A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é, bioquimicamente, evidenciada pelo acúmulo de guanidino acetato (GAA) e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos da disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase, a creatina quinase (CK) e a acetilcolinesterase (AChE) têm um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), e a alteração dessas enzimas, juntamente com a diminuição do metabolimo energético e a indução do estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o SNC, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Propriedades neurotóxicas do GAA têm sido atribuídas, principalmente, à excitotoxicidade e ao estresse oxidativo. Dessa forma, esse trabalho tem como propósito ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, investigando o efeito in vitro e in vivo (administração intra-estriatal de GAA), sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, CK, AChE, metabolismo energético, bem como a recaptação de glutamato e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) em estriado de ratos. Finalmente, investigamos o efeito da administração intra-estriatal de GAA sobre a memória/aprendizagem em estriado de ratos. Nossos resultados mostraram que a administração intraestriatal de GAA diminui as atividades da Na+,K+-ATPase, CK e complexo II e aumenta o TBARS e a atividade da AChE. Além destes, mostramos que o GAA inibe a recaptação de glutamato e induz estresse oxidativo em estriado de ratos. A administração de GAA, também é capaz de prejudicar a memória de ratos adultos. A inibição das atividades da Na+,K+-ATPase, da CK e do complexo II e o aumento do TBA e da atividade da AChE, causados pela administração intraestriatal de GAA, foram prevenidos pelo pré-tratamento (uma semana) com as vitaminas E e C ou taurina. Considerando os resultados apresentados, propõe-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, da CK, do complexo II, bem como da inibição na recaptação de glutamato e de indução de estresse oxidativo causados pelo GAA possam estar envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT. / Guanidinoacetate methyltransferase deficiency (GAMT-deficiency) is an inborn error of creatine metabolism characterized by muscular hypotonia, involuntary extrapiramidal movements and epilepsy. The disease is biochemically characterized by accumulation of guanidinoacetate and deficiency of creatine and phosphocreatine in tissues of affected patients. However, the mechanisms underlying the neurological dysfunction of GAMTdeficiency patients are not well understood. Na+,K+-ATPase, creatine kinase (CK) and acetylcholinesterase (AChE) play a fundamental role in central nervous system (CNS). Alterations in these enzymes with reduction of energy metabolism and induction of oxidative stress have been associated to neurological diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, Huntington’s disease and brain ischemia. Neurotoxic properties of GAA have been mainly related to excitotoxicity and oxidative stress. In this study we investigated possible pathophysiologic mechanisms of GAMT-deficiency. We studied the in vitro effect of GAA and the effect of GAA intrastriatal administration on Na+,K+- ATPase, CK and AChE activities, on brain metabolism, on glutamate uptake and on reactive oxidative species (ROS) production in striatum of adult rats. Finally, we investigated the effect of intraestriatal administration of GAA on inhibitory avoidance in adult rats. Our results showed that the intrastriatal administration inhibits Na+,K+-ATPase, CK and complex II activities and increases TBARS and AChE activity. We also showed that GAA in vitro inhibits glutamate uptake and induces oxidative stress. GAA administration also impairs memory in adult rats. The inhibition of Na+,K+-ATPase, CK and complex II activities and increase of TBARS production caused by intrastriatal administration of GAA was prevented by vitamins E and C or taurine pretreatment (for one week). Our findings indicate that inhibition of Na+,K+- ATPase, CK and complex II activities and alterations in glutamate uptake and oxidative stress caused by GAA may contribute to the neurological dysfunction characteristic of GAMT-deficiency patients.

