Struktūrinės genomikos tyrimams reikalingi gausiai mikroorganizmuose sintetinami rekombinantiniai baltymai dažnai būna netirpūs. Tradiciniai tirpių ir teisingos struktūros baltymų gavimo metodai – sintezė žemoje temperatūroje, skirtingo stiprumo promotoriai, tirpumą didinantys priedai, netirpaus baltymo suliejimas su tirpiu baltymu ar paraleli tikslinio baltymo ir įvairių šaperonų sintezė ne visada padeda. Šios priemonės nepakeičia baltymo vidinio gebėjimo susiklostyti į tirpią ir stabilią struktūrą, ir net pavykus tokį baltymą ištirpinti pradiniuose sintezės ar gryninimo bandymuose jis gali vėl agreguotis. Galingas tirpesnių baltymų variantų kūrimo metodas yra jų evoliucija in vitro, kurios metu iš mutantinių baltymų kolekcijos tirpesni baltymų variantai atrenkami pagal prie jų prijungto reporterinio baltymo funkciją. Baltymams būdinga didžiulė struktūros ir savybių įvairovė, todėl tokiems eksperimentams yra labai svarbu parinkti tinkamomis atrankai savybės pasižymintį reporterį. Kelių ar net keliolikos alternatyvių reporterių bei su jais susijusių atrankos sistemų lygiagretus panaudojimas baltymų evoliucijos eksperimentuose padidintų sėkmės tikimybę. Šiame darbe buvo kuriama tirpesnių baltymų atrankos sistema, kaip reporterinius baltymus naudojanti DNR metiltransferazes. Realizuojant šią užduotį eksperimentiniam patikrinimui buvo pasirinktos penkios skirtingoms klasėms priklausančios DNR metiltransferazės. Įvertinus jų tirpumą bei veiklumą atitinkami genai per lanksčią... [toliau žr. visą tekstą] / Overexpressed recombinant proteins required for structural genomics are often insoluble. Conventional approaches to obtain soluble, correctly folded protein include low-temperature expression, promoters with different strengths, fusion of the protein with a more soluble partner, coexpression of folding catalyst and chaperones. These approaches do not always work, because they fail to modify the intrinsic folding stability and solubility of the protein. Even when a fraction of the protein is obtained in a soluble form during initial expression or refolding experiments, the protein may still aggregate irreversibly during subsequent workup. In vitro evolution is powerful approach to obtain more soluble protein variants. After protein evolution in vitro more soluble proteins variants from library of mutants can be detected by fusion reporter tags. There is a vast diversity of protein structures and their properties, therefore it is very important to choose for such experiments reporter with good characteristic for genetic screen. Parallel use of few or more alternative reporters in protein evolution experiments may enhance possibility to select more soluble protein variants. In this study was created selection system of more soluble proteins, in which five DNA methyltransferases from different classes were used as fusion reporters. Solubility and activity of methyltransferases was assayed and then appropriate genes of five methyltransferases were fused via flexible linker with... [to full text]

DNA cytosine-5 methyltransferases (MTases) recognize short DNA sequences and catalyze the transfer of the methyl group from the cofactor AdoMet to the C5-position of a target cytosine. In this work both these aspects of the MTase mechanism have been addressed. First, using rational protein design and directed evolution approaches the specificity of the HhaI MTase, GCGC, has been changed to GCG by functional elimination of one of the two target recognition elements. In addition, the introduced structural changes endowed the MTase with the ability to transfer extended groups from synthetic cofactor analogs, providing the first example of a dual specificity change in a DNA MTase. Second, the kinetics of fast pre-catalytic conformational transitions in the MTase and DNA has been investigated. A new method to follow the target cytosine flipping and its subsequent covalent activation has been proposed, which allows a direct real-time observation of these processes by monitoring associated UV absorbance changes in a chemically unperturbed DNA. These studies for the first time demonstrate that the flipping of the target cytosine and the closure of the catalytic loop in the enzyme occur simultaneously, whereas the covalent activation of the target cytosine and the transfer of the methyl group are temporally distinct steps in the catalytic cycle of M.HhaI. Since the new method is based on the general phenomenon of hyperchromicity, it is thus applicable for studies of other systems... [to full text] / DNR