SOUSA, J. C. Fatores Reguladores de Interferon (IRFs) em pacientes com Síndrome Mielodisplásica. 2015. 200 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceara, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-09-26T12:46:52Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_jcsousa.pdf: 1726859 bytes, checksum: b83c00c082a73dcf53401b31ef53acda (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-09-26T12:47:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_jcsousa.pdf: 1726859 bytes, checksum: b83c00c082a73dcf53401b31ef53acda (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-26T12:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_jcsousa.pdf: 1726859 bytes, checksum: b83c00c082a73dcf53401b31ef53acda (MD5) Previous issue date: 2015-07-20 / Myelodysplastic Syndrome (MDS) is characterized by peripheral cytopenias, defects in hematopoiesis, increased apoptosis and intramedullary risk of transformation to AML. Various advances have been made in understanding the pathogenesis of MDS and there is evidence that bone marrow failure that occurs in MDS is mediated by abnormal activation of signaling in the innate immune system. Interferon regulatory factors (IRF-Interferon Regulatory Factor) form a family of transcription factors that play a central role in regulating immune responses, differentiation and proliferation of hematopoietic cells, cell cycle regulation, apoptosis, and oncogenesis. It is believed that IRFs may have an important role in the pathogenesis of MDS. Therefore, the objective of this study was to evaluate the profile of methylation and gene expression of IRFs in bone marrow (BM) of patients with MDS. From samples of 119 patients diagnosed with MDS was conducted the study of gene expression by real-time PCR and methylation by QMSP (quantitative methilation specific PCR) of the nine family members of IRFs. The expression of genes IRF2, IRF3, and IRF7 IRF8 were different between BM cells of MDS patients and healthy individuals (P = 0.002, 0.002, 0.028 and 0.016, respectively). IRF1 a higher level of expression was associated in patients with hypocellular marrow (p = 0.018). The IRF3, and IRF7 IRF8 genes have been associated with patients in peripheral blood cytopenias (p = 0.028; 0.001; 0.008, respectively). Furthermore, methylation of IRF1, IRF2, IRF3, IRF6 and IRF8 was associated with higher risk characteristics in SMD, such as advanced forms, unfavorable karyotype, cytopenias, blast above 5% and high-risk categories established by IPSS, IPSS-R and WPSS. Multivariate analysis revealed that patients with higher expression of IRF3 had higher overall survival (p = 0.001), whereas patients with higher expression of IRF5 had 5.4 more likely to progress to AML (p <0.001 95% CI = 1098-26829 ) and 9 times more likely to come to death (p = 0.001, 95% CI 2.39 to 32.69). Ambiguously, patients with methylated IRF5 had 4 times more likely to come to death (p = 0.041, 95% CI 1.066 to 20,192). We can conclude that the expression and methylation of IRFs can have great impact prognosis in this disease. The expression of IRF3 is a favorable prognostic marker, while expression and methylation IRF5 are unfavorable prognostic markers in MDS. / A síndrome mielodisplásica (SMD) é caracterizada por citopenias periféricas, defeitos na hematopoese, aumento da apoptose intramedular e risco de transformação para LMA. Vários avanços têm sido realizados para o entendimento da patogênese da SMD e há evidências de que a falha na medula óssea que ocorre na SMD seja mediada pela ativação anormal da sinalização do sistema imune inato. Os fatores reguladores de interferon (IRF-Interferon Regulatory Factor) formam uma família de fatores de transcrição que possuem um papel central na regulação de respostas imunes, diferenciação e proliferação de células hematopoéticas, regulação do ciclo celular, apoptose e oncogênese. Acredita-se que os IRFs possam ter um papel importante da patogênese da SMD. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o perfil de metilação e expressão dos genes dos IRFs em células da medula óssea (MO) de pacientes com SMD. A partir de amostras de 119 pacientes com diagnóstico de SMD foi realizado o estudo da expressão gênica, por PCR em tempo real e da metilação por QMSP (quantitative methilation specific PCR) dos nove membros da família dos IRFs. A expressão dos genes IRF2, IRF3, IRF7 e IRF8 foram diferentes entre células de MO de pacientes com SMD e indivíduos saudáveis (p=0,002; 0,002; 0,028 e 0,016, respectivamente). Um maior nível de expressão do IRF1 foi associado a pacientes com medula hipocelular (p=0,018). Os genes IRF3, IRF7 e IRF8 foram associados a pacientes com citopenias no sangue periférico (p= 0,028; 0,001; 0,008, respectivamente). Por outro lado, a metilação dos IRF1, IRF2, IRF3, IRF6 e IRF8 foi associada a características de maior risco em SMD, tais como, formas avançadas, cariótipo desfavorável, citopenias, blastos acima de 5% e com categorias de alto risco estabelecidas pelo IPSS, R-IPSS e WPSS. A análise multivariada revelou que pacientes com maior expressão do IRF3 apresentaram maior sobrevida global (p=0,001), enquanto os pacientes com uma maior expressão do IRF5 apresentaram 5,4 mais chances de evoluir para LMA (p<0,001 IC95%=1.098-26.829) e 9 vezes mais chance de vir a óbito (p=0,001; IC95%=2,39-32,69). Ambiguamente, pacientes com o IRF5 metilado possuíam 4 vezes mais chance de vir a óbito (p=0,041; IC95%=1,066-20.192). Podemos concluir que a expressão e a metilação dos IRFs podem ter grande impacto prognóstico nessa doença. A expressão do IRF3 é um marcador de prognóstico favorável, enquanto a expressão e a metilação do IRF5 são marcadores de prognóstico desfavorável em SMD.