Orientador: Marcelo Rocha Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba. / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:47:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_Glauciade1985-_M.pdf: 1041410 bytes, checksum: aba09e2e49414c9f9f0be4938f591a70 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A periodontite crônica é uma doença inflamatória que leva à perda de inserção de elementos dentários, e é desencadeada e mantida por um biofilme subgengival periodontopatogênico. A presença de alguns tipos de lipopolissacarídeos (LPS), derivados de bactérias no sítio periodontal doente, pode iniciar uma sinalização por meio das células do tecido gengival, que culminará com um microambiente com diferentes células do sistema imune e com uma alteração no padrão de expressão de citocinas inflamatórias. Já foi evidenciado que no tecido gengival de pacientes com periodontite crônica, genes que codificam receptores celulares para o LPS, podem sofrer alterações epigenéticas. O objetivo deste estudo foi avaliar se a periodontite crônica e o LPS bacteriano derivado de P. gingivalis podem modular a expressão gênica de alguns fatores reguladores de eventos epigenéticos. Biópsias de tecido gengival inflamado e sem inflamação foram coleados de pacientes com periodontite crônica e de pacientes saudáveis respectivamente, o RNA total foi extraído e a expressão dos genes DNMT1 (DNA metiltransferase 1), DNAMT3a (DNA metiltransferase 3a), histona demetilase JMJD3 e histona demetilase UTX foram analisadas por meio de RT-PCR quantitativo. Fibroblastos gengivais humanos derivados de cultura primária, e queratinócitos (HaCaT) foram expostos a LPS de P. gingivalis ou ao veículo do LPS, e foram avaliadas a viabilidade celular por meio do teste MTT e a expressão gênica de DNMT1, DNMT3a, JMJD3 e UTX por meio de RT-PCR quantitativo. As análises dos resultados demonstraram que nem a periodontite e nem o LPS exposto a fibroblastos gengivais foram capazes de modular a expressão dos genes estudados. Contudo, o LPS promoveu a diminuição da expressão de DNMT1, DNMT3a e JMJD3 nas células HaCaT. Pode-se concluir que LPS derivado P. gingivalis pode modular, em queratinócitos, a expressão gênica de algumas enzimas promotoras de eventos epigenéticos / Abstract: The aim of this study was to assess whether P. gingivalis LPS can modulate, in culture of the human keratinocytes and human gingival fibroblasts, gene expression levels of the some enzymes that promote epigenetic events. In addition, the same enzymes were evaluated in sample from healthy and periodontitis affected individuals. Primary gingival fibroblast culture and keratinocytes (HaCaT) were treated with medium containing P. gingivalis LPS or P. gingivalis LPS vehicle for 24hs. After this period, cell viability were assessed by MTT test, and total RNA were extracted to evaluate gene expression levels of the enzymes: DNMT1 (DNA methyltransferase 1), DNMT3a (DNA methyltransferase 3a), histone demethylases JMJD3 and UTX, by qRT-PCR. To evaluate the gene expression in healthy and periodontitis affected individuals, total RNA was extracted from biopsies of gingival tissue from sites with (periodontitis) or without periodontitis (healthy), and gene expression of DNMT1, DNAMT3a, JMJD3 and UTX were evaluated by qRT-PCR. No significant differences were found in the gene expression analysis between healthy gingival tissues and gingival tissue from periodontitis sites. The results showed that LPS downregulated DNMT1 (p<0.05), DNMT3a (p<0.05) and JMJD3 (p<0.01) gene expression in HaCaT cells, but no modulation was found to gingival fibroblasts. P. gingivalis LPS exposure to keratinocytes, downregulates gene expression of the enzymes that promote epigenetic events / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

A síntese noturna de melatonina pela glândula pineal é inibida por padrões moleculares associados à patógenos ou à danos, como por exemplo lipopolissacarídeo (LPS) ou peptídeo &#946;-amilóide. A interação destas moléculas com receptores toll 4 (TLR4) ativa o eixo imune-pineal, favorecendo a migração de leucócitos para o local da injúria. Heparan sulfato (HS) é um glicosaminoglicano da matrix extracelular que por dano tecidual, inflamação generalizada ou migração de células tumorais, liberam dissacarídeos que podem ligar a TLR4, levando a formação de uma resposta inflamatória. Avaliamos se HS poderia prejudicar a atividade da melatonina. HS é capaz de inibir a síntese noturna de melatonina, através da supressão da expressão gênica e do conteúdo enzimático de acetilserotonina O-metiltransferase (ASMT). Este efeito é modulado pela interação de HS com TLR4, mas não envolve a via de translocação nuclear de NF-&#954;B. Estes dados sugerem que um aumento de moléculas de HS na matriz da glândula pineal é traduzido a todo o organismo por uma redução no pico noturno de melatonina. / The nocturnal synthesis of melatonin by the pineal gland is inhibited by pathogen or damage-associated molecular patterns, such as lipopolysaccharide (LPS) and &#946;-amyloid peptide. The interaction of these molecules with toll like receptors 4 (TLR4) activates the immune-pineal axis, favoring the migration of leukocytes for the site of lesion. Heparan sulfate (HS), a glycosaminoglycan of the extracellular matrix, that in case of tissue injury, generalized inflammation or migration of tumor cells, releases disaccharide, which can bind to TLR4 triggering an inflammatory response. Here we evaluated if HS could impair nocturnal melatonin activity. HS is capable of inhibit the melatonin synthesis by the suppression of the gene expression and enzymatic content of acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT). This effect is modulated by the interaction of HS with TLR4, but does not involve the NF-&#954;B nuclear translocation pathway. This data suggest that the increase in HS in pineal gland matrix is translated to the whole organism by a reduction in the nocturnal melatonin peak.

