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Estudo in vitro da produção de quimiocinas e pró-colágeno I por fibroblastos de gengiva, ligamento periodontal e polpa dental humanos / In vitro study of chemokines and procollagen I by human gingival, periodontal ligament and dental pulp fibroblasts

Sipert, Carla Renata 19 August 2011 (has links)
Fibroblastos são as células mais numerosas encontradas nos tecidos orais como gengiva, ligamento periodontal e polpa dental. Além de exercerem função estrutural, estas células também desempenham papel importante na resposta imune destes tecidos através do reconhecimento de antígenos e produção de mediadores inflamatórios e citocinas. Evidências apontam ainda para o fato de que fibroblastos não constituem um grupo único de células. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram: (I) avaliar a produção diferencial de fibroblastos de gengiva, ligamento periodontal e polpa dental de dentes permanentes e decíduos quanto à produção das quimiocinas CCL3 e CXCL12; (II) avaliar a produção de pró-colágeno I pelas células de polpa e (III) avaliar a expressão diferencial dos fibroblastos quanto a microRNAs. Dentes recentemente extraídos (terceiros molares hígidos) e fragmentos de gengivas saudáveis de três pacientes adultos foram obtidos no Laboratório de Farmacologia e Fisiologia Clínica da Faculdade de Odontologia de Bauru. Caninos decíduos de dois pacientes com indicação para extração por motivos ortodônticos foram obtidos na Clínica de Odontopediatria da mesma unidade. Culturas primárias de fibroblastos de gengiva (n=3), ligamento periodontal (n=3) e polpa de dente permanente (n=3) e polpa dental de dente decíduo (n=2) foram estabelecidas a partir de tecidos humanos por meio de técnica de explant. Após a quarta passagem, a produção de CCL3 e de CXCL12 foi avaliada após estímulo com concentrações crescentes (0 10 µg/mL) de ácido lipoteicóico de Enterococcus faecalis (EfLTA), lipopolissacarídeo de Porphyromonas gingivalis (PgLPS) ou LPS de Escherichia coli (EcLPS) por ELISA após 1, 6 e 24 h. O RNAm para as quimiocinas no grupo estimulado com EcLPS por 24 h foi avaliado por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa. A produção de pró-colágeno I por células de polpa estimuladas com EfLTA e PgLPS foi avaliada por imunofluorescência. O perfil de expressão de microRNAs foi investigado por ensaio de microarranjo. A produção de CCL3 foi aumentada (p< 0,05) pelos antígenos empregados, porém de maneira mais evidente para EcLPS em células de gengiva. A quimiocina CXCL12 foi detectada em níveis basais em todos os grupos de células, porém em maiores quantidades em fibroblastos de gengiva seguidos pelos de ligamento periodontal. A adição dos antígenos diminuiu a produção de CXCL12 de maneira distinta entre células e entre antígenos (p< 0,05). Fibroblastos de polpa decídua não apresentaram qualquer alteração na produção desta quimiocina pelos antígenos (p> 0,05). No período experimental de 24 h, a expressão do RNAm para CXCL12 não foi alterada enquanto a de CCL3 não foi detectada. A produção de pró-colágeno I se mostrou aumentada (p< 0,05) na presença do desafio antigênico em células de polpa com exceção para fibroblastos de polpa permanente que apresentaram diminuição na produção desta proteína quando estimulados com EfLTA. Em condições basais, fibroblastos do mesmo doador apresentaram perfil distinto de expressão de microRNAs envolvidos com a produção das proteínas-alvo deste estudo. A expressão de imunomiRs por EcLPS também se mostrou modificada de maneira distinta entre os fibroblastos, em especial os de ligamento periodontal. Com base nestes resultados, pode-se concluir que fibroblastos de diferentes tecidos orais apresentam comportamento diferencial frente a antígenos bacterianos comumente relacionados a patologias que afetam a cavidade oral. / Fibroblasts are the dominant cells within oral tissues such as gingiva, periodontal ligament and dental pulp. Besides the architectural maintenance of the connective tissues, fibroblasts are also involved in connective tissue immune response through antigen recognition and production of inflammatory mediators and cytokines. Recent studies also demonstrated that fibroblasts do not constitute a unique group of cells. Taken this togeter, the objectives of the present study were: (I) to evaluate the production of the chemokines CCL3 and CXCL12 by human gingival, periodontal ligament as well as permanent and deciduous dental pulp fibroblasts; (II) to evaluate the production of procollagen I by dental pulp fibroblasts and (III) to evaluate the differential pattern of