramifiée pour maintenir l'invasion dans différents contextes biochimiques et environnementaux. Cette plasticité est un point crucial qui doit être mieux compris pour développer de futurs traitements visant l'invasion de cellules cancéreuses. / Basement membrane (BM) is a dense sheet of specialized extracellular matrix that separates epithelia from underlying tissue. The penetration of cells through BM barriers, called “invasion”, is an important process during normal tissue development and in cancer metastasis. Much has been understood concerning the genetics and signaling of how holes are formed in the BM during invasion. However less is clear about the physical forces involved: how myosin contractility participates in BM removal and how different actin polymerization factors and crosslinkers contribute to the invasive process. To address these questions, we studied an invasion event in a developmental process, anchor cell (AC) invasion in Caenorhabditis elegans. AC breaching of the BM is known to depend on an actin-rich protrusion and the activity of matrix metalloproteases (MMPs), similar to cancer cell invasion. RNAi knockdown of different actin polymerization activators and nucleators, and expression of a dominant negative form of an Arp2/3 complex activator specifically in the AC showed that AC invasion depended strongly on branched filaments formed via WASP/WSP-1 activation of the Arp2/3 complex. Super-resolution microscopy indicated that the AC invasive protrusion was densely packed with filaments, in keeping with the idea that the invasive protrusion was highly branched. We further showed that another Arp2/3 complex activator, WAVE/WVE-1, could enable invasion when WASP/WSP-1 was absent. Formins appeared not to play a major role and actin cross-linking proteins were likewise dispensable for AC invasion. In wild type worms, we observed that myosin activity was not needed for invasion. However it has been reported that cancer cells upregulate myosin contractility to invade in the absence of proteases, so we used a worm deleted for the five main MMPs of the worm genome to test the role of myosin in this context. AC invasion took place in MMP- worms, but with a time delay. RNAi knockdown of different components of the myosin machinery gave no enhancement of the invasion defect. In addition visualization of the actin cytoskeleton in MMP- worms revealed that actin was concentrated in the AC protrusion and barely detectable in the cortex, making it unlikely that myosin contraction of the cortex was helping the cell squeeze through the BM as reported in cancer cells in the absence of proteases. All together these results showed that the invasive cell adapted its branched actin filament polymerization to maintain invasion in different biochemical and environmental contexts. This plasticity is a crucial point that needs to be better understood in order to develop future treatments targeting cancer cell invasion.

The primary contributor to Vibrio fischeri aminopeptidase activity is aminopeptidase N, PepN. Colonization assays revealed the pepN mutant strain to be deficient at forming dense aggregates and populating the host’s light organ compared to wildtype within the first 12 hours of colonization; however the mutant competed normally at 24 hours. To address the role of PepN in colonization initiation and establish additional phenotypes for the pepN mutant strain, stress response and other physiological assays were employed. Marked differences were found between pepN mutant and wildtype strain in response to salinity, acidity, and antibiotic tolerance. This study has provided a foundation for future work on identifying a putative role for V. fischeri PepN in regulating stress response.

A presença de inibidores no plasma e soro de animais resistentes ao veneno de serpentes, assim como no plasma ou soro de serpentes imunes a seu próprio veneno, é amplamente conhecida. Um grupo destes inibidores são os inibidores de metaloproteases do veneno de serpente (SVMPs), eles têm sido caracterizados do ponto de vista físico químico, porém a falta de informações estruturais e termodinâmicas acerca da sua inibição sobre as SVMPs, tem permanecido como um grande obstáculo para sua aplicação terapêutica ou desenvolvimento como ferramentas moleculares. Por tanto, isolamos um novo inibidor de metaloproteases a partir do soro de C. d. terrificus, por nós denominado crotaini, e realizamos a caracterização cinética de sua interação com a bothropasina, uma das principais metaloproteases do veneno de B. jararaca, e da mesma forma, caracterizamos cineticamente a interação desta metaloprotease com dos inibidores já conhecidos, DM40 e DM43, isolados do soro de D. marsupialis. Determinando as constantes cinéticas mediante cinética enzimática e ressonância plasmônica de superfície (SPR) no Biacore T200. Os valores obtidos permitiram estabelecer que a interação entre o crotaini e a bothropasina, é de alta afinidade, além de evidenciar a sua ligação de forma equimolar e estável. Assim mesmo, o crotaini apresentou uma constante de inibição menor às constantes determinadas para o DM40 e DM43. Adicionalmente, estudos de interação após tratamento quelante da enzima permitem prever que existem diferenças respeito aos domínios estruturais envolvidos na interação do crotaini com a bothropasina, em comparação aos inibidores DM40 e DM43. / The presence of inhibitors in plasma or serum from snake venom - resistant animals is well known. These inhibitors are also present in plasma and serum of snakes that are immune to their own venom. A group of these molecules are snake venom metalloprotease inhibitors (SVMPIs). Although the physicochemical properties of these inhibitors are well established, the lack of structural and thermodynamic information has been a bottleneck for their therapeutic use and development as molecular tools. In this work a new metalloprotease inhibitor was isolated from C. d. terrificus, and named crotaini. The kinetic interaction of crotaini with bothropasin, one of the main metalloproteases from the B. jararaca venom, was investigated. Similarly, the kinetic interactions of crotaini with the inhibitors DM40 and DM43, isolated from D. marsupialis serum, were also studied. The kinetic constants were determined by enzymatic kinetics and surface plasmonic resonance (SPR) in a Biacore T200. The obtained values enabled us to demonstrate the high affinity of the inhibitors toward the metalloprotease, achieved through an equimolar and stable complex formation. In addition, studies of interactions of the metaloprotease bothropasin with its inhibitors in the presence of chelant agents revealed differences between that established with crotaini as compared with those made with DM40 and DM43.

