A hipermatilação aberrante de regiões gênicas promotoras foi recentemente sugerida como meio de detecção do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. Neste estudo nós avaliamos o status de metilação de um painel de 7 genes já relatados na literatura e sua correlação com lesões orais malignas e cancerizáveis de boca. Inicialmente, nós utilizamos amostras de enxágues salivares de pacientes com lesões benignas, displásicas e malignas para determinar a hipermetilação em regiões gênicas promotoras em pacientes de alto risco. Uma avaliação clínica de risco foi realizada e correlacionada com o diagnóstico histológico e status dos biomarcadores. A partir dos resultados analisados nas lesões intraorais, o gene DCC, que obteve a melhor performance entre os 7 genes, foi testado em lesões de queilite actínica e carcinoma epidermoide de lábio. Foram realizadas reações de PCR específica para metilação, quantitativa (Q-MSP) para os 7 genes (CCNA1, MGMT, MINT31, TIMP3, P16, DAPK, DCC) em enxágues salivares de 191 pacientes com lesões intraorais, e do gene DCC em 39 lesões de lábio. Análises de regressão logística e curva ROC foram utilizadas para avaliar a associação do status de metilação com o diagnóstico histológico e para estimar a acurácia da classificação respectivamente, nas amostras de enxágue salivar. Na análise multivariada, o diagnóstico displasia/ câncer foi associado com a idade (OR=1.3, 95% CI= (1.01-1.6, p=0.014) e a metilação do painel de 7 genes (OR=2.2, 95% CI=(1.34.0), p=0.006); a metilação do DCC também foi fortemente associada (OR=3.3, 95% CI=(1.7-6.6), p=0.004). Na análise multivariada, o diagnóstico histológico foi independentemente associado com a metilação do painel de 7 genes (OR=2.0, 95% CI=(1.1-3.6), p=0.027) ou do DCC (OR=2.8, 95% CI=(1.4-5.7), p=0.004). Uma nova análise, excluindo pacientes com diagnóstico prévio de câncer (n=30), e levando em conta uma classificação clínica de risco, foi realizada. Na análise univariada, DCC (OR=2.6, 95% CI=(1.1-6.1), p=0.026) e a classificação clínica de risco (OR=2.5, 95% CI=(1.3-5.1), p=0.008) foram associados com o diagnóstico de displasia/ câncer, e permaneceram significante na análise multivariada (DCC: OR=2.5, 95% CI= (1.1- 6.0), p=0.037, classificação de risco: OR=2.5, 95% CI=(1.2-5.0), p=0.012). A classificação clínica de risco identificou displasia/ câncer com a sensibilidade de (95% CI=4171%) e especificidade de 66% (95% CI= 5775%). A sensibilidade da classificação clínica de risco combinada com a metilação do painel de 7 genes melhorou, chegando a 71% (95% CI=5683%) e com a metilação do DCC chegou a 69% (95% CI=5481%). O status de metilação do painel de 7 genes, como também o DCC como um marcador individual, foi independentemente associado com o diagnóstico histológico em enxágues salivares. Nas lesões labiais não foi possível observar a mesma correlação entre o status de metilação do gene DCC e o diagnóstico histológico, provavelmente, devido a diferente etiologia das lesões intraorais e labiais. Os resultados mostram a potencial habilidade destes biomarcadores em prever o risco de presença de lesões intraorais cancerizáveis, usando uma abordagem não invasiva, além do potencial de melhorar a eficiência da classificação clínica de risco. Mas reforça a diferente etiologia das lesões intraorais e labiais e a necessidade de diferentes marcadores para essas lesões. / Aberrant promoter hypermethylation has been recently proposed as a means for detection of HNSCC in salivary rinses. Here we evaluate the ability of a previously reported 7-gene methylation panel status to correlate with premalignant and malignant oral lesions. We used a large prospective cohort of salivary rinses obtained from patients with benign, dysplastic, and cancer diagnoses to determine promoter hypermethylation in high-risk patients. Clinical risk assessment was performed and correlated with histological diagnosis and biomarker status. Also, a cohort of lip lesions was selected and methylation status of DCC gene was correlated with histology. Quantitative methylation-specific PCR (Q-MSP) was performed analyzing methylation status of 7 genes (CCNA1, MGMT, MINT31, TIMP3, P16, DAPK, DCC) in salivary rinses of 191 patients with oral lesion and 39 lip lesions. Logistic regression and receiver operating characteristic (ROC) analyses were used to examine the association of methylation status with histologic diagnosis and to estimate classification accuracy, respectively. On univariate analysis, diagnosis of dysplasia/cancer was associated with age (OR=1.3, 95% CI= (1.01-1.6, p=0.014) and 7-gene panel methylation (OR=2.2, 95% CI=(1.34.0), p=0.006); DCC methylation was also strongly associated (OR=3.3, 95% CI=(1.7-6.6), p=0.004). On multivariable modeling, histologic diagnosis was independently associated with 7 gene panel (OR=2.0, 95% CI=(1.1-3.6), p=0.027) or DCC (OR=2.8, 95% CI=(1.4- 5.7), p=0.004) methylation. A subset analyzed (n=161) without prior biopsy proven malignancy received clinical risk classification based on lesion examination. On univariate analysis, DCC (OR=2.6, 95% CI=(1.1-6.1), p=0.026) and clinical risk classification (OR=2.5, 95% CI=(1.3-5.1), p=0.008) were associated with diagnosis of dysplasia/cancer, and remained significant on multivariate analysis (DCC: OR=2.5, 95% CI= (1.1-6.0), p=0.037, risk classification: OR=2.5, 95% CI=(1.2-5.0), p=0.012). Clinical risk classification identified dysplasia/cancer with a sensitivity of 56% (95% CI=4171%) and specificity of 66% (95% CI= 5775%). The sensitivity of clinical risk classification combined with 7-gene panel methylation improved to 71% (95% CI=56 83%) and with DCC methylation improved to 69% (95% CI=5481%). The 7-gene panel methylation, as well DCC as a single marker, was independently associated with histologic diagnosis in salivary rinses. No correlation was found between DCC methylation status and histologic diagnosis of lip lesions, probably due different etiology of oral and lip lesions. The results show the potential ability of these biomarkers to predict risk for presence of oral premalignancy and malignancy using a non-invasive approach using salivary rinse and can improve the efficiency of clinical risk classification. Also, reinforces the different etiologic origins of intraoral and lip lesions and the need of different markers for these lesions.