citozino-5 metiltransferazės (MTazės) atpažįsta specifines DNR sekas ir katalizuoja metilgrupės pernešimą nuo kofaktoriaus AdoMet ant taikinyje esančio citozino. Šiame darbe nagrinėjami abu MTazių veikimo mechanizmo aspektai. Baltymų inžinerijos ir kryptingos evoliucijos metodais pašalinant vienos iš dviejų taikinio atpažinimo kilpų funkciją, MTazės HhaI atpažįstamas taikinys GCGC pakeistas į GCG. Dėl įvestų struktūros pakeitimų nauja unikalaus specifiškumo MTazė efektyviai katalizuoja ne tik metilo, bet ir didesnių grupių pernešimą nuo sintetinių kofaktoriaus analogų, ir gali tapti naudingu molekulinės biologijos įrankiu. Katalitinės reakcijos metu MTazės kilpa užsidaro, apglėbdama surištą DNR, o taikinio citozinas išsukamas iš DNR spiralės ir aktyvuojamas, kovalentiškai prisijungiant katalitiniam cisteinui. Šiems greitiems prieškatalitiniams procesams tirti buvo panaudotas naujas metodas, leidžiantis realiu laiku stebėti M.HhaI sąlygotą citozino išsukimą bei kovalentinę aktyvaciją, registruojant mažus UV absorbcijos pokyčius gamtinį substratą atitinkančioje DNR. Pirmą kartą parodyta, kad M.HhaI katalizuojamoje reakcijoje citozino išsukimas ir katalitinės kilpos užsidarymas vyksta sinchroniškai, o kovalentinė citozino aktyvacija ir metilgrupės pernešimas yra kinetiškai netapačios katalitinio ciklo stadijos. Kadangi naujasis metodas remiasi fundamentine nukleorūgščių savybe – hiperchrominiu efektu, todėl jis gali būti naudojamas ir kitų DNR bazę išsukančių baltymų... [toliau žr. visą tekstą]

DNR citozino-5 metiltransferazės (MTazės) atpažįsta specifines DNR sekas ir katalizuoja metilgrupės pernešimą nuo kofaktoriaus AdoMet ant taikinyje esančio citozino. Šiame darbe nagrinėjami abu MTazių veikimo mechanizmo aspektai. Baltymų inžinerijos ir kryptingos evoliucijos metodais pašalinant vienos iš dviejų taikinio atpažinimo kilpų funkciją, MTazės HhaI atpažįstamas taikinys GCGC pakeistas į GCG. Dėl įvestų struktūros pakeitimų nauja unikalaus specifiškumo MTazė efektyviai katalizuoja ne tik metilo, bet ir didesnių grupių pernešimą nuo sintetinių kofaktoriaus analogų, ir gali tapti naudingu molekulinės biologijos įrankiu. Katalitinės reakcijos metu MTazės kilpa užsidaro, apglėbdama surištą DNR, o taikinio citozinas išsukamas iš DNR spiralės ir aktyvuojamas, kovalentiškai prisijungiant katalitiniam cisteinui. Šiems greitiems prieškatalitiniams procesams tirti buvo panaudotas naujas metodas, leidžiantis realiu laiku stebėti M.HhaI sąlygotą citozino išsukimą bei kovalentinę aktyvaciją, registruojant mažus UV absorbcijos pokyčius gamtinį substratą atitinkančioje DNR. Pirmą kartą parodyta, kad M.HhaI katalizuojamoje reakcijoje citozino išsukimas ir katalitinės kilpos užsidarymas vyksta sinchroniškai, o kovalentinė citozino aktyvacija ir metilgrupės pernešimas yra kinetiškai netapačios katalitinio ciklo stadijos. Kadangi naujasis metodas remiasi fundamentine nukleorūgščių savybe – hiperchrominiu efektu, todėl jis gali būti naudojamas ir kitų DNR bazę išsukančių baltymų... [toliau žr. visą tekstą] / DNA cytosine-5 methyltransferases (MTases) recognize short DNA sequences and catalyze the transfer of the methyl group from the cofactor AdoMet to the C5-position of a target cytosine. In this work both these aspects of the MTase mechanism have been addressed. First, using rational protein design and directed evolution approaches the specificity of the HhaI MTase, GCGC, has been changed to GCG by functional elimination of one of the two target recognition elements. In addition, the introduced structural changes endowed the MTase with the ability to transfer extended groups from synthetic cofactor analogs, providing the first example of a dual specificity change in a DNA MTase. Second, the kinetics of fast pre-catalytic conformational transitions in the MTase and DNA has been investigated. A new method to follow the target cytosine flipping and its subsequent covalent activation has been proposed, which allows a direct real-time observation of these processes by monitoring associated UV absorbance changes in a chemically unperturbed DNA. These studies for the first time demonstrate that the flipping of the target cytosine and the closure of the catalytic loop in the enzyme occur simultaneously, whereas the covalent activation of the target cytosine and the transfer of the methyl group are temporally distinct steps in the catalytic cycle of M.HhaI. Since the new method is based on the general phenomenon of hyperchromicity, it is thus applicable for studies of other systems... [to full text]