INTRODUÇÃO: O caráter familial do transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) já é bem estabelecido. O gene da catecol O-metiltransferase (COMT) vem sendo objeto de estudo na genética de transtornos mentais, como o TOC. No caso deste transtorno, os resultados de estudos de associação com o gene da COMT são, em sua maioria, contraditórios. Meta-análises prévias, todas elas conduzidas com limitações metodológicas, encontraram achados também divergentes. Nesta tese, foram realizadas: uma revisão sistemática da literatura sobre estudos de associação baseados em famílias envolvendo o polimorfismo Val158Met do gene da COMT e o TOC e duas meta-análises, uma convencional e outra bayesiana, a fim de sintetizar os achados sobre este tema. MÉTODOS: Este trabalho seguiu o protocolo para revisão sistemática e meta-análise da Rede de Epidemiologia Genética Humana (HuGE). A busca por estudos de associação baseados em famílias foi feita em cinco bases de dados eletrônicas, assim como foram pesquisados estudos não publicados, dentre os quais um estudo ainda inédito, liderado pela autora desta tese. A meta-análise convencional foi calculada com o auxílio do programa STATA V. 11 e a bayesiana a partir da média das verossimilhanças. Foram investigados os viéses de publicação, heterogeneidade, além de análise de sensibilidade e metarregressão. RESULTADOS: O estudo original, que contou com 83 trios, conduzido pela autora desta tese, não encontrou associação entre COMT e TOC. Este estudo, em conjunto com mais oito estudos (seis estudos publicados e dois não publicados), foram incluídos na meta-análise. As meta-análises com método convencional e bayesiano não encontraram associação entre o polimorfismo Val158Met do COMT e o TOC na amostra total, nem nas amostras separadas por gênero. CONCLUSÕES: Contrariando meta-análises prévias, os achados deste estudo não demonstraram associação entre COMT e TOC. No entanto, a participação do gene da COMT em subgrupos específicos do TOC e em seus endofenótipos de risco ainda merece ser investigada / BACKGROUND: Obsessive-compulsive disorder (OCD) has long been considered a familial disorder. The catechol-O-methyltransferase gene has been studied in several mental disorders, including OCD. Particularly in this disorder, the findings of an association between COMT and OCD are inconclusive. Previous meta-analyses, which were conducted with several methodological limitations, found conflicting results. This work comprises: a systematic literature review regarding family-based association studies involving the COMT Val158Met polymorphism and OCD, and two metaanalyses, a conventional and a Bayesian meta-analysis, to summarize the findings on this subject. METHODS: This study was performed according to the Human Genome Epidemiology network (HuGE) guidelines for systematic review and meta-analysis. The search for family-based association studies were conducted in five electronic databases and in sources from unpublished studies. An original unpublished study, led by the author of this thesis, was included in the meta-analysis. The conventional meta-analysis was calculated with the STATA V.11 software and the Bayesian meta-analysis through the likelihood mean. Publication bias and heterogeneity were investigated. Sensitivity analysis and meta-regression were also performed. RESULTS: The original study with 83 OCD trios, conducted by the author of this thesis, found no association between COMT and OCD. This study, together with eight other studies (six studies being published and two unpublished), were included in the meta-analysis. Meta-analyses with the conventional and Bayesian method found no association between the COMT Val158Met polymorphism and OCD in the total, female-only or male-only samples. CONCLUSIONS: Different from previous meta-analyses, this study does not support the association between COMT and OCD. However, the involvement of the COMT gene in specific subgroups of OCD or endophenotypes associated with a risk for OCD should be further investigated