expression of microRNAs by the oral fibroblasts. Recently extracted teeth (non-carious third molars) and fragments of healthy gingiva from three adults were obtained at the Laboratory for Clinical Pharmacology and Physiology at Dental School of Bauru. Deciduous canines from two patients with orthodontic indication for extraction were obtained at Pediatrics Clinics of Dental School of Bauru. Primary cultures of fibroblasts from gingiva (n=3), periodontal ligament (n=3) as well as permanent pulp (n=3) and deciduous pulp (n=2) were established through an explant technique. After the fourth passage, fibroblasts were challenged with increasing concentrations (0 10 µg/mL) of Enterococcus faecalis lipoteichoic acid (EfLTA), Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (PgLPS) or Escherichia coli LPS (EcLPS) for 1, 6 and 24 h. The chemokines were assessed through ELISA while the mRNA for CCL3 and CXCL12 (EcLPS at 24 h) were assessed through reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction. The expression of microRNAs was screened through a microarray assay. The production of CCL3 on cell supernatants was detected in all cellular groups, with higher amounts at gingival fibroblasts. EcLPS induced more important chemokine differences compared to the other antigens. CXCL12 basal levels were higher for gingival fibroblasts followed by periodontal ligament ones, but also detected in dental pulp fibroblasts. The production of this chemokine was decreased by stimulation in a different fashion for each antigen and cell type. Deciduous pulp fibroblasts did not display any differences in CXCL12 synthesis even in the presence of the microbial challenge. No differences were detected at mRNA level for CXCL12, while no expression for CCL3 could be detected at 24 h. Increased production of procollagen type I was observed for dental pulp cells in general, with the only exception for permanent pulp cells which displayed decreased production of the protein with EfLTA. Microarray analysis showed differential expression pattern of microRNAs comparing unstimulated cells from the same donnor. EcLPS was able to alter immunomiRs expression in some of the cellular groups, in particular periodontal ligament fibroblasts. In conclusion, our results showed that fibroblasts from distinct oral tissues display differential behavior against bacterial antigens commonly related to the diseases that affect the oral cavity.
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Perfil circadiano da expressão de microRNAs em células progenitoras CD133+ / Circadian variation of microRNA expression profile in CD133+ progenitor cells

Marçola, Marina 28 January 2015 (has links)
Culturas de células primárias diferem de acordo com as condições ambientais nas quais se encontra o doador. Recentemente demonstramos que o ciclo claro/escuro impõe um programa molecular hereditário em cultura celular. Com o intuito de investigar os mecanismos moleculares da memória celular, no presente trabalho isolamos células progenitoras CD133+ de explante de músculo cremaster e investigamos se a expressão de microRNAs (miRNAs), resulta em fenótipos diferentes de acordo com o ciclo claro/escuro. O sequenciamento global de miRNAs utilizando a plataforma SOLiD 4 e analisado pelos programas EdgeR, TargetScan e Metacore resultou na identificação de 541 miRNAs maduros, os quais apresentam dois perfis de expressão distintos de acordo com a hora de obtenção das culturas. miR-1249 e miR-129-2-3p são mais expressos em células obtidas durante o dia e favorecem a manutenção da pluri/multipotência celular. Já células obtidas à noite expressam maior conteúdo dos miR-182, miR-96-5p, miR-223-3p, miR-146a-3p e miR-146a-5p resultando na inibição da resposta inflamatória e no favorecimento da maturação celular quando comparadas às células obtidas de dia. A análise funcional da inibição da resposta inflamatória em células obtidas à noite foi confirmada por PCR array que revelou na menor expressão de genes relacionados à via de sinalização TLR/NF-&kappa;B, incluindo Traf6, um alvo do miR-146a. Além disso, a translocação nuclear de NF-&kappa;B é reduzida à noite e é inversamente proporcional ao nível de melatonina plasmática. Demonstramos ainda que a melatonina in vitro favorece o estado de pluripotência celular por aumentar a expressão de CD133, miR-1249 e miR-129-2-3p. No entanto, esse efeito depende do contexto celular visto que a expressão de receptores de melatonina também varia de acordo com a hora de obtenção da cultura. Em conjunto, nossos dados sugerem que o ciclo claro/escuro interfere no perfil de expressão de miRNAs e