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / Objetivos: O processo de envelhecimento e a maioria das neoplasias podem ser regulados por alterações epigenéticas, dentre elas a metilação do DNA. Este estudo tem como objetivos: a) analisar a frequência de metilação dos promotores dos genes SIRT1; SIRT3, hTERT, SMARCA5, CDH1, IGFBP3, CAV-1 no envelhecimento e no adenocarcinoma gástrico; b) avaliar a expressão das proteínas codificadas desses genes em tecidos gástricos tumoral e normal; c) associar resultados com dados clinicopatológicos da amostra. Métodos: A frequência de metilação desses genes foi analisada por PCR metilação-específica (MS-PCR) em amostras de linfócitos de jovens e idosos, bem como em adenocarcinoma gástrico e margens normais. A análise da expressão protéica foi realizada por imunoistoquímica. Resultados: Os promotores dos genes SIRT1 e IGFBP-3 apresentaram maior metilação em idosos, quando comparado ao grupo jovem. Além disso, dentre os sete genes estudados, cerca de 85% dos idosos apresentaram quatro ou mais desses genes hipermetilados, enquanto que entre jovens mais de 50% apresentou até três genes metilados (p=0,001). A proteína SIRT1 apresentou uma expressão seis vezes maior em tumores do que em tecido não neoplásico (p=0,0003), já SIRT3 apresentou maior expressão em tecido não neoplásico do que em tumoral (OR=0,313; p=0,005). SIRT3 encontrou-se mais frequentemente hipermetilado quando não havia expressão de sua proteína (p=0,0019). O gene hTERT apresentou-se mais frequentemente hipermetilado em amostras tumorais (p=0,0002) e sua expressão protéica foi observada somente em tumores (p<0,0001). SMARCA5 apresentou maior expressão no tecido neoplásico quando comparado com a margem do tecido gástrico (p<0,001) e a expressão de sua proteína estava associada à ausência de metilação do promotor gênico (p=0,0104). Caveolina-1 também foi mais frequentemente observada em tumores quando comparada ao não neoplásico (p<0,0001), principalmente no tipo intestinal (P=0,0008). A metilação do promotor do gene CAV1 foi associada à ausência de expressão em amostras tumorais (p=0,0001). Para IGFBP-3, foi observado ainda maior expressão em tumores do que em tecido não neoplásico (p<0,0001). CDH1 estava presente em 100% das amostras de tecido não neoplásico, diferindo do tumoral (p<0,0001). Conclusões: No processo do envelhecimento natural, ocorre um aumento da metilação em promotores de genes específicos com a idade, que pode influenciar a expressão gênica. Além disso, no câncer gástrico, as proteínas SIRT1, hTERT, SMARCA5, CDH1, IGFBP-3 e CAV1 apresentaram uma maior expressão, podendo configurar bons biomarcadores e possíveis alvos terapêuticos. SIRT3 foi a única proteína com função protetora contra esse tipo tumoral. A regulação epigenética pela metilação do DNA parece ocorrer em tecido gástrico somente para os genes SIRT3, SMARCA5 e CAV1, porém a análise da metilação dos genes hTERT e CDH1 também pode servir como marcador para a neoplasia estudada. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agráricas, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-22T04:08:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334785.pdf: 5476214 bytes, checksum: 01a514e031f6dc667dbbc296f2367b67 (MD5) Previous issue date: 2015 / O abacaxizeiro comercial (Ananas comosus var. comosus), pertencente à família Bromeliaceae, teve iniciada sua domesticação no norte da América do Sul entre 6.000 e 10.000 anos atrás. Em 1492, quando os europeus chegaram às Américas, o abacaxizeiro já estava disperso por toda a América tropical e parte da subtropical. Nos séculos seguintes ele foi espalhado pelo mundo e se consolidou como uma espécie frutífera de importância econômica mundial. A produção comercial desta cultura repousa sobre uma estreita base genética e tem como principais fontes de propágulos mudas reproduzidas vegetativamente, as quais podem disseminar pragas e doenças. Ferramentas biotecnológicas compreendem um expressivo arranjo de tecnologias que podem auxiliar a caracterização, o melhoramento e a multiplicação rápida e massiva de genótipos de abacaxizeiro. Neste sentido, um maior conhecimento sobre a diversidade genética existente na espécie pode possibilitar a expansão da oferta de genótipos para o plantio comercial, ao mesmo tempo em que possibilita uma maior eficiência no planejamento e na execução de programas de melhoramento genético e de conservação de germoplasma. Por sua vez, técnicas de micropropagação possibilitam a propagação rápida e em larga escala de mudas isentas de pragas e doenças a partir de genótipos-elite, configurando alta qualidade fitossanitária e genética. Entretanto, as mudas micropropagadas de abacaxizeiro normalmente apresentam um alto custo quando comparado ao custo das mudas produzidas via reprodução vegetativa convencional. Desta forma, a combinação de altas taxas regenerativas associadas ao emprego do meio de cultura líquido em um protocolo de organogênese convencional em imersão permanente e ao protocolo via culturas nodulares (CN) em sistemas de imersão temporária podem se configurar em avanços expressivos na micropropagação do abacaxizeiro, desde que eles mantenham a fidelidade genética das plantas regeneradas. Levando em conta estes aspectos, a presente tese objetivou: a) analisar