INTRODUÇÃO: O caráter familial do transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) já é bem estabelecido. O gene da catecol O-metiltransferase (COMT) vem sendo objeto de estudo na genética de transtornos mentais, como o TOC. No caso deste transtorno, os resultados de estudos de associação com o gene da COMT são, em sua maioria, contraditórios. Meta-análises prévias, todas elas conduzidas com limitações metodológicas, encontraram achados também divergentes. Nesta tese, foram realizadas: uma revisão sistemática da literatura sobre estudos de associação baseados em famílias envolvendo o polimorfismo Val158Met do gene da COMT e o TOC e duas meta-análises, uma convencional e outra bayesiana, a fim de sintetizar os achados sobre este tema. MÉTODOS: Este trabalho seguiu o protocolo para revisão sistemática e meta-análise da Rede de Epidemiologia Genética Humana (HuGE). A busca por estudos de associação baseados em famílias foi feita em cinco bases de dados eletrônicas, assim como foram pesquisados estudos não publicados, dentre os quais um estudo ainda inédito, liderado pela autora desta tese. A meta-análise convencional foi calculada com o auxílio do programa STATA V. 11 e a bayesiana a partir da média das verossimilhanças. Foram investigados os viéses de publicação, heterogeneidade, além de análise de sensibilidade e metarregressão. RESULTADOS: O estudo original, que contou com 83 trios, conduzido pela autora desta tese, não encontrou associação entre COMT e TOC. Este estudo, em conjunto com mais oito estudos (seis estudos publicados e dois não publicados), foram incluídos na meta-análise. As meta-análises com método convencional e bayesiano não encontraram associação entre o polimorfismo Val158Met do COMT e o TOC na amostra total, nem nas amostras separadas por gênero. CONCLUSÕES: Contrariando meta-análises prévias, os achados deste estudo não demonstraram associação entre COMT e TOC. No entanto, a participação do gene da COMT em subgrupos específicos do TOC e em seus endofenótipos de risco ainda merece ser investigada / BACKGROUND: Obsessive-compulsive disorder (OCD) has long been considered a familial disorder. The catechol-O-methyltransferase gene has been studied in several mental disorders, including OCD. Particularly in this disorder, the findings of an association between COMT and OCD are inconclusive. Previous meta-analyses, which were conducted with several methodological limitations, found conflicting results. This work comprises: a systematic literature review regarding family-based association studies involving the COMT Val158Met polymorphism and OCD, and two metaanalyses, a conventional and a Bayesian meta-analysis, to summarize the findings on this subject. METHODS: This study was performed according to the Human Genome Epidemiology network (HuGE) guidelines for systematic review and meta-analysis. The search for family-based association studies were conducted in five electronic databases and in sources from unpublished studies. An original unpublished study, led by the author of this thesis, was included in the meta-analysis. The conventional meta-analysis was calculated with the STATA V.11 software and the Bayesian meta-analysis through the likelihood mean. Publication bias and heterogeneity were investigated. Sensitivity analysis and meta-regression were also performed. RESULTS: The original study with 83 OCD trios, conducted by the author of this thesis, found no association between COMT and OCD. This study, together with eight other studies (six studies being published and two unpublished), were included in the meta-analysis. Meta-analyses with the conventional and Bayesian method found no association between the COMT Val158Met polymorphism and OCD in the total, female-only or male-only samples. CONCLUSIONS: Different from previous meta-analyses, this study does not support the association between COMT and OCD. However, the involvement of the COMT gene in specific subgroups of OCD or endophenotypes associated with a risk for OCD should be further investigated