impõe uma variação no fenótipo de células progenitoras CD133+ / The phenotype of primary cells in culture varies according to the donor environmental condition. We have recently shown that the light/dark cycle impose a molecular program that is hereditable in culture. In order to evaluate the molecular mechanisms of cellular memory, here we isolated CD133+ progenitor cells from cremaster muscle explants and investigated whether the expression of microRNAs (miRNAs), could result in different phenotypes according the phase of ligh/dark cycle when cells were obtained. The global miRNA sequencing using SOLiD4 Platform, and analyzed by EdgeR, TargetScan and MetaCore, revealed the expression of a total of 541 mature miRNAs, and two distinct miRNAs signatures according to the hour when cells were obtained. miR-1249 and miR-129-2-3p are more expressed during daytime and favor the maintenance of cellular pluri/multipotency. Nighttime cells express higher amounts of miR-182, miR96-5p, miR-223-3p, miR-146a-3p and miR-146a-5p that inhibit the inflammatory response and favor the cellular maturation when compared to daytime cells. The functional analysis of the inflammatory response inhibition during nighttime was confirmed by PCR array and revealed lower expression level of genes related to TLR/NF-&kappa;B pathway, including Traf6, a putative target mRNA of miR-146a. Additionally, the nuclear translocation of NF-&kappa;B is reduced in nighttime cells and it is inversely correlated to the nocturnal the plasma level of melatonin. We also showed that melatonin in vitro favors the cellular pluri/multipotency, increasing CD133, miR-1249 and miR-129-2-3p expression. However, this effect depends on cellular context, as the expression of melatonin receptors also shows a daily variation. Altogether, our data suggest that the light/dark cycle interferes on miRNAs expression profile and imposes a rhythmic phenotype variation in CD133+ cells
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Efeito da membrana de Poli(vinilideno-trifluoretileno)/titanato de bário sobre a formação óssea em defeitos criados em calvárias de ratos / Effect of Poly(vinylidene-trifluoroethylene)/Barium Titanate Membrane on Bone Formation in Rat Calvaria Defects

Lopes, Helena Bacha 27 June 2014 (has links)
Os princípios biológicos da regeneração óssea guiada (ROG) têm contribuído para o desenvolvimento de membranas que, em odontologia, são utilizadas em diversas situações como tratamentos com implantes dentários, aumento de rebordo alveolar e reparo de defeitos ósseos de origem traumática e patológica. Resultados de experimentos in vitro comparando a membrana obtida pela associação do polímero poli(fluoreto de vinilideno-trifluoretileno) e da cerâmica titanato de bário (P(VDFTrFE)/ BT) à membrana de politetrafluoretileno (PTFE) mostraram uma resposta favorável de osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos à membrana de P(VDFTrFE)/ BT. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da membrana de P(VDFTrFE)/ BT sobre a formação óssea in vivo. Foram criados defeitos ósseos com 5 mm de diâmetro em calvárias de ratos machos Wistar (peso 200-250 g), distribuídos em três grupos com relação à utilização ou não de membranas nos defeitos ósseos: (1) membrana de P(VDF-TrFE)/BT; (2) membrana de PTFE; (3) nenhum tipo de membrana. Ao final de 4 e 8 semanas os animais foram eutanasiados e as amostras foram submetidas à: (1) análise por microtomografia computadorizada (micro-CT) para avaliar volume ósseo, superfície óssea, superfície óssea específica, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, (2) análise histológica com base em cortes histológicos não descalcificados, (3) análise por reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) para avaliar a expressão gênica dos marcadores ósseos runt-related transcription factor 2 (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), osteoprotegerina (OPG) e receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) e (4) análise da expressão de microRNAs (miRs) pela técnica de sequenciamento na plataforma Illumina. Os dados das análises morfométricas e da expressão gênica foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Fischer quando apropriado, e para a análise da expressão de miRs foi utilizado o teste de Mann-Whitney para comparar a membrana de P(VDF-TrFE)/BT à de PTFE. Para todas as comparações o nível de significância adotado foi de 0,05. Os defeitos que não receberam a membrana tiveram uma formação óssea insignificante. Ambas as membranas favoreceram a formação óssea, sendo a superfície óssea maior sobre a membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE em 4 (p=0,01) e 8 (p=0,001) semanas e a separação trabecular maior sobre a membrana de PTFE comparada à de P(VDF-TrFE)/BT em 4 (p=0,05) e 8 (p=0,001) semanas. A expressão gênica de BSP (p=0,01), OC (p=0,001) e OPG (p=0,001) foi maior e de RANKL (p=0,001) foi menor sobre a membrana de P(VDFTrFE)/ BT comparada à de PTFE em 4 semanas. A expressão gênica de RUNX2 (p=0,001) e OC (p=0,05) foi maior e de ALP (p=0,05), RANKL (p=0,01) e OPG (p=0,001) foi menor sobre a membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE em 8 semanas. Quarenta e cinco e 13 miRs foram regulados positivamente (>2 vezes) em 4 semanas e 8 semanas, respectivamente, e 11 e 39 miRs foram regulados negativamente (>2 vezes) em 4 semanas e 8 semanas, respectivamente, pela membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE. Os resultados indicam que a membrana de P(VDF-TrFE)/BT favorece a formação óssea quando comparada à membrana de PTFE e, portanto, pode ser considerada um biomaterial promissor para ser utilizado em procedimentos de ROG. / Biological principles of guided bone regeneration (GBR) have contributed to development of membranes that, in dentistry, are used in several situations such as treatment with dental implants, alveolar bone augmentation and repair of traumatic and pathological bone defects. Results of in vitro experiments comparing membrane obtained by the combination of poly(vinylidene fluoride-trifluoroethylene) and barium titanate ceramics (P(VDF-TrFE)/BT) with polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane showed a favorable response of osteoblasts, fibroblasts and keratinocytes to the P(VDF-TrFE)/BT membrane. The aim of this study was to evaluate the effect of P(VDFTrFE)/ BT membrane on in vivo bone formation. Bone defects with 5 mm in diameter were created in calvaria of male Wistar rats (weight 200-250 g), distributed into three groups regarding the use or not of membranes on defects: (1) P(VDF-TrFE)/BT membrane; (2) PTFE membrane; (3) no membrane. At the end of 4 and 8 weeks, the animals were euthanized and samples were subjected to: (1) computed microtomography analysis (micro-CT) to assess bone volume, bone surface, specific bone surface, trabecular number, trabecular thickness and trabecular separation; (2) histological analysis based on non-decalcified histological sections; (3) real time polymerase chain reaction (real time PCR) to evaluate gene expression of the bone markers runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OC), osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL); (4) microRNAs (miRs) sequencing analysis at Illumina platform. Data from morphometric and gene expression analyses were submitted to the Kruskal-Wallis test followed by Fischer\'s test, when appropriate, and from miRs expression to the Mann-Whitney test to compare P(VDF-TrFE)/BT with PTFE membrane. For all comparisons, the significance level was 0.05. Defects without membrane exhibit a non significant bone formation. Both membranes favored osteogenesis with an increased bone formation on the P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE at 4 (p=0.05) and 8 weeks (p=0.001). Trabecular separation was greater on PTFE membrane compared with the P(VDF-TrFE)/BT at 4 (p=0.05) and 8 weeks (p=0.001). At 4 weeks, the gene expression of BSP (p=0.01), OC (p=0.001) and OPG (p=0.001) were higher on P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE, while RANKL (p=0.001) was lower. The gene expression of RUNX2 (p=0.001) and OC (p=0.05) were higher and ALP (p=0.05), RANKL (p=0.01) and OPG (p=0.001) were lower on the membrane of P(VDF- TrFE)/BT compared with PTFE at 8 weeks. Fortyfive and 13 miRs were up-regulated (> 2 fold) at 4 weeks and 8 weeks, respectively, and 11 and 39 miRs were negatively regulated (> 2 fold) at 4 weeks and 8 weeks, respectively, on the P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE membrane. The results indicate that the P(VDF-TrFE)/BT membrane favors bone formation compared with PTFE membrane and, therefore, may be considered a promising biomaterial for using in GBR procedures.
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Análise da expressão de microRNAs e alvos candidatos em carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço / Analysis of the expression of microRNAs and potential targets in head and neck squamous cell carcinoma

Sandoval, Flavio Trevisan Barbosa 18 March 2011 (has links)