Variantes genéticas trombogênicas podem aumentar o risco de eventos adversos em pacientes com coronariopatia crônica. Estudos prévios demonstraram que o Haplótipo H2 do gene do receptor P2Y12 apresenta uma maior agregação plaquetária e está associado com a presença de isquemia arterial periférica. A metaloprotease ADAMTS13 é responsável pela clivagem do fator de von Willebrand e recentemente foi associada com doença isquêmica coronariana. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito das variantes genéticas funcionais trombogênicas dos Haplótipos H1 e H2 do receptor plaquetário P2Y12 e dos polimorfismos C1342G (Q448E), C1852G (P618A) e C2699T (A900V) da metaloprotease ADAMTS13 em 611 pacientes com doença arterial coronariana multiarterial com função ventricular preservada, acompanhados por um período de 05 anos no ensaio clínico do projeto MASS II (Medical, Angioplasty, or Surgery Study II) em relação aos eventos morte, infarto agudo do miocárdio, angina refratária necessitando um novo procedimento e acidente vascular cerebral. Neste estudo, a avaliação dos Haplótipos H1 e H2 nos pacientes do MASS II não encontrou diferença entre estes haplótipos e os eventos estudados. A análise dos polimorfismos da ADAMTS13 não encontrou associação entre os polimorfismos e os eventos estudados, exceto para a variante genética T2699 (Val900) que está associada com o evento morte (OR: 1,67 95%IC: 1-2,78, p= 0,049) e morte por causa cardiovascular (OR: 2,23 95%IC: 1,2-3,94, p=0,004) e apresenta uma diminuição na sobrevida livre de morte por causa cardíaca para os portadores do genótipo TT relacionado à este polimorfismo. A análise dos haplótipos e das combinações alélicas destes polimorfismos não apresentou associação com eventos ou com a sobrevida livre dos eventos nestes pacientes. / Thrombotic genetic variants could improve the risk of adverse events related to coronary arterial disease (CAD). P2Y12 platelet receptor H2 haplotype showed higher aggregation index and a positive association was described between such genetic variant and peripheral artery disease. DAMTS13 is a metaloprotease responsible to von Willebrand factor cleavage recently found correlated to CAD. We tested the genetic variants P2Y12 receptor H1 and H2 haplotypes and ADAMTS13 polymorphisms C1342G (Q448E), C1852G (P618A) and C2699T (A900V) in a group of 611 patients enrolled in the Medical, Angioplasty, or Surgery Study II (MASS II), a randomized trial comparing treatments for patients with coronary artery disease (CAD) and preserved left ventricular function in a follow up period of 05 years. The incidence of the end points of death and death from cardiac causes, myocardial infarction, refractory angina requiring revascularization and cerebrovascular accident was determined for P2Y12 H1 and H2 haplotypes and ADAMTS polymorphisms. In our study, we did not disclose any association between H1 or H2 haplotype groups regarding the incidence of any of the studied cardiovascular end-points. The association of ADAMTS13 genotypes and cardiovascular events did not showed any association between C1342G (Q448E), C1852G (P618A) variants and cardiovascular end points. Our date provide a strong association between T2699 variant and increased risk to death (OR: 1,67 CI: 1-2,78, p= 0,049) and cardiac death (OR: 2,23 CI: 1,2-3,94, p=0,004) in a population with CAD. The allelic combinations and haplotypes obtained from ADAMTS13 polymorphisms were not associated to cardiac end points and survival differences between MASS II patients.