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:46:32Z : No. of bitstreams: 1 perecin_f_dr_jabo.pdf: 591625 bytes, checksum: f3212bddc59577b0aa73b9d7ef9f1d91 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A clonagem por transferência de núcleo é freqüentemente associada a resultados insatisfatórios devido à reprogramação nuclear anormal da célula somática doadora de núcleo e à expressão gênica alterada. O primeiro objetivo deste trabalho foi estudar a freqüência dos RNAs mensageiros das DNA metiltransferases (DNMT) 1, 3A e 3B, e do gene de expressão constitutiva gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em blastocistos bovinos isolados produzidos in vivo e in vitro por transferência nuclear (TN) de célula somática, ativação partenogenética e fertilização in vitro (FIV). O segundo objetivo foi avaliar a expressão das DNMTs e dos genes imprinted IGF2, IGF2R e H19 em membranas cório-alantóide e fetos bovinos produzidos in vivo e in vitro por TN, ativação partenogenética e FIV e recuperados entre os dias 33 e 36 de gestação. Houve decréscimo (P<0,05) na freqüência do GAPDH nos blastocistos TN e partenogenéticos quando comparados aos embriões fertilizados, e também diferença entre blastocistos TN produzidos com diferentes protocolos de sincronização celular (células em G0 ou G1 do ciclo celular). Com relação às DNMTs, não foram identificados transcritos da DNMT1 nos blastocistos do grupo TN-G0; ocorreu diminuição na freqüência dos transcritos da DNMT3B nos embriões TN quando comparados aos partenotos. Não se observou diferença na freqüência relativa das DNA metiltransferases em membranas cório-alantóide e fetos. Com relação aos genes imprinted, o grupo partenogenético apresentou menor nível de expressão de IGF2 em relação aos os demais grupos; baixos níveis de expressão de IGF2 e IGF2R foram observados, respectivamente, em amostras de feto e de cório-alantóide derivadas de animais clonados por TN, quando comparadas aos grupos fertilizados in vivo e in vitro. / Cloning by nuclear transfer is often associated with poor results due to abnormal nuclear reprogramming of somatic cell donor and altered gene expression. The first objective of this study was to evaluate the frequency of DNA methyltranferases (DNMT) 1, 3A and 3B, and the housekeeping glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNAs in single bovine blastocysts produced in vivo or in vitro by somatic cell nuclear transfer (SCNT), parthenogenetic activation and in vitro fertilization (IVF). The second objective was to evaluate the expression of DNMTs and imprinted genes IGF2, IGF2R and H19 in chorio-alantois membrane of bovine fetuses produced in vivo or in vitro by SCNT, parthenogenetic activation and IVF, and recovered between days 33 and 36 of gestation. There was strong GAPDH downregulation (P<0.05) in parthenogenetic and cloned by SCNT blastocysts when compared to fertilized ones, and also differences between cloned blastocysts produced with different cell synchronization (G0 or G1) protocol. Regarding DNMTs expression, we did not identify DNMT1 transcrips in SCNT-G0 derived blastocysts, and observed DNMT3B downregulation in SCNT-derived embryos when compared to parthenotes. No differences in DNA methyltransferase relative frequency were seen in chorio-alantois membrane and fetuses. Regarding imprinted genes expression, downregulation of IGF2 in the parthenogenetic group was observed in comparision to all other groups, and also, downregulation of IGF2 and IGF2R in the cloned-derived fetuses and chorio-alantois samples, respectively, were observed comparing to in vivo and in vitro fertilized groups.

Os genes homeobox atuam como reguladores da morfogênese e diferenciação celular embrionária, portanto, é evidente a possibilidade de sua expressão anormal estar presente na progressão de tumores. Estudos preliminares em nosso laboratório verificaram a participação de alguns genes homeobox em carcinoma epidermóide de boca (CEB). Este trabalho teve como objetivo avaliar a amplificação, expressão e o perfil de metilação dos genes HOXA5, HOXA7, HOXA9, HOXB5, HOXB13, HOXC12 em linhagem celular derivadas de CEB e tecidos frescos tumoral e não-tumoral. Além disso, verificar o efeito da desmetilação na expressão gênica de linhagens celulares que apresentaram genes 100% metilados e a participação das enzimas responsáveis pela metilação do DNA, bem como a expressão das DNAmetiltransferases (DNMT) nos tumores. A análise de amplificação do DNA e expressão de mRNA foi realizada por qRT-PCR. O perfil de metilação foi avaliada pelo sistema PCR Array e a análise proteica das DNMT1, DNMT3a, DNMT3b e HOXA9 foi verificada por meio de reações imunohistoquímicas. As linhagens celulares SCC4 e SCC9 foram utilizadas para análise de desmetilação com 5-aza-2\'-deoxicitidina