o nível de ploidia do abacaxizeiro ?Gigante de Tarauacá?, variedade tradicional do estado do Acre; b) aperfeiçoar o protocolo baseado em CN associadas a sistemas de imersão temporária na fase de crescimento de brotos; c) estudar os níveis de metilação do DNA global (NMDG) e os incrementos de massa fresca (IMF) durante as fases de multiplicação de CN e de diferenciação de CN para microbrotos, bem como avaliar por meio das análises de AFLP, nível de ploidia e de características morfológicas a fidelidade genética das mudas oriundas deste sistema regenerativo; e, d) analisar por meio de características morfológicas a fidelidade genética de plantas jovens e adultas que foram micropropagadas ao logo de sucessivas repicagens via organogênese convencional em imersão permanente e via CN associadas a sistemas de imersão temporária. Os resultados obtidos mostram que: a) a cultivar ?Gigante de Tarauacá? é triplóide (2n=3x=75); b) o sistema de imersão temporária em frascos duplos associado ao meio de cultura livre de fitorreguladores na fase de crescimento de brotos alia alta eficiência regenerativa e sincronismo no desenvolvimento de brotos vigorosos; c) os NMDG apresentaram-se dinâmicos nas duas fases estudadas e estavam associados ao IMF e a idade das culturas, por sua vez, as análises baseadas em AFLP, nível de ploidia e em características morfológicas indicaram que as plantas regeneradas mantiveram-se homogêneas; e, d) plantas de A. comosus var. comosus regeneradas via organogênese convencional e via CN mostraram-se homogêneas entre si, enquanto plantas da var. bracteatus regeneradas via organogênese convencional apresentaram uma maior susceptibilidade à ocorrência de variações morfológicas. Tomados em conjunto, os resultados da presente tese ampliam o conhecimento associado ao uso, conservação e melhoramento do abacaxizeiro.<br> / Abstract : The domestication of commercial Pineapple (Ananas comosus var. comosus), belonging to the Bromeliaceae family, started between 6000 and 10000 years ago in the Guiana?s Shield. In 1492, when Europeans arrived in America, Pineapple was spread in low lands of the tropical America and regions of the subtropical America. In the following centuries Pineapple was spread in the world and was consolidated as one of the world?s most economically important fruit species. The commercial production of this species is based in a narrow genetic base and the conventional vegetative propagation based on suckers allows the dissemination of pest and diseases. Biotechnological tools include an expressive arrangement of technologies that can assist the characterization, the improvement, and the fast and massive micropropagation of selected pineapple genotypes. In this way, a better knowledge about the genetic diversity in this species may allow the expansion of the genotypes used in commercial plantation, at the same time allowing a higher efficiency in the planning and execution of genetic improvement and conservation programs. In turn micropropagation techniques allow the fast and massive production of pest- and disease-free stock plants from elite genotypes, resulting in plantlets with high genetic and phytosanitary quality. However, the micropropagated plantlets present higher costs when compared to the vegetative stocks production costs. In this way, the combination of high regenerative rates associated with permanent immersion in liquid medium for conventional organogenesis or use of temporary immersion with bioreactors for nodule cluster cultures (NC) micropropagation may result in significant advances for pineapple micropropagation. However genetic fidelity must be guaranteed for regenerated plants. Taking these aspects into account, the present thesis aimed at: a) to analyze the ploidy level of pineapple ?Gigante de Tarauacá?, a traditional landrace from Acre state, North Brazil; b) to improve the protocol via NC associated with bioreactors of temporary immersion systems in the phase of shoots elongation; c) to study the global DNA methylation levels (GDML) and the fresh mass increase ratio (FMIR) during NC multiplication and differentiation to microshoots, as well as to evaluate the genetic fidelity through the analyzes of AFLP, ploidy level and morphological characteristics of regenerated plants; d) to analyze the genetic fidelity through morphological characteristics in young and adults plants that were micropropagated over successive subcultures via conventional organogenesis in permanent immersion and via NC associated with temporary immersion systems. The results showed that: a) the cultivar ?Gigante de Tarauacá? is triploid (2n=3x=75); b) the twin flask temporary immersion system associated with culture medium free of plant growth regulation in the phase of shoots elongation combine high regenerative efficiency and synchronism in the development of vigorous shoots; c) the GDML in both phases were dynamics and associated to the FMIR and to the cultures age, in turn, the analysis of AFLP, ploidy level and morphological features indicated homogeneity in the regenerated plants; and d) regenerated plants of A. comosus var. comosus via conventional organogenesis and via NC showed homogeneity between them, while regenerated plants of A. comosus var. bracteatus via conventional organogenesis showed a higher susceptibility to the occurrence of variant plants. Taking together, the results of this thesis expand the knowledge associated with the use, conservation and genetic improvement of pineapple.