A epigenética é uma subárea da Genética, na qual são estudados mecanismos que são essenciais para o adequado desenvolvimento dos mamíferos, sendo que, alterações neste estágio podem levar a vários distúrbios metabólicos, como a obesidade. Atualmente a obesidade é um grave problema de saúde pública mundial, tem origem multifatorial envolvendo tanto fatores ambientais quanto genéticos. Existem alguns genes que estão envolvidos com a obesidade, como por exemplo, o gene da pró-opiomelanocortina (POMC). O objetivo do presente projeto de pesquisa é investigar os padrões de expressão e metilação do gene Pomc na prole de ratas submetidas às dietas deficiente e suplementada com ácido fólico. Os animais utilizados foram ratos Wistar. O estudo envolveu filhotes (n=24) machos e fêmeas que foram desmamados com a mesma dieta de suas respectivas mães, sendo três grupos de tratamento, o grupo controle (2,0 mg de ácido fólico/kg de ração), o grupo deficiente (0,5 mg de ácido fólico/kg de ração) e o grupo suplementado (8 mg de ácido fólico/kg de ração). Foram coletadas amostras do núcleo arqueado do hipotálamo, a partir das quais foram extraídos DNA, RNA e proteínas utilizando kits comerciais seguindo o protocolo do fabricante. Com o DNA foi realizada a análise do padrão de metilação. O mRNA foi utilizado para a análise da expressão gênica, por PCR em tempo real, pelo sistema TaqMan® (Life Technologies(TM)). O estudo de proteômica foi realizado por Western blotting. De modo geral, observou-se que o peso corpóreo dos filhotes machos não apresentou diferença estatística entre os grupos. O consumo de ração do grupo deficiente em ácido fólico foi estatisticamente (p = 0,03) maior do que o grupo controle. Em relação aos filhotes fêmeas observou-se que o peso corpóreo do grupo suplementado foi estatisticamente (p = 0,01) maior do que o grupo controle, e referente ao consumo de ração, não houve diferença estatística significativa entre os grupos de tratamento. As análises de peso cerebral, expressão gênica, metilação e expressão proteica de Pomc não apresentaram diferenças estatísticas significativas entre os grupos de tratamento de ambos os sexos. Conclui-se que a intervenção com dietas com diferentes concentrações de ácido fólico não ocasionou alterações significativas na prole, em relação ao estudo de proteômica e aos padrões de metilação e expressão do gene Pomc. Quanto ao peso corpóreo e consumo de ração dos animais mostrou-se que a suplementação com ácido fólico durante a gestação e no pós desmame foi capaz de alterar estes dois parâmetros, com resposta divergente entre os machos e fêmeas na prole adulta. / Epigenetic mechanisms are essential for proper development in mammals, and that changes at this stage may lead to various metabolic disorders such as obesity. Currently obesity is a serious problem of public health worldwide, has a multifactorial origin involving both environmental and genetic factors. There are some genes that are involved with obesity, such as the proopiomelanocortin gene (POMC). The aim of this research project is to investigate the expression and methylation patterns of the Pomc gene in the offspring of rats subjected to deficient and supplemented diets with folic acid. Animals used were Wistar rats. The study involved males and females pups (n = 24) that were weaned at the same diet their mothers, three treatment groups, control group (2,0 mg/kg of folic acid), deficient group (0,5 mg/kg of folic acid) and the supplemented group (8,0 mg/kg of folic acid). The arcuate nucleus of the hypothalamus tissue were collected, from which was extracted DNA, RNA and proteins using commercially available kits following the manufacturer\'s protocol. The DNA methylation pattern analysis was performed. The mRNA was used for the analysis of gene expression by real time PCR, the TaqMan (Life Technologies (TM)) system. The proteomic study was carried out by Western blotting. In general, we found that the body weight of the male offspring showed no statistical difference between the groups. The feed intake of folic acid deficient group was statistically (p = 0.03) higher than the control group. In relation to female offspring was observed that the body weight of the supplemented group was statistically (p = 0.01) higher than the control group, and related to feed intake, there was no statistically significant difference between the treatment groups. The analysis of brain weight, gene expression, methylation and protein expression of Pomc no significant statistical differences among treatment groups of both sexes. Concluded that the intervention diets with different folic acid concentrations did not cause significant changes in the offspring compared to the study of proteomics and methylation and expression patterns of the Pomc gene. As for the body weight and feed consumption of animals it showed that supplementation with folic acid during pregnancy and post weaning was able to alter these two parameters with differing response between males and females in the adult offspring.

ALVES, Markênia Kélia Santos. Identificação de alterações moleculares associadas à expressão de CD133, CXCR4, CD44 E OLIG2 e metilação em promotor de CDKN2A em tumores astrocíticos. 2014. 89 f. Tese (Doutorado em biotecnologia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-09T12:10:33Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_mksalves.pdf: 2238362 bytes, checksum: f1bbe27ba89548ddbbd8b206939190d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-27T17:42:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_mksalves.pdf: 2238362 bytes, checksum: f1bbe27ba89548ddbbd8b206939190d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T17:42:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_mksalves.pdf: 2238362 bytes, checksum: f1bbe27ba89548ddbbd8b206939190d7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Currently, the concept that tumors are cell populations organized in a hierarchically heterogenous way in which stem-cells are relevantly important as these cells have the capacity of self-renew and of generating cell lineages in different phases of differentiation. So that, the identification of stem-cell components is essential to tumorigenesis understanding. Althought neural cell lineage markers have been identified, the association among these markers and neurological tumors is still scarce, and taking in consideration the astrocytomas, the association assessements are verified mainly regarding the glioblastomas. Among these stem cell markers, CD133, CXCR4 and CD44 are related to the glioma formation, migration and growth; on the other hand, OLIG2 is involved in cell destination. So far there are no studies evaluating all these markers together and their relationship to tumor grades. Additionally, specific epigenetic alterations, specially promoter methylation, have been widelly identified in these tumors, leading to gene inativation, mostly involving CDKN2A (p16INK4A protein), a tumor suppressor. Althought this mechanism is pointed as this gene main inactivator, there are still controvertial questions regarding the astrocytomas. In order to evaluate these questions, the present study aimed to determine CDKN2A pattern of methylation and expression and their association to clinicalpathological parameters, and if the presence of progenitor/stem-cells, taking CD133, CXCR4, CD44 and OLIG2 expression in consideration, could define subpopulations of cells which might be used as prognostic markers. So, in a series of 93 astrocytomas of different malignity grades, the expression of