e a linhagem SCC4 para avaliar os efeitos do aumento de expressão do HOXA9, na proliferação celular por imunocitoquimica para Ki67, migração celular por transwell e apoptose pela avaliação de células positivas no ensaio de TUNEL. Na comparação entre os grupos, o gene HOXA5 apresentou-se amplificado na margem em relação ao tumor; o HOXA9 apresentou nível de metilação aumentada no tumor; o HOXB5 com amplificação maior na margem, com nível de expressão do mRNA aumentada nos tumores, e nível de metilação do tumor maior em relação a margem, sendo correlacionada com menor sobrevida; HOXB13 se apresentou amplificado no tumor em relação a margem, e com nível de metilação maior nos tumores e, HOXC12 com níveis de metilação maior nos tumores em relação a margem. É interessante, que os mesmos genes que tiveram níveis de metilação aumentados nos tumores em relação a margem, também estavam 100% metilados nas linhagens celulares SCC4 e SCC9 e tiveram sua expressão restaurada após o tratamento com 5-aza-2´-deoxicitina. Na avaliação do nível de expressão das DNMTs nos tumores, a DNMT3b apresentou-se com níveis aumentados em relação a DNMT1 e DNMT3a, e quando avaliado em nível proteico, a DNMT3a pode ser correlacionada com melhor sobrevida. O aumento da expressão do gene HOXA9 mostrou diminuição da migração celular, porém não alterou a proliferação e apoptose celular. A expressão proteica não apresentou correlação com parâmetros clínicos. Em conclusão, os resultados mostram que os genes homeobox estudados estão pouco metilados nas linhagens celulares e em tecidos de CEB. A amplificação desses genes não é um evento frequente. O gene HOXA9 é pouco expresso no tumor, e o aumento da sua expressão em linhagens celulares diminui a migração celular. / Homeobox genes are important as morphogenetic and embrionary cellular differentiation regulators, therefore there is basis for their abnormal expression in tumor progression. Preliminary studies in our laboratory have shown that homeobox genes are dysregulated in oral squamous cell carcinoma (OSCC). This study evaluates the genomic amplification, mRNA expression and methylation status of HOXA5, HOXA7, HOXA9, HOXB5, HOXB13, HOXC12 in squamous cell carcinoma derived cell lines, and fresh tumor tissue. Also, analyzes the demethylation effect in gene expression of cell lines with genes showing 100% methylation, and the participation of enzymes responsible for DNA methylation, DNAmetiltransferases (DNMT), in gene and protein expression in tumors. DNA amplification and mRNA expression was analyzed by qRT-PCR. The methylation profile was evaluated by PCR Array System and DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HOXA9 protein expression was verified by immunohistochemistry. SCC4 and SCC9 cell lines were submitted to 5-aza-2\'-deoxycytidine for demethylation analysis. SCC4 cell lineage was analyzed by immunocytochemistry for Ki67, cell migration by transwell and apoptosis by TUNEL test after increased expression of HOXA9. HOXA5 gene was amplified in the adjacent margin when compared with the tumor; HOXA9 showed increased level of methylation in tumor; HOXB5 showed amplification in the margin, increased mRNA expression in tumors, increased methylation level and was correlated with decreased survival; HOXB13 was amplified in tumor samples when compared to the margins and also higher methylation level in tumors; and HOXC12 also showed increased methylation levels in tumors when compared to margin. Interestingly, the same genes with increased methylation levels in tumors, were also 100% methylated in cell lines SCC4 and SCC9. The expression of these gens was restored after treatment with 5-aza-2\'-deoxycytidine. DNMT3b presented higher levels of protein expression relative to DNMT1 and DNMT3a. DNMT3a protein expression was correlated with improved survival. SCC4 cells overexpressing HOXA9 gene showed decreased cell migration, with no effect on cell proliferation and apoptosis. HOXA9 protein expression was not correlated with clinical parameters. In conclusion, the results shows that homeobox genes are methylated in some OSCC cell lines and tissues. Amplification of these genes is not a frequent event. HOXA9 gene has low expression in OSCC, and when overexpressed in cell lines decreases cell migration.