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:14:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 suzana_cardozo_ioc_dout_2014.pdf: 2843989 bytes, checksum: 86fbef7b8c97536a2ad4ba706de60d31 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Inibidores de PDE4 atuam aumentando as concentrações intracelulares de AMPc, um segundo mensageiro com várias ações anti-inflamatórias em células efetoras envolvidas na patogênese da asma e DPOC. Nesta tese foram avaliados 8 compostos de uma nova série de inibidores de PDE4, pertencentes à classe das N-metil-N-acilidrazonas (NAHs), com base em modelos experimentais de inflamação e remodelamento pulmonar, visando-se identificar potenciais novos agentes terapêuticos para doenças inflamatórias pulmonares. Foram quantificados leucócitos infiltrados no tecido pulmonar, a geração de citocinas, resistência e elastância pulmonar, fibrose e a produção de muco nas vias aéreas de camundongos A/J estimulados, por via intranasal, com LPS ou alérgeno. Todas as analises foram realizadas 18 ou 24 h após a última provocação. Culturas primárias de linfócitos e fibroblastos foram também empregadas para estudo de impacto dos tratamentos ao nível celular. O potencial pro-emético dos compostos mais promissores foi indiretamente investigado com base no ensaio de tempo de anestesia induzido pela mistura de quetamina e xilazina. O tratamento com agentes NAHs (100 \03BCmol/kg, oral), exceto LASSBio-1393, inibiu acentuadamente a hiper-reatividade das vias aéreas (AHR), o infiltrado leucocitário e a produção de citocinas, de forma comparável ao observado para rolipram e cilomilast Observou-se que os NAHs foram também ativos no bloqueio terapêutico da resposta asmática alérgica desencadeada por ovoalbumina (OVA). Neste modelo, somente LASSBio-1406 e LASSBio-1407 foram capazes de reverter todas as alterações patológicas avaliadas, incluindo o infiltrado eosinofílico, a fibrose peribrônquica e a mucogênese, claramente refratários ao tratamento com o inibidor de referência de PDE4 rolipram. O perfil de ação diferenciada do composto LASSBio-1407 foi também confirmado na reversão das respostas de infiltração eosinofílica, secreção de citocinas, hiperreatividade e remodelamento das vias aéreas no modelo de asma induzida por HDM, em condições onde o composto de referência cilomilast mostrou eficácia comparativamente menor. Ambos LASSBio-1406 e LASSBio-1407 foram também mais potentes do que cilomilast e rolipram no bloqueio da ativação e resposta proliferativa de linfócitos e fibroblastos em sistemas in vitro. Por ultimo, constatou-se que a administração oral de LASSBio-1406 e LASSBio-1407, diferentemente do observado com rolipram e cilomilast, não modificaram o tempo de sono induzido por quetamina e xilazina, realçando o menor potencial pró-emético dos compostos NAHs destacados Tomados em conjunto, os resultados apontam os derivados LASSBio-1406 e o LASSBio-1407, como os mais promissores na série estudada de agentes N-metil-Nacilidrazônicos, inibidores de PDE4, pelo amplo perfil de ação sobre alterações patológicas cruciais associadas à asma, bem como pelo menor impacto sobre efeitos adversos próeméticos. Os compostos LASSBio-1406 e LASSBio-1407 são certamente, dentre os compostos testados, protótipos moleculares de forte potencial terapêutico no tratamento de doenças inflamatórias pulmonares crônicas / Inhibitors of phosphodiesterase type 4 (PDE4) act by increasing intracellular concentrations of cyclic AMP, which has a broad range of anti - inflammatory effects on various key effector cells involved in asthma and chronic obstructive pulmo nary disease (COPD). In this study we have evaluated eight compounds of a new series PDE4 inhibitors, which belong to the class of N - methyl - N - acylhydrazones (NAHs), using experimental models of lung inflammation and remodeling order to identify potential new therapeutic agents for pulmonary inflammatory diseases. Local change in l eukocyte levels , cytokines production , airway hyper - reactivity (A HR ) and remodeling were examined in A/j mice challenged intranasally with LPS or allergen. All analyzes were performed 18 or 24 h after the last challenge. Primary Cultured lymph node cells and fibroblasts were also used to assess the effects of NAHs at th e cellular level. Potential provoke emesis of the more promising compounds was investigated indirectly based on the test sleep time induced by mixture of ketamine and xylazine. NAHS derivative (100 μ mol/kg, v.o. ), except LASSBio - 1393, markedly inhibited th e AHR, leukocyte infiltration and cytokine production, in a comparable manner to that observed in rolipram and cilomilast. We found that NAHs derivates were also active in the therapeutic blockade of ovalbumin - evoked allergic asthmatic response. In this mo del, only LASSBio - 1406 and LASSBio - 1407 were able to reverse all pathological changes, incl uding eosinophilic infiltrate, p eribronchial fibrosis and mucus exacerbation clearly refractory to treatment with the PDE4 inhibitor rolipram. The distinguished the action profile of LASSBio - 1407 compound was also confirmed in the reversal of eosinophilic inflammation responses, cytokine secretion, hyperresponsiveness and airway remodeling in asthma model induced by HDM, in conditions where the reference compost cilom ilast showed efficacy compared lower. Both LASSBio - 1406 and LASSBio - 1407 were also more potent than rolipram, and cilomilast in blocking the activation and proliferative response of lymphocytes and fibroblasts in vitro systems. Finally, it was found that o ral administration of LASSBio - 1406 and LASSBio - 1407, different from that observed with rolipram and cilomilast, did not change the sleep time induced by ketamine and xylazine, highlighting the lowest pro - emetic potential of posted N AHs compounds . Taken to gether, the results indicate th at LASSBio - 1406 derivatives and the LASSBio - 1407, as the most promising in the studied series of N AHs agents, PDE4 inhibitors, the broad profile of action on crucial pathological changes associated with asthma, as well as the smallest adverse i mpact on pro - emetic effects. LASSBio - 1406 and LASSBio - 1407 are certainly among the tested compounds, molecular p rototype strong therapeutic potential in the treatment of chronic pulmonary inflammatory diseases.