CD133, CXCR4, CD44, OLIG2 and p16INK4A was analysed by the imunohistochemistry technique, and the CDKN2A methylation status was assessed by methylation specific PCR (MS-PCR). The data was then associated to tumor grades, localization and other clinicalpathological parameters. The statistic analyses were made using X 2 test, Fisher's exact test, Spearman's correlation, kmeans groupment and principal component analyses, using p<0.05 as statistically significance. The imunopositivity of OLIG2 was predominant (73.1%), followed by CXCR4 (60.2%), CD44 (55.9%) and CD133 (45.2%). The correlation and groupment analyses defined two different population subtypes, a CXCR4(+)CD133(+)CD44(+) subtype and a OLIG2(+) subtype. CXCR4(+)CD133(+)CD44(+) tumors became more frequent as malignity grew. In grade IV, this subtype was significantly more frequent (p=0.008), being also in diffuse tumors. Additionally, CXCR4(+) and CD133(+) tumors were preferentially located in brain hemisferes and in the ventricles, and mostly in aged >30 patients. On the other side, OLIG2(+) tumors were associated to the cerebellum, which is the pylocitic tumor preferential localization. A strong negative correlation between nuclear and cytoplasmatic imunopositivity and promoter methylation in CDKN2A was observed. Also, a negative significant correlation between methylated CDKN2A and patient's age was found; moreover, feminine patients presented a higher frequency of methylated CDKN2A. In conclusion, the presence of stemcell subpopulations in astrocytomas indicates tumoral progression, in which CXCR4, CD133 and CD44 may be potentially used together as prognostic markers. The association between tumor localization and patient's age also corroborates these findings. Additionally, the CDKN2A inactivation by promoter methylation is a frequent event in astrocytomas and it is associated to patient's age and gender. / Tumores são populações celulares heterogêneas hierarquicamente organizadas, cujas células-tronco possuem importância relevante desde que são células com a capacidade de se renovarem e de gerarem linhagens em fases diferentes. Dada a sua importância, a identificação de componentes de células-tronco é essencial para o entendimento da tumorigênese. Apesar de marcadores de linhagem neural terem sido identificados, a associação destes marcadores com os tumores cerebrais ainda é escassa e nos astrocitomas são relacionados principalmente aos glioblastomas. Entre esses marcadores de células-tronco,CD133, CXCR4 e CD44 são relacionados à formação do glioma, migração e crescimento; por outro lado, OLIG2 é envolvido no destino celular. Não existem estudos, até essa data, que avaliam todos esses marcadores juntos e sua relação com grau tumoral. Adicionalmente, alterações epigenéticas específicas, especialmente a metilação em promotor, tem sido identificadas nestes tumores, levando a inativação de genes, com destaque o CDKN2A (proteína p16INK4A), um supressor tumoral. Apesar de esse mecanismo ser apontado como o principal inativador desse gene, em astrocitomas ainda existem questões controversas. Para avaliar essas questões, este estudo objetivou determinar a expressão e padrão de metilação em promotor de CDKN2A e sua associação com parâmetros clinico-patológicos e se a presença de células-tronco/progenitoras, considerando a expressão de CD133, CXCR4, CD44 e OLIG2 poderia definir subpopulações de células que podem ser usadas como marcadores prognósticos. Para isso, em uma série de 93 astrocitomas de diferentes graus de malignidade, foram estudadas a expressão dos marcadores CD133, CXCR4, CD44, OLIG2 e p16INK4A, detectada pela técnica de imunohistoquímica, e o padrão de metilação em promotor de CDKN2A, por PCR específico para metilação (PCR-MS). Os dados foram então associados com grau tumoral, localização e outros parâmetros clinico-patológicos. As análises estatísticas foram realizadas usando o teste do X2, teste exato de Fisher, correlação de Spearman, agrupamento de k-means e análise de componentes principais, com diferenças consideradas significantes com p<0.05. A imunomarcação de OLIG2 mostrou a frequência maior de positividade (73,1%), seguido por CXCR4 (60,2%), CD44 (55,9%) e CD133 (45,2%). Análises de correlação e agrupamento definiram dois subtipos de população de acordo com os marcadores estudados, um subtipo CXCR4(+)CD133(+)CD44(+) e outro OLIG2(+). Tumores CD133, CXCR4 e CD44 positivos aumentaram de acordo com malignidade. No grau IV, este subtipo de tumores [CD133(+)CXCR4(+)CD44(+)] foi significantemente mais frequente (p=0,008) e também nos tumores difusos. Adicionalmente, tumores com CXCR4(+) e CD133(+) foram preferencialmente localizados nos hemisférios cerebrais e nos ventrículos, e a maioria nos pacientes com idade ≥ 30 anos. Por outro lado, tumores OLIG2(+) foram associados com o cerebelo, que é a localização preferencial do astrocitoma pilocítico. Uma forte correlação negativa entre imunomarcação nuclear e citoplasmática e metilação em promotor de CDKN2A foi encontrada. Além do mais, uma correlação negativa significante entre metilação em promotor de CDKN2A e idade foi observada e pacientes do sexo feminino tiveram uma maior frequência significante de CDKN2A metilado em promotor que o sexo masculino. Em conclusão, a presença de subpopulações de células-tronco em astrocitomas é indicativa de progressão tumoral, cujos marcadores CXCR4, CD133 e CD44 podem ser potencialmente usados em conjunto como marcadores prognósticos. A associação com localização do tumor e idade também corroboram esses achados. Adicionalmente, a inativação de CDKN2A por metilação em promotor é um evento frequente em astrocitomas e é relacionada à idade e sexo dos pacientes.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora a resistência ao anoikis seja considerada um importante processo envolvido no fenótipo maligno, a relação causal entre transformação neoplásica e crescimento independente de ancoragem continua indefinida. Para estudar essa correlação, foi desenvolvido em nosso laboratório um modelo experimental de transformação maligna de melanócitos murinos, em que melanócitos melan-a foram submetidos a ciclos seqüenciais de bloqueio de ancoragem. Ao longo deste processo, foram estabelecidas tanto linhagens celulares correspondendo a fases intermediárias da progressão tumoral como linhagens de melanoma, as quais são progressivamente resistentes ao anoikis e representam fases distintas da progressão tumoral. Análises de expressão gênica mostraram aumento da expressão de Timp1 nas linhagens de melanoma quando comparadas à linhagem parental de melanócitos. Ainda que descrita como inibidora de MMPs, essa proteína foi recentemente associada à resistência ao anoikis em células epiteliais de mama humana. Deste modo foram analisadas neste trabalho: 1) a relação entre expressão de Timp1 e aquisição do fenótipo resistente ao anoikis e 2) a possível regulação epigenética da expressão de Timp1 por metilação de DNA neste modelo. Enquanto células melan-a expressam baixos níveis de Timp1, todas as linhagens derivadas desta expressam níveis elevados desta proteína. O tratamento dos melanócitos melan-a com o agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina resultou em aumento significativo da expressão de Timp1. De fato, a análise pelo ensaio Methylation sensitive-Single Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE) mostrou aumento progressivo na desmetilação do gene Timp1 em paralelo a sua crescente expressão ao longo da transformação maligna. A superexpressão de Timp1 em células melan-a resultou no aumento da sobrevivência