P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns no quadro de infecção de hospedeiros filogeneticamente distintos (plantas, mamíferos ou invertebrados). O gene kerV foi revelado numa busca por mutantes atenuados em virulência em uma biblioteca de mutantes por transposons da linhagem PA14 (Rahme et al., 1997). A caracterização da linhagem D12, mutante em kerV, confirmou sua virulência atenuada (Apidianakis et al., 2005 e An et al., 2009) e resultados do transcriptoma mostraram alteração na expressão de mais de 500 genes, sendo alguns relacionados com o sistema de \"quorum sensing\" (Rahme et al, dados não publicados). O gene kerV está próximo à montante ao gene gloB, envolvido em detoxificação de metilglioxal, e à jusante aos genes rnhA e dnaQ, que codificam proteínas envolvidas na replicação e reparo do DNA. Este trabalho teve como objetivo estudar a função molecular do produto de kerV e a expressão dos genes do lócus kerV-rnhA-dnaQ. Análises de bioinformática indicam que a proteína KerV é uma metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina (SAM), apresentando um domínio conservado de ligação a SAM e uma arquitetura de domínio compatível com a organização em fitas-beta e hélices-alfa alternadas descritas para a família das metiltransferases dependentes de SAM. Ela não apresenta outros domínios conservados que indiquem seu substrato de metilação. A expressão heteróloga desta proteína em E. coli, mostrou que ela é expressa de maneira parcialmente solúvel quando co-expressa com as chaperoninas GroEL/GroES em baixas temperaturas ou quando fusionada a MBP ou GST. A purificação desta proteína mostra que ela é co-eluída com a chaperonina GroEL sugerindo que para atingir sua conformação nativa ela necessita dessas proteínas acessórias. MBP-KerV purificado foi usado para ensaios \"in vitro\" de atividade de metiltransferase e ligação a SAM, que não foram conclusivos, pois não há certeza do seu correto estado de enovelamento. Ensaios de duplo-híbrido mostraram que KerV não interage com os produtos de rnhA e dnaQ, sugerindo que KerV não está diretamente relacionado com suas funções. A freqüência de mutação na linhagem D12 está levemente aumentada (aproximadamente quatro vezes), o que sugere que KerV não está diretamente envolvida no reparo de DNA do tipo ´mismatch repair`. Os ensaios usados para detectar metilação do DNA, proteínas e rRNAs não revelaram que KerV estaria envolvido com a metilação destes substratos. Os inícios de transcrição dos genes kerV, rnhA e dnaQ foram determinados. A deleção de kerV causa um efeito polar na transcrição do gene rnhA, que não se reflete nos níveis da proteína. A deleção também afeta a expressão de dnaQ, sugerindo que KerV seja importante para sua regulação. Os ensaios de complementação da virulência em modelos invertebrados e de células epiteliais de pulmão mostram que apenas a presença dos três genes e seus produtos em níveis normais são capazes de reverter a maioria dos fenótipos atenuados. KerV se mostrou essencial para a inibição da translocação de NF-kB para o núcleo das células, comprovando que esta proteína é relevante para a virulência de PA14, contribuindo com o silenciamento da resposta imune do hospedeiro. O conjunto dos resultados indicam uma complexa inter-relação entre a expressão dos genes kerV, rnhA e dnaQ e seu papel na biologia de P. aeruginosa. / P. aeruginosa PA14 is a burn isolate multi-host pathogen strain. The screening for virulence attenuated mutants in a PA14 transposon mutant library revealed the kerV gene (Rahme et al., 1997). The characterization of D12 strain, a kerV mutant, confirmed the attenuated virulence phenotype (Apidianakis et al., 2005 and An et al., 2009) and transcriptome analysis showed the expression of more than 500 genes are affected in D12, some of these genes are related with quorum sensing (Rahme et al, unpublished data). kerV is upstream of the gloB gene, related with methylglioxal detoxification and downstream of the rnhA and dnaQ genes, both related with DNA replication and repair. The purpose of this work was to study the molecular function of KerV product and the expression of kerV-rnhA-dnaQ locus. Bioinformatics analysis indicated that KerV is a SAM dependent methyltransferase that have a conserved SAM binding domain with architecture compatible with classic alternating &#946;-stranded and &#945;-helical regions. KerV does not show any other conserved motif that could indicate its methylation substrate. Heterologous expression in E. coli showed that KerV is partially soluble only when co-expressed with GroeL/GroES chaperones at low temperatures or when KerV is in fusion with MBP or GST tag. During the purification process KerV was copurified with GroEL chaperone suggesting that this association may be required for the correct folding of KerV. Methyltransferase activity and SAM binding assays were done with purified MBPKerV and the results were not conclusive since the proper conformation of MBP-KerV cannot be verified. Yeast two-hybrid assays indicated that RNaseH and DnaQ are not interaction partners of KerV, suggesting that their functions are not directly related. The mutation frequency of D12 strain increased only about four times in relation to PA14, suggesting that KerV is not directly involved with DNA mismatch repair. The assays to detect