Resumo: O câncer de mama é o tipo mais comum e a principal causa de morte por câncer entre as mulheres no mundo todo. As metástases contribuem com 90% das causas de morte por câncer. O estudo de novos marcadores moleculares de câncer estão em amplo e atual desenvolvimento, tanto para diagnóstico como prognóstico da doença. Diversos estudos tem mostrado o papel de eventos epigenéticos entre eles a metilação do DNA, em regiões promotoras de genes como um evento importante no processo de tumorigênese em diversos tipos de câncer. No câncer de mama já foram descritos um grande número de genes envolvidos com controle da proliferação, adesão e migração celular que podem ser silenciados por mecanismos epigenéticos. O gene CXCL12 codifica para uma quimiocina ou citocina quimiotática, que é comprovadamente silenciado por metilação de sua região promotora em câncer gástrico, de cólon intestinal e de mama. O produto deste gene esta envolvido no processo migratório como molécula ligante de células tumorais que superexpressam o receptor CXCR4 e que migram e colonizam secundariamente pulmões ossos, fígado ou linfonodos que tem altos níveis de CXCL12. Nesse trabalho estudamos detalhadamente a região promotora do gene CXCL12 que contém 5 regiões ricas em dinucleotídeos CpGs (ilhas de CpG). As ilhas de CpG 1 ,2, 3 e 5 foram amplificadas, clonadas e sequenciadas a partir de DNA de sete linhagens tumorais de mama. A ausência ou presença de metilação do DNA de cada região foi correlacionado com a presença ou ausência de expressão do gene CXCL12. A ilha de CpG 1 apresentou-se hipermetilada em linhagens que expressam CXCL12, sendo assim essa região parece não participar do processo de silenciamento desse gene nessas linhagens. A ilha de CpG 2 que contém 1346 pb foi analisada em 2 partes sendo que a parte inicial que contém o nucleotídeo +1 apresentou-se fortemente correlacionada com a expressão do gene. Somente uma linhagem imortalizada, a HB4a apresentou 53,25% de metilação global, o que poderia interferir na expressão do gene. A segunda parte da ilha 2, assim como a ilha de CpG 3 e 5 apresentaram-se hipermetiladas nas linhagens que expressam o gene, e portanto essas regiões provavelmente não interferem na expressão do gene CXCL12 nessas linhagens tumorais. Por outro lado a ilha de CpG 4 localizada a cerca de 1500 pb de distância do início de transcrição e fora da provável região promotora, apresentou-se pouco metilada nas linhagens que expressam o gene e hipermetilada nas linhagens que não expressam CXCL12. Concluímos que as regiões denominadas ilhas de CpG 1 o terço final da Ilha de CpG 2, ilha de CpG 3 e 5 estão metiladas em linhagens que expressam o gene CXCL12 e assim sendo, não são importantes no processo de regulação da expressão desse gene. A Ilha de CpG 4 é a única região diferencialmente metilada e que parece atuar de modo a sinalizar o silenciamento do gene CXCL12.

Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica. Defesa: Curitiba, 18/11/2014 / Inclui referências / Resumo: As metástases são um grande problema para pacientes com câncer de mama, chegando a ser a causa de 90% dos casos de morte desta neoplasia. A proteína matriz metaloprotease 14 (MMP-14) tem uma importante contribuição no desencadeamento da migração celular nos carcinomas mamários, pela sua atividade proteolítica, e também pela ativação de outras metaloproteases solúveis capazes de degradar componentes da matriz extracelular. Sabe-se que a regulação do gene MMP14 está intimamente relacionada com aspectos epigenéticos, através da metilação de uma ilha de CpG localizada na região promotora. Estudos têm demonstrado que o padrão de metilação ao longo do corpo do gene também pode apresentar um importante papel na regulação da transcrição gênica e, para tanto, o objetivo deste estudo foi verificar o papel da metilação do corpo do gene MMP14 na regulação da expressão em diferentes linhagens tumorais de mama. As linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 e MCF-7 foram avaliadas quanto a expressão do gene estudado por RT-PCR e RT-qPCR. Duas regiões que continham ilhas de CpG, uma localizada na região promotora (-161 a +186) e outra no primeiro íntron do corpo do gene (+242 a +869), foram amplificadas e sequenciadas após o tratamento com bissulfito de sódio. Os resultados obtidos mostraram que as linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2 e PMC42 expressam o gene MMP14 e que suas taxas de metilação global, de ambas as ilhas de CpG avaliadas, não passam de 15%. Por outro lado, a linhagem MCF7 foi a única que não expressou o gene MMP14, e apresentou taxas de metilação global que ultrapassam 75%, em ambas as ilhas de CpG. Assim, mostrou-se uma correlação entre a ausência de expressão e alta metilação da ilha de CpG não só da região promotora, mas também da localizada no primeiro íntron. Estes resultados também permitiram a identificação de regiões diferencialmente metiladas nas linhagens de mama para padronização da técnica de MSP-PCR. A linhagem MCF7, quando submetida ao tratamento com os compostos desmetilantes (DAC) e inibidores desacetilantes de histona (TSA), passou a expressar o gene MMP14 e reduziu suas taxas de metilação global, indicando uma estreita relação entre epigenética e regulação deste gene incluindo a região intrônica. Nas regiões desmetiladas pelos tratamentos, foi possível identificar um sítio de ligação do fator de transcrição GLI3, que pode estar auxiliando na expressão de MMP14. Concluímos que a metilação da ilha de CpG localizada no íntron do gene MMP14 parece estar atuando cooperativamente com a região promotora para promover ou silenciar a transcrição do gene. Estudos de metilação no corpo do gene são recentes e, portanto, novos dados podem contribuir para entender a importância da metilação dessas regiões de DNA nos mecanismos de tumorigênese. Palavras-chave: Câncer de mama. MMP-14. Ilha de CpG intrônica. Metilação. / Abstract: Metastasis is a major problem for patients with breast cancer, being the cause of 90% of deaths from this neoplasia. The protein matrix metalloprotease 14 (MMP-14) has a major contribution in the initiation of cell migration in breast carcinomas, due to its proteolytic activity, and also by the activation of other soluble metalloproteases capable of degrading components of the extracellular matrix. It is known that the regulation of the MMP14 gene is closely related to epigenetic events by methylation of a CpG island located in the promoter region. Studies have shown that the methylation pattern along the body of the gene may also have a role in regulating gene transcription and, therefore, the aim of this study was to investigate the role of methylation in the body of MMP14 in regulating the expression of this gene in different breast tumor cell lines. The expression of the gene was evaluated by RT-PCR and RT-qPCR in the HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 and MCF-7 cell lines. Two regions containing CpG islands, one located in the promoter (-161 to +186), and another region in the first intron of the gene body (+242 to +869), were amplified and sequenced after treatment with sodium bisulfite. The results showed that the HB4aC3.6, HB4aC5.2 and PMC42 lines expressed MMP14 and their rates of global methylation of both CpG islands was no more than 15%. On the other hand, the MCF7 line was the only one that did not express the MMP14 gene and presented global methylation rates exceeding 75% in both CpG islands. This showed a correlation between the absence of high expression and methylation of the CpG island not only of the promoter region but also of the first intron. These results also allowed the identification of different methylated regions in breast cancer cell lines for the standardization of MSP-PCR. The MCF7 line, when subjected to treatment with the demethylating compound (DAC) and the inhbitors of histone deacethylating compund (TSA), expressed MMP14 and reduced its rates of global methylation, indicating a close relationship between epigenetics and regulation of this gene including the intronic region. In regions demethylated by the treatment it was possible to identify a binding site of the transcription factor GLI3, which may be promoting the expression of MMP14. We conclude that methylation of the CpG island located in the intron of the MMP14 gene seems to be working cooperatively with the promoter region to permit or silence the transcription of the gene. Studies of methylation in the body of the gene are new, and, therefore, new data can contribute to understand the importance of DNA methylation of these regions in the mechanisms of tumorigenesis. Keywords: Breast cancer. MMP-14. Intronic CpG island. Methylation.

Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Coorientadora : Profª Drª Edneia A. S. R. Cavalieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa: Curitiba, 29/03/2017 / Inclui referências : f. 52-58 / Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais incidente em cadelas não castradas e dentre os fatores envolvidos em sua patogênese está a exposição ao estrógeno e a ação de seu receptor. O receptor de estrógeno-? (RE?) é uma proteína, codificada pelo gene ESR1, amplamente utilizada como marcador molecular de prognóstico para o câncer de mama em mulher, porém na cadela ainda é pouco utilizado. Um dos mecanismos envolvidos na regulação do gene ESR1 em neoplasias mamárias em mulheres é a metilação do DNA, um evento epigenético onde há a adição de um grupamento metil em citosinas ao lado de guaninas. Nos últimos anos vem aumentando o número de trabalhos investigando a expressão da proteína RE? em cadelas, entretanto, ainda são poucos os estudos buscando entender os mecanismos moleculares de regulação do gene ESR1 nestes animais. Neste trabalho, foi avaliada a expressão do gene ESR1 e da proteína em amostras de mama normal, tumores mamários benignos e malignos, bem como verificada a influência da metilação na regulação da expressão deste gene. Neste estudo foram utilizadas quatro amostras de mama normal, oito tumores benignos e nove malignos. Observou-se uma menor expressão do gene ESR1 (p < 0,05) e da proteína RE? (p=0,0037) nos tumores malignos em relação às mamas normais e aos tumores benignos. Embora a correlação encontrada entre mRNA e proteína seja forte e positiva (rho=0,72 e p < 0,05), três das seis amostras RE? negativas (escore zero) apresentaram níveis de mRNA semelhantes aos das amostras RE? positivas classificadas como escore 2 na imuno-histoquímica. Os resultados do sequenciamento evidenciaram um baixo percentual de metilação, sendo observados 2,5% no grupo de mamas normais, 1,9% no grupo receptor de estrógeno positivo e 2,6% no grupo receptor de estrógeno negativo, não havendo diferença estatística entre os grupos (p>0,05). Como não foi evidenciada diferença significativa na metilação entre os três grupos é possível inferir que no câncer de mama canino o gene ESR1 provavelmente não é silenciado por metilação, entretanto estudos com maior número amostral são necessários. Palavras chave: câncer de mama canino, receptor de estrógeno ?, ESR1, metilação do DNA, epigenética / Abstract: The mammary cancer is the most prevalent cancer type in no spayed bitches. Exposure to estrogen and its receptor action is a factor involved in mammary carcinogenesis. The estrogen receptor-? (ER?) is a protein encoded by the gene ESR1 widely used as prognostic biomarker in women breast cancer but poorly used in canine mammary tumor. The DNA methylation is a regulatory mechanism of the gene ESR1 in women breast cancer. It is an epigenetic event where the methyl group is added to a cytosine next to a guanine. In the past few years it has been increasing the number of studies about the ER? expression in bitches, however it still few researches investigating the molecular mechanisms of the ESR1 gene regulation in these animals. The goal of this study was to evaluate the protein and mRNA expression of the ESR1 gene in samples of normal mammary gland, benign and malignant tumors and identify the role of DNA methylation in this gene regulation. It was used samples of four normal mammary gland, eight benign tumors and nine malignant tumors. It was observed a significant lower expression of ER? mRNA (p<0.05) and protein (p=0,0037) in malignant tumors when compared to normal mammary glands and to benign tumors. Although the correlation between mRNA and protein levels was strong and positive (rho=0,72 e p<0,05), three of the six ER? negative samples (score zero) presented mRNA levels similar to ER? positive samples classified as score 2 by immunohistochemistry. The sequencing results showed a low methylation percentage in all samples: 2,5% in normal mammary gland group, 1,9% in positive estrogen receptor group and 2,6% in negative estrogen receptor group. It was not observed significant difference of methylation among the groups (p>0,05). We can infer that in canine mammary tumors the gene ESR1 probably is not silenced by DNA methylation. Further studies with higher number of samples are needed. Key words: canine mammary cancer, estrogen receptor ?, ESR1, DNA methylation, epigenetic

Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Co-orientadora : Profª Drª Edneia A. S. R. Cavalieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa: Curitiba, 02/12/2014 / Inclui referências / Área de concentração / Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais frequente entre as mulheres em todo o mundo. A enzima MMP-2 é uma metaloprotease capaz de degradar o colágeno tipo IV, um dos principais constituintes da matriz extracelular (MEC). Sua função é amplamente descrita por atuar no mecanismo de metástases em diversos tipos de câncer. Estudos recentes demonstraram que a linhagem tumoral de mama MCF7 possui o gene MMP2 regulado por metilação do DNA. Além disso, alguns estudos têm demonstrado que a fibronectina, uma importante proteína constituinte da MEC, é capaz de promover a expressão de MMP-2 em linhagens tumorais de mama. Resultados recentes do nosso grupo mostraram que a linhagem tumoral MCF7 quando tratada com fibronectina por 5 horas sofre 30% de desmetilação da região promotora do gene MMP2. Entretanto, observou-se também que tal processo foi transitório, porque houve a remetilação parcial do promotor quando o estímulo foi retirado. Ainda, a fibronectina induziu o aumento de uma marca de histona no promotor de MMP2 que sinaliza para a ativação da transcrição gênica. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi dar continuidade a esse estudo, avaliando a regulação epigenética do gene MMP2 em linhagens tumorais de mama após o cultivo com fibronectina em diferentes tempos. Para isso, células da linhagem MCF7 submetidas ao tratamento com fibronectina por 8, 12 e 24 horas, e da linhagem MDA-MB-436 por 24 horas, tiveram seus níveis de expressão de MMP2, metilação do DNA e modificações de histonas do promotor do gene avaliados. Na linhagem MCF7, o tratamento por 8, 12 e 24 horas foi capaz de promover o aumento da expressão de MMP2 em 7, 25 e 9 vezes, respectivamente, comparado com o controle, assim como a redução da metilação do promotor de 90% (controle) para 70%, 40% e 52%, respectivamente. O tratamento por 24h também promoveu o aumento da marca de ativação gênica H3K4me3. Ainda, após 12h de cultivo com fibronectina, a linhagem MCF7 aumentou sua capacidade migratória. A fim de verificar se o efeito observado não era exclusivo da linhagem MCF7, foi incluída no estudo a linhagem MDA-MB-436 que foi submetida ao tratamento por 24h, e apresentou aumento na expressão gênica de MMP2 (4 vezes) e redução da metilação do promotor (de 90% para 22%). Por fim, as células tratadas foram mantidas em cultivo sem a fibronectina para avaliar a estabilidade das modificações. Essas células, chamadas de recultivo, apresentaram uma redução na expressão gênica e aumento na metilação do promotor quando comparadas com as células logo após os tratamentos, confirmando o efeito transitório da fibronectina nos eventos epigenéticos, que já tinha sido observado após 5 horas de tratamento. Esses dados corroboram e complementam os mecanismos observados pelo nosso grupo de pesquisa e contribuem para a compreensão dos mecanismos epigenéticos que regulam a expressão de um importante gene associado às metástases tumorais. Palavras-chave: Câncer de mama, MMP-2, epigenética, metilação do DNA. / Abstract: Breast cancer is the most common cancer worldwide among women. The MMP- 2 enzyme is a metalloprotease capable of degrading type IV collagen, a major constituent of the extracellular matrix (ECM). Its function is widely described by acting in the mechanism of metastasis in various cancers. Recent data has shown that the MCF7 breast tumor cell line has the MMP2 gene regulated by DNA methylation. In addition, some studies have shown that fibronectin, an important constituent of the extracellular matrix, is capable of promoting MMP-2 expression in breast tumor cell lines. Recent results from our group showed that fibronectin was able to induce MMP2 expression by a 30% decrease in its promoter methylation in MCF7 tumor cell line. However, it was also noted that this process was transient, because a partial promoter remethylation was observed when the stimulus was removed. Moreover, a histone marker for an open chromatin conformation was significantly increased. Therefore, the aim of this work was to continue evaluating the epigenetic regulation of the MMP2 gene after cultivation of breast tumor cell lines with fibronectin at different times. To this reason, MCF7 cells subjected to treatment with fibronectin for 8, 12 and 24 hours and MDA-MB-436 cells subjected to treatment for 24 hours, were evaluated by the levels of MMP2 expression, gene promoter DNA methylation and histone modifications. In the MCF7 cell line, treatments for 8, 12 and 24 hours were able to promote 7, 9 and 25-fold increase in MMP2 expression, respectively, compared with the mock. In addition, promoter methylation was reduced from 90% (control) to 70%, 40% and 52%, respectively. Treatment for 24h also promoted an increase of the histone open chromatin conformation marker H3K4me3. Moreover, the migratory capacity of MCF7 cells treated for 12h was increased. In order to confirm the fibronectin effect, the MDA-MB-436 cell line was subjected to 24h fibronectin treatment, which showed an increase in MMP2 gene expression (4-fold) and a reduction of promoter methylation (from 90% to 22%). Finally, the treated cells were kept in culture without fibronectin to evaluate the modifications stability. These cells (recultivation) showed a gene expression reduction and promoter methylation increased when compared to the cells after treatments, confirming the fibronectin transient effect observed after the 5h treatment. These data support and complement the mechanisms observed by our research group and contribute to understand the epigenetic mechanisms that regulate the expression of an important gene associated with tumor metastasis. Keywords: Breast cancer, MMP-2, epigenetics, DNA methylation.