das mesmas em condições independentes de ancoragem, mas foi incapaz de transformá-las. Além disso, o tempo de latência para o aparecimento de tumores foi menor para células de melanoma transfectadas com Timp1, indicando que esta molécula pode estar associada com a agressividade do tumor. Esses resultados mostram aumento da expressão de Timp1 durante a transformação maligna, em decorrência da desmetilação gênica progressiva, associado ao aumento da resistência ao anoikis, mas não à aquisição de um fenótipo maligno transformado. / Although anoikis resistance has been considered a hallmark of malignant phenotype, the causal relation between neoplastic transformation and anchorageindependent growth remains undefined. We developed an experimental model of murine melanocyte malignant transformation, where a murine melanocyte lineage (melan-a) was submitted to sequential cycles of substrate adhesion blockade. Cells corresponding to intermediate phases of tumor progression and melanoma cell lines were established and show progressive anoikis-resistance. Gene expression analysis showed up-regulation of Timp1 in all melan-a-derived lineages. Treatment with a demethylating agent resulted in marked expression of Timp1 in melan-a melanocytes. In fact, Ms-SNuPE analysis showed increased demethylation in Timp1 gene in parallel with its expression along malignant transformation. Although described as a MMP inhibitor, this protein has been recently associated with apoptosis resistance in human breast epithelial cells. Melan-a cells overexpressing the Timp1 gene showed increased survival in anchorage-independent conditions, but were unable to form tumors in vivo, whereas Timp1-overexpressing melanoma cells showed reduced latency time for tumor appearance. Our results show an increment in Timp1 expression along carcinogenesis, possibly associated to a progressive gene demethylation, which is causally related with an increase in anoikis-resistance but not with the acquisition, by itself, of a fully transformed malignant phenotype. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

COSTA, D. M. Relação entre helicobacter pylori, metilação gênica e polimorfismos genéticos do hospedeiro no câncer gástrico. 2016. 99 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-04-28T15:54:45Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_dmcosta.pdf: 2577776 bytes, checksum: d5e8be753e783e37ff1175316f97eac4 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-04-28T15:54:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_dmcosta.pdf: 2577776 bytes, checksum: d5e8be753e783e37ff1175316f97eac4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T15:54:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_dmcosta.pdf: 2577776 bytes, checksum: d5e8be753e783e37ff1175316f97eac4 (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Gastric cancer is a serious health problem. Several risk factors have been identified to contribute to its development, such as virulence genes of H. pylori, SNPs in host’s key genes and epigenetic events. The aim of this study was to investigate the relationship between genes methylation in gastric cancer, its association with H. pylori virulence genes, and verify the influence of CDH1 and MLH1 SNPs in the methylation status and correlate methylation of the promoter of miR-34b/c expression of MET protein in those cases. The promoter genes methylation was assessed by MS-PCR and HRM (for miR-34b/c) techniques. H.pylori genes were detected by PCR and SNPs, by PCR-RFLP. H.pylori genes were detected by PCR and SNPs, by PCR-RFLP. The genes of higher and lower methylation frequency were MSH2 and MLH1, respectively. Patients aged ≥ 50 had CDH1 more frequently methylated than those younger. The MLH1 gene was significantly less methylated in cardia tumors. As for the TNM, the CDH1-M gene was associated with advanced tumor extension, even when subdivided by subtype, since same association has been shown in tumors of intestinal subtype. Already the combination CDKN2A-M/MLH1-U was associated with absence of distant metastases. Taking into account the virulence genes of H. pylori, it was seen that patients infected vacAm1+ or cagG+ strains had a higher frequency of CDKN2A-U vacAs1 + was associated with COX-2-U and CDH1-U, while hopQII with MLH1-U. Patients infected with cagE+ and virB11+ strains had higher frequency of MSH2-M. It was also observed that less virulent strains tended to non-methylation for CDH1 and MLH1 genes. The classification trees made according to the histological subtype, showed that in tumors of diffuse subtype cagE+ and virB11 + strains (separately or together) were also attached to a methylator character of some of the analyzed genes. Already strains virB11+cagA+ did not lead to methylation in two genes. In intestinal subtype tumors was not observed a pattern having a variation in the combinations of H. pylori genes leading to the methylation. CDH1 SNPs presented no relation to the methylation of this gene, while the GA genotype of MLH1 SNP showed a tendency to not methylation of the gene. As regards the promoter methylation of miR-34b/c, the distribution percentage of the cases showed that the majority of cases presented methylation above 50%. The larger frequency among tumors of the intestinal subtype was in the methylation range of 50-75%, and to diffuse subtype from 75%. Already c-MET expression was positive in 86.36% of cases were not found differences among the different locations and subtypes. There was no correlation between the methylation percentage of miR-34b/c and c-MET expression. Observing each case, it was seen that in most cases whose c-MET expression was negative (H-score 0) had a high percentage of methylation of miR-34b/c. In conclusion, the methylation status of the studied genes appear to be dependent on the tumor location and is also related to the TNM staging and tumor subtype. In addition, more virulent H. pylori strains may be involved in this process by increasing inflammatory response leading to methylation of these genes. Already c-MET is overexpressed in cases of gastric cancer and the promoter region of miR-34b/c hipermethylated, indicating a possible involvement of these factors in carcinogenesis of the stomach, although it was not found a direct relationship between the two variables. / O câncer gástrico constitui um sério problema de saúde pública. Diversos fatores de risco parecem estar envolvidos na contribuição para o seu desenvolvimento, tais como: genes de virulência de H. pylori, SNPs em genes-chave no hospedeiro e eventos epigenéticos. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar a relação entre a metilação de genes em casos de câncer gástrico, sua associação com genes de virulência de H. pylori, verificar a influência dos SNPs de CDH1 e MLH1 em seu status de metilação, bem como correlacionar a metilação do promotor de miR-34b/c e a expressão da proteína MET nesses mesmos casos. A metilação dos genes foi obtida através da realização da técnica MS-PCR e HRM (para miR-34b/c). Os genes de H. pylori foram detectados por PCR e os SNPs, por PCR-RFLP. Os genes de maior e menor frequência de metilação foram MSH2 e MLH1, respectivamente. O corte de idade mostrou que pacientes com idade ≥ 50 anos tiveram CDH1 mais frequentemente metilado que aqueles mais jovens. O gene MLH1 foi significativamente menos metilado em tumores da cárdia. Quanto ao TNM, o gene CDH1-M foi associado à extensão tumoral avançada, inclusive quando subdividido por subtipo, já que mesma associação foi mostrada em tumores do subtipo intestinal. Já a combinação CDKN2A-M/MLH1-U foi associada à ausência de metástase à distância. Levando em consideração os genes de virulência de H. pylori, foi visto que pacientes infectados por cepas vacAm1+ ou cagG+ tiveram uma maior frequência de CDKN2A-U, vacAs1+ foi associado com COX-2-U e CDH1-U, enquanto hopQII, com MLH1-U. Pacientes infectados por cepas cagE+ e virB11+ tiveram maior frequência de MSH2-M. Foi observado também que cepas menos virulentas apresentaram uma tendência à não-metilação para os genes MLH1 e CDH1. As árvores de classificação, feitas de acordo com o subtipo histológico, mostraram que em tumores do subtipo difuso, cepas cagE+ e virB11+ (separados ou em concomitância) também estavam associadas a um caráter metilador em alguns dos genes analisados. Já cepas virB11+cagA+ não levavam à metilação em dois genes. Nos tumores do subtipo intestinal, não foi observado um padrão, havendo uma variação nas combinações dos genes de H. pylori que levavam à metilação. Os SNPs de CDH1 e não apresentaram relação com a metilação desses gene, enquanto o genótipo GA de MLH1 apresentou uma tendência à não metilação do gene. Quanto à metilação do promotor de miR-34b/c, a distribuição dos casos por percentual mostrou que a maioria dos casos apresentou metilação acima de 50%. A maior frequência de casos entre os tumores do subtipo intestinal estava na faixa de metilação de 50-75%, e para os do subtipo difuso, a partir de 75%. Já a expressão de c-MET foi positiva em 86,36% dos casos, não sendo encontradas diferenças entres as diferentes localizações e subtipos. Não foi encontrada uma correlação entre o percentual de metilação de miR-34b/c e a expressão da proteína c-MET. Observando caso a caso, foi visto que na maioria dos casos cuja expressão de c-MET era negativa (H-score 0) possuia um elevado percentual de metilação de miR-34b/c. Assim, pode-se concluir que os status de metilação dos genes estudados parecem ser dependentes da localização tumoral e está relacionado também ao estadiamento TNM e ao subtipo tumoral. Além disso, cepas de H. pylori mais virulentas podem estar envolvidas nesse processo, aumentando a resposta inflamatória e levando à metilação desses genes. Já a proteína c-MET está superexpressa em casos de câncer gástrico e a região promotora de miR-34b/c, hipermetilada, indicando um possível envolvimento desses fatores na carcinogênese do estômago, embora não tenha sido encontrada uma relação direta entre as duas variáveis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pos-Graduaçao em Bioquímica, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-06-26T01:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317199.pdf: 1995162 bytes, checksum: c5f2bf6816dc29a5ca478c754678dd4b (MD5) / O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome metabólica de etiologia múltipla caracterizada por hiperglicemia persistente, decorrente da falta de insulina e/ou da resistência dos tecidos a ação do hormônio. Estima-se que até o ano de 2030, cerca de 552 milhões de indivíduos no mundo estejam acometidos por esta doença. A alta morbidade e mortalidade característica desta condição estão fortemente associadas ao desenvolvimento de alterações patológicas na vasculatura. Estas alterações parecem estarem relacionadas com mudanças epigenéticas, que ocorrem nas fases iniciais do DM e favorecem a expressão patológica de determinados genes, provocando desta forma danos irreversíveis no organismo mesmo que a glicemia seja controlada posteriormente. Desta forma o objetivo deste trabalho foi melhor entender o efeito do estrito controle da glicemia, pela administração de insulina, em animais que desenvolveram hiperglicemia através da administração de estreptozotocina (STZ) sobre parâmetros metabólicos, alterações a nível de DNA, expressão gênica, sinalização celular de proteínas relacionadas à insulina, e conteúdo mitocondrial em sangue ou cérebro de ratos Wistar. Os resultados deste estudo mostraram que os animais que receberam STZ se tornaram hiperglicêmicos e hiperlipidêmicos por um marcado prejuízo na arquitetura das ilhotas de Langerhans, que como consequência provocou o comprometimento na síntese do hormônio insulina. Estas alterações metabólicas periféricas, que foram acompanhadas por uma marcada redução do peso corporal, desencadearam uma série de eventos no sistema nervoso central, principalmente evidenciados por i) redução na expressão genica hipocampal da insulina e da citocina anti-inflamatória interleucina-10 (IL-10); i) manutenção da fosforilação de proteínas alvos do receptor da insulina, como o substrato do receptor da insulina -1 (IRS-1) e Akt no córtex cerebral; iii) aumento no número de mitocôndrias no bulbo olfatório; e iv) hipermetilação do DNA em hipocampo. As alterações sobre a expressão de IL-10 e de hipermetilação no sistema nervoso central destes animais, foi prevenido/revertido com pela administração com insulina. A partir destes dados as seguintes conclusões podem ser formuladas: i) no cérebro existe um metabolismo de síntese, produção e sinalização de insulina independente do periférico e com objetivos diferentes; ii) o controle da glicemia mediante pela administração de insulina previne das alterações epigenéticas decorrentes da hipermetilação do DNA; iii) a melhor caracterização do modelo de hiperglicemia induzido por STZ aqui realizada permitirá a sua utilização em diferentes desafios metabólicos.<br> / Abstract : Diabetes mellitus (DM) is a metabolic syndrome of multiple etiologies characterized by persistent hyperglycemia resulting from lack of insulin and/or resistance of tissues to the hormone action. It is estimated that in 2030, nearly 552 million individuals in the world will be affected by this disease. The high morbidity and mortality characteristic of this entity are known to be strongly associated with the development of pathological changes in the vasculature. These changes seem to be related to epigenetic modulations, which occur in the initial stages of diabetes and promote the pathological expression of certain genes, thus resulting in irreversible damage in the organism, even when the blood glucose is subsequently controlled. In this scenario, the main objective of this project was to better understand the effect of the strict glycaemia control by the administration of insulin, on biochemical metabolic measurements, DNA methylation, genic expression and cell signaling of proteins related to insulin, and the content of mitochondria in blood or brain of streptozotozin (STZ)-induced hyperglycemic animals. It was here observed, that animals receiving STZ showed an altered islets of Langerhans architecture that provoked reduced blood insulin concentration, hyperglycemia and hyperlipidemia, and marked bodyweight lost. These peripheral chronic metabolic alterations elicited a series of events in the central nervous system (CNS) characterized by: i) reduced gene expression of hippocampal insulin and interleukin-10 (IL-10); ii) correct phosphorylation of target proteins of the insulin receptors, including insulin receptor substrate-1 (IRS-1) and Akt in the cerebral cortex; iii) increased number of mitochondria in the olfactory bulbs; and iv) increased DNA methylation in hippocampus. The alterations linked to reduced IL-10 expression and DNA methylation were significantly prevented and/or reverted by the exogenous insulin. According to these data, the following conclusions could be formulated: i) there is a peripheral independent insulin metabolism in the CNS, with specific objectives for insulin synthesis, maturation and signaling; ii) the insulin-induced control of hyperglycemia prevents from epigenetic alterations; iii) this better characterization of the STZ-induced hyperglycemia animal model will allow further utilization for different metabolic challenges.