Os microRNAs (miRNAs, miRs) são pequenos RNAs não codificadores presentes em diferentes organismos. Esses RNAs regulam a tradução de genes alvos por meio de ligação seqüência-específica a RNAs mensageiros (mRNAs). Dependendo do grau de complementaridade, podem inibir a tradução e/ou induzir a degradação desses mRNAs. No presente estudo, foi investigado por PCR em tempo real o padrão de expressão de quatro microRNAs (miR-21, -205, -342 e let-7a ) em quatro linhagens celulares derivadas de tumores da cavidade oral e da faringe (FaDu, Hep-2, SCC9 e UM-SCC-38), em queratinócitos orais normais e em amostras de tumor e margens cirúrgicas pareadas de 34 pacientes com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço (CECP). Foi também investigada a correlação da expressão dos MiRs de interesse com as características clinicopatológicas de pacientes com CECP. Nas linhagens celulares, os níveis dos miRs foram similares ou mais baixos que os de queratinócitos normais, ou os miRs não se expressaram. Somente o miR-342 mostrou níveis elevados na linhagem FaDu. Em células Hep-2 tratadas com estradiol, a expressão de miR-let-7a mostrou-se reduzida. Em tumores primários, níveis baixos de miR-let-7a foram observados em carcinomas de soalho de boca e laringe. A expressão de miR-21, -205 e -342 mostrou grande variabilidade entre as amostras e foi reduzida em um dos sítios anatômicos. Não foi observada correlação entre a expressão dos miRs e as características clinicopatológicas dos pacientes com CECP. A análise de três genes alvo candidatos (LYZ, MGLL e SPRR3) mostrou, em carcinomas de soalho de boca e laringe, associação positiva entre a expressão de miR-let-7a e de seu alvo predito MGLL, uma lipase que pode favorecer o fenótipo maligno aumentando os níveis de ácidos graxos livres e sinais lipídicos oncogênicos. O significado dessa associação não pode ser deduzida dos experimentos realizados pelo presente trabalho. / MicroRNAs (miRNAs, miRs) are small, non-coding RNAs present in different organisms. They regulate the translation of target genes through sequence specific binding to mRNA. Depending on the degree of sequence complimentary, they can inhibit translation and/or degradation of target mRNAs In the present study, we used real time PCR to investigate the expression pattern of four microRNAs (miR-21, -205, -342 e let-7a ) in four cell lines derived from tumors of oral cavity and pharinx (FaDu, Hep-2, SCC9 e UM-SCC-38), in normal oral keratinocytes and in matched tumor / surgical margin samples from 34 patients with head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). We also aimed to correlate the miR expression with the clinicopathological features in HNSCC. In cell lines, the miR levels were similar or lower than those in normal keratinocytes, or even absent. Only miR-342 showed high levels in FaDu cell line. In Hep-2 cells treated with estradiol, miR-let-7a expression was reduced. In primary tumors, low miR-let-7a levels were observed in floor of the mouth and larynx carcinomas. The expression of miR-21, -205 and -342 showed high variability between samples and was reduced in one anatomical site. No correlation was observed between miR expression and clinopathological features of head and neck cancer patients. The analysis of three potential target genes (LYZ, MGLL e SPRR3) showed, in floor of the mouth and larynx carcinomas, a positive correlation between the expression of miR-let-7a and its predicted target gene MGLL, a lipase that may support the malignant phenotype by increasing levels of free fatty acids and oncogenic lipid signals. The meaning of such association was not clear from our data.
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Expressão de AIF, PARP-1 e do microRNA-9 em modelo de isquemia cerebral experimental associada ao alcoolismo / Expression of AIF, PARP-1 and microRNA-9 in experimental model of cerebral ischemia associated to alcoholism

Abrahão, Dayana Pousa Siqueira 27 June 2016 (has links)
Objetivo: Analisar e descrever o perfil de expressão das proteínas relacionadas ao mecanismo de apoptose (PARP e AIF), e o perfil de expressão gênica sérica do microRNA-9 relacionado ao mecanismo de apoptose, em ratos submetidos à isquemia cerebral focal por oclusão da ACM por 90 minutos, seguida de reperfusão de 48horas, associado ou não com modelo de alcoolismo crônico. Métodos: Foram utilizados 20 ratos Wistar adultos, subdivididos em 4 grupos experimentais: grupo controle (C): animais submetidos apenas à anestesia; grupo isquêmico (I): animais submetidos à isquemia cerebral focal por 90 minutos seguido por reperfusão de 48 horas; grupo alcoolizado (A): animais que receberam diariamente álcool etílico absoluto diluído a 20% em água durante quatro semanas; e, grupo isquêmico e alcoolizado (IA): animais submetidos ao mesmo tratamento do grupo A e que, após quatro semanas foram submetidos à isquemia cerebral focal durante 90 minutos, seguido por reperfusão de 48 horas. As amostras do encéfalo coletadas foram processadas para a análise imunohistoquímica (para a expressão protéica de PARP-1 e AIF); e o sangue da artéria ventral da cauda foi coletado para a análise da expressão gênica do miRNA-9, relacionada ao mecanismo de apoptose, pela técnica de PCR em tempo real. Resultados: A comparação entre os grupos identificou uma redução da expressão proteica de PARP-1 nos animais do grupo AI quando comparado com os demais. Foi observada marcação positiva nuclear para a proteína AIF somente no grupo IA. Não houve diferença estatisticamente significante da expressão sérica do miRNA-9 entre os grupos. Conclusão: O modelo proposto, pode não ter sido suficiente para promover a ativação de AIF nos grupos C, A e I e desta forma, a apoptose celular por essa via analisada. A expressão proteica de PARP-1 no grupo A, associado com a expressão nula de AIF, indica um efeito neuroprotetor do etanol neste grupo. A redução da expressão proteica de PARP-1 não afetou sua atividade enzimática, proporcionando, mesmo em baixas concentrações, ativação de AIF no grupo IA. A expressão de PARP- 1 no grupo I, associada a expressão nula de AIF indica que o modelo de isquemia possivelmente gerou leves danos no DNA o que estimulou a ativação de PARP-1 somente em níveis suficientes para promover a reparação do DNA e não a ativação do processo de apoptose pela translocação de AIF. A expressão gênica sérica do miRNA- 9 observada indicou que a mesma foi suprimida quando exposta a mecanismos de estresse (alcoolismo, isquemia e a associação dos mesmos). A correlação do miRNA-9 com a expressão proteica de PARP-1 e AIF, indicou um aspecto protetor da baixa regulação do miRNA-9 tanto em animais alcoolizados como em animais isquêmicos. O grupo IA apresentou uma tendência a baixa expressão do miRNA-9, baixa expressão de PARP-1 e alta expressão de AIF, indicando que a associação álcool e isquemia tenha interferido no efeito protetor do miRNA-9 visto nos demais grupos / Aim: To analyze and describe the expression profile of proteins related to apoptosis mechanism (PARP and AIF), and profile of gene expression of miRNA-9 related to apoptosis mechanism in rats submitted to focal cerebral ischemia by occlusion of the CMA for 90 minutes, followed by 48 hours of reperfusion, associated or without associated to chronic alcoholism model. Methods: 20 adult Wistar rats were used, divided into 4 groups: control group (C): animals submitted only to anesthesia; Ischemic group (I): animals subjected to focal cerebral ischemia for 90 minutes followed by 48 hours of reperfusion; alcoholic group (A): animals that received daily solution of 20% of absolute ethyl alcohol diluted in water during four weeks; and ischemic group and alcoholized (IA): Animals subjected to the same treatment group A and after four weeks were subjected to focal cerebral ischemia for 90 minutes followed by 48 hours of reperfusion. The brain samples were collected and processed for immunohistochemical analysis (for protein expression - PARP-1 and AIF); and the blood from ventral artery of tail was collected for the analysis, by PCR in real time, of gene expression of miRNA-9 related to the mechanism of apoptosis. Results: The comparison between the groups identified a decrease in protein expression (PARP-1) in animals from IA group compared to others groups. Nuclear positive staining was observed for the AIF protein only in the IA group. There was no significant difference in serum expression of miRNA-9 between the groups. Conclusion: The proposed model may not have been sufficient to promote the activation of AIF in groups C, A and I, and thus the apoptosis analyzed in this way. Protein expression of PARP-1 in group A associated with a null expression of AIF, indicate a neuroprotective effect of ethanol in this group. The reduction of protein expression PARP-1 did not affect its enzymatic activity, providing even at low concentrations, activation AIF in IA group. The expression of PARP-1 in group I associated with null expression of AIF showed that model of ischemia, possibly, promoted light damage in DNA which stimulated PARP-1 activation just in sufficient levels to promote DNA repair, and without activation of apoptosis by translocation of AIF. The gene expression of miRNA-9 indicated that it was suppressed when exposed to mechanical stress (alcoholism, ischemia and combination thereof). The correlation of miRNA-9 with the protein expression (PARP-1 and AIF), indicated a protective aspect of downregulation of the miRNA-9 in both animals drunk as ischemic animals. IA group showed a trend to low expression of miRNA-9 and PARP- 1, in other hand an overexpression of AIF, indicating that the association between alcohol and ischemia interfered in protective effect of miRNA-9 seen in the other groups