methylation in DNA, RNAs and proteins do not show that KerV is involved with methylation of these substrates. The transcription start sites of kerV, rnhA and dnaQ genes were mapped through 5\'-RACE- and primer extension experiments. The kerV deletion causes a polar effect on the transcription of rnhA gene, which is not reflected on RNaseH protein levels. The kerV deletion also affects dnaQ expression, suggesting that KerV is important for its regulation.The virulence complementation assays in flies and lung epithelial cells showed that the fully rescue of the wild type phenotype was achieved only when the entire locus is present. KerV was essential to inhibit the NF-kB nucleus translocation, demonstrating that KerV is relevant to PA14 virulence, contributing for the silencing of host immune system. Altogether, these data showed a complex inter-relation among kerV, rnhA and dnaQ genes and its role in P. aeruginosa biology

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos. / The invasive fungal infections incidence has increased in recent years. These infections usually presents high mortality rates. Antifungal prophylaxis remains the most common clinical strategy to decrease mortality and prevent invasive fungal infections, however, it has low efficiency and drug resistance reports. Furthermore, antifungal therapy is limited to a small group of drugs such as polyenes, azoles, and echinocandins. Thus, the search for new drug targets is imperative for the new antifungal agents development. In silico studies have indicated four genes as potential drug target in pathogenic fungi. In this context, our aim was to investigate the expression of two proteins encoded by two putative target genes, erg6 in the microsomal fraction, and trr1 in the cytosolic fraction of A. fumigatus hyphae. To achieve this goal, we first standardized all steps of cell fractionation to isolate these two fractions of A. fumigatus hyphae. Subsequently, was optimized the protein extraction and rehidratation protocols of these two subfractions, such as cytosolic proteins rehidratation. These extracts were submitted to different protocols for protein fractionation in an OFFGEL electrophoresis system (OGE). The Western immunoblot results showed that these two proteins, erg6 and trr1, are expressed in filamentous phase of A. fumigatus. The microsomal protein extract submitted to the OGE in twelve fractions, showed three erg6 protein subunits recognized by monoclonal antibody, with distincts molecular weight and pI: a subunit with approximately 79 kDa, with pI in the range of 5,91 and 6,49, and others two subunits with 35 kDa and 32 kDa, both with pI between 6,49 and 7,08. The enzyme erg6 was described as a homotetramer in other fungi, however, our results suggest that in A. fumigatus the erg6 has a heterotetrameric structure. Regarding trr1 protein, in both, total and fractionated (OGE) extracts, a single band of approximately 40 kDa, with pI in the range of 4.79 and 5.33, was recognized by the polyclonal antibody, suggesting that this protein appears to have a homodimeric structure, as described in other microorganisms.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos. / The invasive fungal infections incidence has increased in recent years. These infections usually presents high mortality rates. Antifungal prophylaxis remains the most common clinical strategy to decrease mortality and prevent invasive fungal infections, however, it has low efficiency and drug resistance reports. Furthermore, antifungal therapy is limited to a small group of drugs such as polyenes, azoles, and echinocandins. Thus, the search for new drug targets is imperative for the new antifungal agents development. In silico studies have indicated four genes as potential drug target in pathogenic fungi. In this context, our aim was to investigate the expression of two proteins encoded by two putative target genes, erg6 in the microsomal fraction, and trr1 in the cytosolic fraction of A. fumigatus hyphae. To achieve this goal, we first standardized all steps of cell fractionation to isolate these two fractions of A. fumigatus hyphae. Subsequently, was optimized the protein extraction and rehidratation protocols of these two subfractions, such as cytosolic proteins rehidratation. These extracts were submitted to different protocols for protein fractionation in an OFFGEL electrophoresis system (OGE). The Western immunoblot results showed that these two proteins, erg6 and trr1, are expressed in filamentous phase of A. fumigatus. The microsomal protein extract submitted to the OGE in twelve fractions, showed three erg6 protein subunits recognized by monoclonal antibody, with distincts molecular weight and pI: a subunit with approximately 79 kDa, with pI in the range of 5,91 and 6,49, and others two subunits with 35 kDa and 32 kDa, both with pI between 6,49 and 7,08. The enzyme erg6 was described as a homotetramer in other fungi, however, our results suggest that in A. fumigatus the erg6 has a heterotetrameric structure. Regarding trr1 protein, in both, total and fractionated (OGE) extracts, a single band of approximately 40 kDa, with pI in the range of 4.79 and 5.33, was recognized by the polyclonal antibody, suggesting that this protein appears to have a homodimeric structure, as described in other microorganisms.