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:43:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317842.pdf: 1874621 bytes, checksum: 1625556e3bf30951e00ec4f3cd4b2d07 (MD5) Previous issue date: 2013 / O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma espécie tropical com tem um elevado valor económico, é o principal elemento na produção de chocolate o alto conteúdo de polifenóis o há posicionado como um produto antioxidante. O cacaueiro a além de ser um dos principais componentes econômicos nas regiões onde é cultivado exerce também um importante papel na preservação ambiental. No entanto, às características botânicas que esta espécie apresenta, associadas a um alto grau de auto-incompatibilidade, os plantios comerciais apresentam alta heterozigosidade genética, afetando diretamente a produtividade do seu cultivo, gerando assim a necessidade dos melhores genótipos serem propagados assexuadamente. Por estão razão, a embriogênese somática se configura como alternativa eficiente para a propagação de genótipos elite, permitindo a captura e fixação de ganhos genéticos. A técnica de cultura de tecidos, como a embriogênese somática tem sido rotineiramente usada tanto como uma técnica de propagação clonal de plantas, bem como um modelo válido para investigar eventos estruturais, fisiológicos e moleculares que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário. No presente trabalho buscou-se avaliar a resposta embriogênica e capacidade de formar embriões somáticos dos genótipos do grupo genético Nacional, visando estabelecer um protocolo de propagação baseado na embriogênese somática. Assim, também integraram-se duas técnicas como a quantificação do padrão de metilação do DNA de embriões e das plântulas obtidas durante a embriogênese somática, assim como também a elaboração de um perfil proteômico dos embriões somáticos formados durante a embriogênese somática de Theobroma cacao L. Propondo-se identificar a relação da metilação DNA e a capacidade conversão dos embriões somáticos, visto que a metilação do DNA é um dos mediadores chave no mecanismo epigenético associado ao desenvolvimento embrionário. Neste contexto, o presente trabalho foi estruturado em capítulos, para facilitar a compreensão dos resultados obtidos. O primeiro capítulo consiste no estado da arte e situação do problema, no qual a traves de uma revisão bibliográfica se trata de mostrar aspectos relevantes de Theobroma cacao L., da embriogênese somática, da metilação do DNA e da proteômica em plantas. O segundo capítulo consiste na avaliação da resposta dos genótipos de grupo Nacional à embriogênese somática. O terceiro capítulo relaciona aos níveis de metilação do DNA global em embriões somáticos formados durante a embriogênese somática secundaria e as plântulas obtidas durante a conversão e o quarto aborda a proteômica comparativa como uma ferramenta para identificar proteínas relacionadas com a capacidade de conversão dos embriões somáticos de Theobroma cacao L.<br>

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:15Z : No. of bitstreams: 1 000869033_20170527.pdf: 824646 bytes, checksum: 00f5f8bbdd7abcbefcbd2d042d519568 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-06-02T11:56:26Z: 000869033_20170527.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-06-02T11:57:14Z : No. of bitstreams: 1 000869033.pdf: 3301498 bytes, checksum: de14b09badf78ded8a950b747525f42b (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer de tireoide (CT) é a neoplasia mais comum do sistema endócrino. O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) compreende 80-85% dos casos, seguido dos carcinomas foliculares (CFT), pouco diferenciados (CPDT) e anáplasicos (CAT). O diagnóstico dos CT, principalmente nos casos bem diferenciados, ainda é um desafio devido a semelhanças morfológicas compartilhadas por esses tumores e lesões benignas (LBT). O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil de metilação do DNA para identificar marcadores epigenéticos envolvidos no desenvolvimento das lesões benignas e dos diferentes subtipos histológicos de carcinomas. Além disso, buscou-se identificar marcadores prognósticos nos CT. Foram incluídos nesse estudo 17 lesões benignas da tireoide (8 adenomas, 6 bócios tireoideanos e 3 tireoidites), 60 CPT, 8 CFT, 2 carcinomas de células de Hurthle (CCH), 1 CPDT e 3 CAT, além de 50 tecidos não neoplásicos (TN) obtidos dos pacientes que tiveram CPT. As análises de metilação diferencial foram realizadas utilizando a plataforma microarray Infinium® Human Methylation450 BeadChip (Illumina). Na primeira etapa do estudo, os resultados obtidos de sondas diferencialmente metiladas foram utilizados na construção de um algoritmo útil como classificador diagnóstico. Na segunda etapa, o perfil de metilação do DNA das lesões benignas e dos diferentes subtipos tumorais foi comparado aos dados de tecidos não neoplásicos. Somente sondas significativamente alteradas no presente estudo e aquelas confirmadas no GEO (Gene Expression Omnibus) foram selecionadas para a construção de algoritmos. Foram delineados três algoritmos diagnósticos baseados na metilação diferencial de nove sondas selecionadas a partir de área abaixo da curva de 0,75 para o classificador de LBT e 0,90 para os classificadores CFT e CPT além de análise multivariada. Foram também aplicados métodos lineares de classificação. A aplicação do algoritmo... / Thyroid cancer (TC) is the most prevalent type of endocrine cancer. Papillary thyroid carcinoma (PTC) comprises 80-85% of the diagnosed thyroid cancers, followed by follicular (FTC), poorly differentiated (PDTC) and anaplastic carcinomas (ATC). Diagnosis of thyroid carcinomas, especially of well-differentiated carcinomas is a challenge due to morphological similarities between these tumors and benign lesions. The aim of this study was to evaluate the methylation profile to identify diagnostic markers involved in benign lesions and in different histological subtypes of carcinomas. Moreover, a search for reliable molecular prognostic markers was also performed in TC. The study included 17 benign lesions (8 adenomas, 6 goiters and 3 thyroiditis), 60 PTCs, 8 FTCs, 2 Hürthle cell carcinomas (HCC), 1 PDTC and 3 ATC, as well as 50 non-neoplastic tissues (NT) obtained from patients who had PTC. Differential methylation analyzes were performed using the Infinium® Human Methylation450 BeadChip microarray (Illumina). In the first stage of the study, the results of differentially methylated probes were used in the development of diagnostic classifier algorithm. In second step, the methylation profile of benign lesions and tumor subtypes was compared to data from non-neoplastic tissues. Only probes significantly altered in the current study and those confirmed by GEO data (Gene Expression Omnibus) were selected for the development of the algorithms. Three diagnostic algorithms were developed based on differential methylation of nine probes selected from area under the curve of 0.75 for BTL classifier and 0.90 for FTC and PTC classifiers and multivariate analysis. It was also applied linear classification methods. Application of the algorithm diagnosis allowed the correct classification of non-neoplastic tissues, benign and malignant lesions (sensitivity: 91.9% and specificity: 76.5%). The same strategy was performed using the GEO database...