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Πρόβλεψη microRNA γονιδίων : σχεδιασμός και ανάπτυξη ολοκληρωμένου δικτυακού εργαλείου εξαγωγής χαρακτηριστικών και ταξινόμησης με χρήση καινοτόμων τεχνικών υπολογιστικής νοημοσύνης

Κλεφτογιάννης, Δημήτριος 02 February 2012 (has links)
Η ανακάλυψη των microRNA γονιδίων το 1993 έφερε επανάσταση στα όσα γνωρίζαμε από το κεντρικό δόγμα της Βιολογίας για τη σύνθεση των πρωτεϊνών και τη ρύθμιση της πρωτεϊνικής έκφρασης. Αυτό γιατί τα microRNA γονίδια δεν κωδικοποιούν κάποια πρωτεΐνη αλλά αντί αυτού παράγουν μικρά μόρια μεγέθους περίπου 22 νουκλεοτιδιών. Τα μόρια αυτά αλληλεπιδρούν με το mRNA και συγκεκριμένα βρίσκουν στόχους στις 3 UTR περιοχές άλλων γονιδίων και αλληλεπιδρούν με βάση την αρχή της συμπληρωματικότητας Watson-Crick. Αποτέλεσμα αυτής της πρόσδεσης είναι η καταστολή της πρωτεϊνικής έκφρασης του γονιδίου στόχου μέσω αναστολής της μετάφρασης ή μέσω της υποβάθμισης του mRNA. Μετά την ανακάλυψη των microRNA και του τρόπου αλληλεπίδρασης τους ήταν φυσικό να ακολουθήσουν εκτεταμένες έρευνες για τις κυτταρικές διεργασίες τις οποίες ρυθμίζουν αλλά και σε ποιών γονίδιων τη ρύθμιση λαμβάνουν μέρος. Ως αποτέλεσμα προέκυψε ότι σε πολλές γνωστές ασθένειες παρουσιάζεται άμεση συσχέτιση με ρύθμιση από microRNA. Τέτοια περίπτωση αποτελεί και η ασθένεια του καρκίνου η οποία σε συνδυασμό με την «λεπτή» ρύθμιση που προκαλούν τα microRNA δίνει ελπίδες για νέες μοριακές θεραπείες. Αυτά είναι μερικά παραδείγματα από τα οποία μπορούμε να καταλάβουμε τη μεγάλη σημασία των microRNA και την ανάγκη για αποδοτική πρόβλεψη τους. Εξαιτίας του μικρού τους μεγέθους αλλά και του μικρού τους ποσοστού σε σχέση με το μέγεθος του γονιδιώματος (περίπου 3%) ο πειραματικός τους εντοπισμός χαρακτηρίζεται εξαιρετικά δύσκολος. Για το λόγο αυτό έχουν επιστρατευτεί αρκετές μέθοδοι Υπολογιστικής Νοημοσύνης και Αλγόριθμοι οι οποίοι μπορούν να «ξεχωρίσουν» τα πραγματικά γονίδια από τα ψεύτικα γονίδια δημιουργώντας έτσι μοντέλα πρόβλεψης. Μέχρι στιγμής έχουν χρησιμοποιηθεί σαν μέθοδοι ταξινόμησης, Support Vector Machine, δίκτυα Bayes και άλλες πιθανοτικές μέθοδοι όπως τα Hidden Markov μοντέλα .Όλες οι μέθοδοι αυτού του είδους βασίζονται στον υπολογισμό αρκετών χαρακτηριστικών για τα microRNA που σχετίζονται με το ακολουθιακό περιεχόμενο, με τη δομή τους στο χώρο αλλά και με θερμοδυναμικά στοιχεία των μορίων. Σε μεγάλο βαθμό η αποδοτικότητα πρόβλεψης βασίζεται στην επιλογή των πιο αντιπροσωπευτικών χαρακτηριστικών και στη βελτιστοποίηση των παραμέτρων της υπολογιστικής μεθόδου που χρησιμοποιείται χωρίς μέχρι τώρα να έχει βρεθεί μια αξιόπιστη λύση. Στην παρούσα διπλωματική εργασία αρχικά προτείναμε μια νέα υβριδική μεθοδολογία για ταυτόχρονη ταξινόμηση microRNA γονιδίων, εξαγωγή χαρακτηριστικών και υπολογισμό παραμέτρων. Η προτεινόμενη μεθοδολογία χρησιμοποιεί τις καινοτόμες τεχνικές του Εξελικτικού Προγραμματισμού και συγκεκριμένα τους Γενετικούς Αλγορίθμους για την εξαγωγή χαρακτηριστικών και βελτιστοποίηση παραμέτρων καθώς και Support Vector Machine για ταξινόμηση. Απώτερος στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να αναπτυχθεί μια ολοκληρωμένη διαδικτυακή πλατφόρμα η οποία επιτρέπει αρχικά υπολογισμό χαρακτηριστικών για τις γονιδιακές ακολουθίες που θα εισάγει ο χρήστης και κατά δεύτερον δίνει την πρόβλεψη του ταξινομητή για το αν είναι ή όχι microRNA γονίδια μέσω ενός φιλικού περιβάλλοντος. Επιπλέον, ενσωματώθηκαν τα περισσότερα microRNA χαρακτηριστικά που έχουν προταθεί στη βιβλιογραφία και η αποδοτικότητα πρόβλεψης του ταξινομητή βελτιώθηκε μέσω της προτεινόμενης υβριδικής μεθόδου. Ενσωματώσαμε διάφορα πακέτα για τον υπολογισμό των χαρακτηριστικών όπως το Vienna RNA Package και το UnaFold και αυτό το κομμάτι της εργασίας σχετίζεται με την έρευνα για τη θερμοδυναμική και φυσικοχημική συμπεριφορά των μικρών RNA μορίων. Καινοτόμο στοιχείο αποτελεί το γεγονός ότι ο υπολογισμός των χαρακτηριστικών γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε να ευνοείται στη συνέχεια η εφαρμογή μεθόδων Υπολογιστικής Νοημοσύνης. Επιπλέον στο σύστημα ενσωματώσαμε βάση δεδομένων η οποία αποθηκεύει τις επεξεργασμένες ακολουθίες και τα υπολογισμένα χαρακτηριστικά δίνοντας ώθηση για την κατασκευή νέων συνόλων δεδομένων. Τέλος αυτή η δυνατότητα ανάκτησης πληροφορίας κάνει