Submitted by Israel Vieira Neto (israel.vieiraneto@ufpe.br) on 2015-03-05T18:13:15Z No. of bitstreams: 2 Eduardo Ramalho.pdf: 538304 bytes, checksum: e4a30cf566174291fcd76bbfacaf4eff (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T18:13:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Eduardo Ramalho.pdf: 538304 bytes, checksum: e4a30cf566174291fcd76bbfacaf4eff (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES / Sabe-se que os genes p53, BRCA1 e BRCA2 apresentam a característica em comum de serem considerados supressores tumorais. Eventos genéticos e epigenéticos são frequentes ao longo de todo o genoma humano. Mutações somáticas são passíveis de ocorrer nas regiões codificantes de genes específicos, alterando sua sequência e gerando proteínas mutantes, as quais resultam numa alteração de sua capacidade funcional ou até mesmo a perda dela. Este trabalho objetivou avaliar alterações epigenéticas nas regiões promotoras dos genes BRCA1 e BRCA2 através da técnica de PCR para Metilação Específica (MSP) e correlacionar mutações pontuais nos exons 4 e 7 do gene p53 como fator de risco para o carcinoma ductal invasivo (CDI) de mama na população feminina do Recife atendida no Hospital das Clínicas (HCUFPE). Cinquenta biópsias de mama diagnosticadas com CDI fixadas em formalina e embebidas em parafina foram obtidas do Setor de Anatomia Patológica do HC-PE e cinco amostras de tecido mamário de mulheres submetidas à mastectomia estética foram usadas como controle normal. O DNA das amostras foram extraídos e, então, amplificados por MSP. Para avaliação do perfil mutacional utilizou-se a técnica de PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) com as enzimas BstUI e HaeIII para verificação dos polimorfismos nos exons 4 e 7, respectivamente. A frequência no padrão de metilação para o gene BRCA2 foi de 46,9% enquanto a frequência de mutações pontuais nos códons 72 (exon 4) e 249 (exon 7) do gene p53 foram de 91,8% e 8,1%, respectivamente. Para o BRCA1 os resultados obtidos foram inconsistentes quanto ao seu padrão de metilação. Os resultados mostraram que o polimorfismo do códon 72 apresentou-se estatisticamente significante para metástase podendo ser utilizado como um potencial biomarcador auxiliar no diagnóstico de carcinoma ductal invasivo de mama humana.

A Doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais comum na atualidade. Cerca de 10% dos casos da doença estão relacionados com fatores genéticos e os outros 90% são devido a fatores ambientais e epigenéticos. Evidências indicam alterações na metilação de genes relacionados ao desenvolvimento da doença de Parkinson. No entanto, não se sabe o efeito de inibidores da metilação de DNA sobre a neurotoxicidade induzida por MPP+, uma neurotoxina que mimetiza processos neurodegenerativos associados ao Parkinson in vitro. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos inibidores da metilação de DNA (RG108, n-ftaloil-l-triptofano e 5azadC, 5-aza-2´-deoxycytidina) e do doador universal de grupamentos metil (SAM, S-adenosilmetionina) sobre neurotoxicidade induzida por MPP+ em cultura de células imortalizadas (PC12), por meio da análise da viabilidade celular avaliada no teste do MTT (3 - [4,5 dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólio); e da análise de neuritogênese, na presença e na ausência de MPP+. Os resultados demonstraram que: 1. o tratamento com DNMTi (inibidor da DNA metiltransferase) ou com SAM induziram efeito per se sobre a viabilidade celular, apenas quando incubados em altas concentrações e em perídos prolongados (24h); 2. não modificaram a morte celular induzida pelo MPP+, em baixas concentrações, mas agravaram a neurotoxicidade quando incubados em altas concentrações ou por períodos prolongados (24h); 3. essas drogas induziram neuritogênese per se e potencializaram a neuritogênese induzida pelo NGF (fator de crescimento neural); 4. protegeram parcialmente contra a diminuição da neuritogênse induzida pelo MPP+. O conjunto de dados sugere que tanto os DNMTi quanto o SAM podem ser citotóxicos, dependen de suas concentrações e do tempo de exposição à droga. No entanto, essas drogas são capazes de aumentar a neuritogênese (diferenciação celular) e proteger contra a neurotoxicidade celular induzida pelo NGF, em células diferenciadas. / Parkinson\'s disease is the second most common neurodegenerative disease nowadays. About 10% of the disease cases are related to genetic factors and the other 90% are due to environmental and epigenetic factors. Evidence indicates changes in DNA methylation in genes related to the development of Parkinson\'s disease. However, the effect of DNA methylation inhibitors on MPP+-induced neurotoxicity, a drug that mimics neurodegenerative processes associated with Parkinson\'s in vitro, is not known. The aim of this study was to evaluate the effect of DNA methylation inhibitors (RG108, N-phthalyl-L-tryptophan and 5azadC, 5-aza-2?-deoxycytidine) and of the universal donor of methyl group (SAM, S-adenosyl methionine) on: 1. MPP+ -induced neurotoxicity in culture of immortalized cells (PC12), by analysis of cell viability in the MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium) test; 2. neuritogenesis, in the presence and absence of MPP +. Results indicated that: 1. treatment with DNMTi or SAM induced effects per se on cell viability only at higher concentrations and after prolonged periods of incubation (24h); 2. DNMTi (DNA methyltransferase inhibitors) and SAM increased cell differentiation and neuritogenesis per se, especially when incubated for 30 minutes, as well as they potentiated NGF-induced neurogenesis; 3. the drugs attenuated MPP+-induced effects on neuritogenesis. Altogether, these data suggests short treatment with both DNMTi and SAM do not cause cellular cytotoxicity (cell death), but are able to increase neuritogenesis (cell differentiation) and protect against MPP+-induced neurotoxicity in differentiated cells.