Submitted by BRUNA CRISTINA JERONIMO null (bruna.jer@gmail.com) on 2016-09-27T23:44:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna - Correções Adriane versão final para imprimir.pdf: 2531830 bytes, checksum: 468a11d8d93e4d6cdb8212717e577790 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-29T18:29:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 jeronimo_bc_me_bot.pdf: 2531830 bytes, checksum: 468a11d8d93e4d6cdb8212717e577790 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-29T18:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jeronimo_bc_me_bot.pdf: 2531830 bytes, checksum: 468a11d8d93e4d6cdb8212717e577790 (MD5) Previous issue date: 2016-06-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Em contraste ao padrão de cromossomos sexuais de mamíferos (XX/XY), as aves apresentam um sistema de determinação sexual em que os machos representam o sexo homogamético (ZZ) e as fêmeas constituem o sexo heterogamético (ZW). Adicionalmente, embora mamíferos apresentem um mecanismo de compensação de dose, a inativação completa de um dos cromossomos Z não é observada em machos de aves e, portanto, estes possuem um maior nível de expressão de vários genes presentes nesse cromossomo. A despeito disso, um mecanismo ainda não completamente esclarecido de compensação de dose parcial em aves resulta em expressão equivalente entre os sexos para alguns genes do cromossomo Z. A região MHM (Male Hypermethylated), localizada no cromossomo Z de Galliformes, está associada a um padrão de hipermetilação em machos e hipometilação em fêmeas, levando à síntese de um RNA não-codificante longo (lncRNA) somente em fêmeas. A presença deste lncRNA é associada ao aumento da expressão de genes próximos à região MHM em fêmeas, o que parece resultar em uma compensação de dose local entre os sexos. Dado que, até o momento, segmentos MHM foram somente identificados em Galiformes e Anseriformes, o presente estudo visou isolar e caracterizar esta região em Galliformes (galinha doméstica, codorna européia, peru) e também em Struthioniformes (avestruz), Strigiformes (coruja-orelhuda, corujinha-do-mato, coruja-da-igreja, coruja-buraqueira), Piciformes (tucanuçu), Psittaciformes (arara-azul-grande) e Apodiformes (beija-flor-da-banda-branca, beija-flor-tesoura, beija-flor-preto). Indivíduos adultos e embriões com seis dias de desenvolvimento foram sexados com base em caracteres morfológicos e moleculares - por meio de PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificação de uma região intrônica dos genes CHD1-Z e CHD1-W, seguida de eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida, análise SSCP e análise automatizada de fragmentos de DNA. Métodos de sexagem molecular mostraram-se adequados para identificação de machos e fêmeas de galinha doméstica, codorna européia, peru, tucanuçu, arara-azul-grande, coruja-orelhuda, corujinha-do-mato, coruja-buraqueira, beija-flor-da-banda-branca, beija-flor-tesoura e beija-flor-preto. Entretanto, as técnicas moleculares utilizadas não permitiram identificar diferenças entre machos e fêmeas de avestruz. Análises in silico da região MHM de galinha doméstica mostraram que esta se encontra localizada no braço curto do cromossomo Z, sendo constituída por 260Kb (chrZ:27,000,000-27,260,000) e alto conteúdo de CG. Esta região é delimitada por duas LINES (Long Interspersed Nuclear Elements) e possui múltiplos elementos repetitivos da classe LTR (Long Terminal Repeat), especialmente os pertencentes à família EVRL (Endogenous Retrovirus), denominados GGLTR5A. Com base em sua composição genômica, a região MHM de galinha doméstica foi subdividida em sub-regiões - denominadas de 1 (chrZ:27,176,712-27,260,282), 2 (chrZ:27,132,044-27,174,901), 3a (chrZ:27,094,512-27,132,043), 4 (chrZ:27,036,950-27,094,511) e 3b (chrZ:27,000,000-27,036,949) - que apresentam-se compostas por três unidades de repetições diferentes (denominadas de repeats 1, 2 e 3) flanqueadas por LTRs específicas. PCR multiplex em amostras de galinha doméstica levou à amplificação de dois fragmentos de DNA de aproximadamente 240 e 750 pares de bases, sendo o fragmento maior correspondente à repeat 1 da região MHM. Assim como observado para galinha doméstica, também foram gerados, via PCR, dois fragmentos de DNA de diferentes tamanhos associados à região MHM para as outras espécies de aves estudadas. Um maior nível de identidade (80-97%) foi observado entre a região MHM de galinha doméstica e as sequências nucleotídicas obtidas de codorna européia, peru e avestruz, o que demonstra que a presença de segmentos MHM não se restringe ao genoma de Galliformes e Anseriformes. Ensaios de digestão enzimática em DNA genômico de galinha doméstica, codorna européia e peru, por meio do uso de endonucleases de restrição sensíveis à metilação e dependentes de metilação (MspI, HpaII e McrBC), seguidos de amplificação de um fragmento de DNA associado à sub-região 1 MHM, evidenciaram padrões diferenciais de metilação dessa região entre os sexos, sendo hipometilada em fêmeas e hipermetilada em machos. Tais padrões diferenciais mostram-se potencialmente adequados para aplicação em testes de sexagem molecular em espécies de aves. / In contrast to the sexual chromosomes pattern found in mammals (XX/XY), birds present a sex determination system in which males represent the homogametic sex (ZZ) and females correspond to the heterogametic sex (ZW). Furthermore, although mammals present a dosage compensation mechanism, the complete inactivation of one Z chromosome is not observed in male birds and, therefore, they have a higher expression level of several genes that are found in this chromosome. Despite this, a mechanism of partial dosage compensation that was not clearly explained so far for birds results on an equivalent expression between sexes for some of the genes found at the Z chromosome. The MHM region (Male Hypermethylated), localized at the Z chromosome of Galliformes, is associated to a hypermethylation pattern in males and hypomethylation in females, which leads to the synthesis of a long non-coding RNA (lncRNA) only in females. The presence of this lncRNA is associated with a higher expression of genes that are located near to the MHM region in females, which seems to result in a local dosage compensation between sexes. As MHM segments were so far identified only in Galliformes and Anseriformes, the present study aimed to isolate and characterize this region on Galliformes (chicken, European quail, turkey) and also on Struthioniformes (ostrich), Strigiformes (striped owl, tropical screech-owl, barn owl, burrowing owl), Piciformes (toco toucan), Psittaciformes (hyacinth macaw), and Apodiformes (versicolored emerald, swallow-tailed hummingbird, black jacobin). Adult individuals and six-day embryos were sexed based on morphological and molecular characters - throughout PCR (Polymerase Chain Reaction) to amplify an intronic region of the CHD1-Z e CHD1-W genes, followed by agarose and polyacrylamide electrophoresis, SSCP analysis and automated fragment DNA analysis. Molecular sexing methodologies were useful for the identification of males and females of chicken, European quail, turkey, toco toucan, hyacinth macaw, striped owl, tropical screech-owl, burrowing owl, versicolored emerald, swallow-tailed hummingbird, and black jacobin. However, the applied techniques were not effective to identify differences between male and female ostriches. In silico analyses of the chicken MHM region showed that it is localized at the short arm of the Z chromosome and is constituted by 260Kb (chrZ:27,000,000-27,260,000) and a high CG content. This region is delimited by two LINES (Long Interspersed Nuclear Elements) and presents multiple repetitive elements of the LTR (Long Terminal Repeat) class, especially those of the EVRL (Endogenous Retrovirus) family, denominated GGLTR5A. Based on its genomic composition, the MHM region was subdivided into sub regions – denominated as 1 (chrZ:27,176,712-27,260,282), 2 (chrZ:27,132,044-27,174,901), 3a (chrZ:27,094,512-27,132,043), 4 (chrZ:27,036,950-27,094,511), and 3b (chrZ:27,000,000-27,036,949) - that are composed by three different repeat units (denominated as repeats 1, 2 e 3) flanked by specific LTRs. Multiplex PCR on chicken samples resulted in the amplification of two different size DNA fragments of around 240 and 750 base pairs, and the larger fragment corresponds to the repeat 1 of the MHM region. As observed for chicken, two different DNA fragments associated to the MHM region were also generated, by PCR, for the other studied species. A higher identity index (80-97%) was recognized between the chicken MHM region and the obtained nucleotide sequences of European quail, turkey and ostrich, which evidences that the presence of MHM segments is not restricted to the Galliformes and Anseriformes genomes. Enzymatic digestion assays in genomic DNA samples of chicken, European quail and turkey, through the use of methylation sensitive and methylation dependent restriction endonucleases (MspI, HpaII e McrBC), followed by the amplification of a DNA fragment associated to the sub region 1 MHM, showed differential methylation patterns between sexes - hypomethylated in females and hypermethylated in males. These differential patterns are potentially applicable for molecular sexing tests in bird species. / CNPq: 131152/2014-9

Orientador: Silvia Regina Rogatto / Banca: Patricia Pintor dos Reis / Banca: Miriam Galvonas Jasiulionis / Banca: Janete Maria Cerutti / Banca: Sandra A. Drigo Linde / Resumo: O câncer de tireoide (CT) é a neoplasia mais comum do sistema endócrino. O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) compreende 80-85% dos casos, seguido dos carcinomas foliculares (CFT), pouco diferenciados (CPDT) e anáplasicos (CAT). O diagnóstico dos CT, principalmente nos casos bem diferenciados, ainda é um desafio devido a semelhanças morfológicas compartilhadas por esses tumores e lesões benignas (LBT). O objetivo desse estudo foi avaliar o perfil de metilação do DNA para identificar marcadores epigenéticos envolvidos no desenvolvimento das lesões benignas e dos diferentes subtipos histológicos de carcinomas. Além disso, buscou-se identificar marcadores prognósticos nos CT. Foram incluídos nesse estudo 17 lesões benignas da tireoide (8 adenomas, 6 bócios tireoideanos e 3 tireoidites), 60 CPT, 8 CFT, 2 carcinomas de células de Hurthle (CCH), 1 CPDT e 3 CAT, além de 50 tecidos não neoplásicos (TN) obtidos dos pacientes que tiveram CPT. As análises de metilação diferencial foram realizadas utilizando a plataforma microarray Infinium® Human Methylation450 BeadChip (Illumina). Na primeira etapa do estudo, os resultados obtidos de sondas diferencialmente metiladas foram utilizados na construção de um algoritmo útil como classificador diagnóstico. Na segunda etapa, o perfil de metilação do DNA das lesões benignas e dos diferentes subtipos tumorais foi comparado aos dados de tecidos não neoplásicos. Somente sondas significativamente alteradas no presente estudo e aquelas confirmadas no GEO (Gene Expression Omnibus) foram selecionadas para a construção de algoritmos. Foram delineados três algoritmos diagnósticos baseados na metilação diferencial de nove sondas selecionadas a partir de área abaixo da curva de 0,75 para o classificador de LBT e 0,90 para os classificadores CFT e CPT além de análise multivariada. Foram também aplicados métodos lineares de classificação. A aplicação do algoritmo... / Abstract: Thyroid cancer (TC) is the most prevalent type of endocrine cancer. Papillary thyroid carcinoma (PTC) comprises 80-85% of the diagnosed thyroid cancers, followed by follicular (FTC), poorly differentiated (PDTC) and anaplastic carcinomas (ATC). Diagnosis of thyroid carcinomas, especially of well-differentiated carcinomas is a challenge due to morphological similarities between these tumors and benign lesions. The aim of this study was to evaluate the methylation profile to identify diagnostic markers involved in benign lesions and in different histological subtypes of carcinomas. Moreover, a search for reliable molecular prognostic markers was also performed in TC. The study included 17 benign lesions (8 adenomas, 6 goiters and 3 thyroiditis), 60 PTCs, 8 FTCs, 2 Hürthle cell carcinomas (HCC), 1 PDTC and 3 ATC, as well as 50 non-neoplastic tissues (NT) obtained from patients who had PTC. Differential methylation analyzes were performed using the Infinium® Human Methylation450 BeadChip microarray (Illumina). In the first stage of the study, the results of differentially methylated probes were used in the development of diagnostic classifier algorithm. In second step, the methylation profile of benign lesions and tumor subtypes was compared to data from non-neoplastic tissues. Only probes significantly altered in the current study and those confirmed by GEO data (Gene Expression Omnibus) were selected for the development of the algorithms. Three diagnostic algorithms were developed based on differential methylation of nine probes selected from area under the curve of 0.75 for BTL classifier and 0.90 for FTC and PTC classifiers and multivariate analysis. It was also applied linear classification methods. Application of the algorithm diagnosis allowed the correct classification of non-neoplastic tissues, benign and malignant lesions (sensitivity: 91.9% and specificity: 76.5%). The same strategy was performed using the GEO database... / Doutor