το σύστημα μας μια ολοκληρωμένη πλατφόρμα μελέτης μικρών RNA μορίων και πρόβλεψης microRNA γονιδίων. / The discovery of microRNA genes in 1993 challenged the view of the Central Dogma of Biology and introduced a new layer of complexity in which RNA is not only a carrier of gene information but also a mediator of gene expression and protein synthesis. Typically, microRNA genes are short non-coding (~20-22 nt) RNAs that do not encode proteins, but instead they produce small RNA molecules. These molecules can regulate mRNA target genes by binding to the 3’ UTR of mRNA in accordance to Watson-Crick complementarity for cleavage or translational repression. MicroRNAs have been a major object of study as they have been found to be involved in some basic biological processes. These observations underline the importance of normal microRNA homeostasis on functions such as development, differentiation, apoptosis and proliferation. Dysregulation of miRNA is fundamental to the pathogenesis of many diseases and it has been long suspected that miRNA expression can be deregulated in cancer and abnormal miRNA activity may lead to tumorgenesis. From all the above, it is obvious that the better understanding of miRNA mechanism and function may lead to new and more sophisticated design of clinical therapies. Consequently, the identification of novel microRNA genes is a challenging bioinformatics problem. The experimental identification has some important drawbacks: the small size of microRNA genes in comparison to the size of the genome, cost and time, and low sensitivity. To overcome these technical problems a lot of computational methods have been proposed and several Artificial Intelligence techniques have been applied to distinguish real pre-miRNAs from pseudo hairpins. Support Vector Machines, Naïve Bayes and other probabilistic algorithms such as Hidden Markov Models have been successfully developed as classification methods. All these computational methods rely on the computation of several sequential, structural and thermodynamical microRNA features. In addition, the prediction efficiency is related to the extraction of the most discriminative features and to the optimization of the parameters. At first, this thesis presents a hybrid approach for simultaneous microRNA classification, feature extraction and parameters optimization. We took advantage of the innovative techniques of Evolutionary Programming and we introduced an embedded classification method, which combines the efficiency and robustness of Support Vector Machines with Genetic Algorithms for feature selection and parameters optimization. Secondly, objective of this thesis was the development of an online platform for effective microRNA genes prediction. The prediction model is based on our classification model and we used a significant feature subset that the proposed methodology revealed to be consistent. Also, we provided the opportunity to calculate all the microRNA features that have been proposed in the literature. We incorporated different packages such as the Vienna RNA package and UnaFold package and we introduced some new features with high discriminative power. This work is related to biophysics and thermodynamics of small RNA molecules and it can be applied to other categories of regulatory molecules. Also, the provided service in accordance to the feature calculation will encourage the application of other Artificial Intelligence Techniques in identifying microRNAs. We hope that the construction of new datasets will contribute to the Development of new Machine Learning methodologies. Furthermore, our tool maintains a Database about predicted microRNA sequences plus some informating metadata about them. Finally it can act as an integraded system and the usage of metadata enables information retrieval.
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Análise da expressão de microRNAs e alvos candidatos em carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço / Analysis of the expression of microRNAs and potential targets in head and neck squamous cell carcinoma

Flavio Trevisan Barbosa Sandoval 18 March 2011 (has links)
Os microRNAs (miRNAs, miRs) são pequenos RNAs não codificadores presentes em diferentes organismos. Esses RNAs regulam a tradução de genes alvos por meio de ligação seqüência-específica a RNAs mensageiros (mRNAs). Dependendo do grau de complementaridade, podem inibir a tradução e/ou induzir a degradação desses mRNAs. No presente estudo, foi investigado por PCR em tempo real o padrão de expressão de quatro microRNAs (miR-21, -205, -342 e let-7a ) em quatro linhagens celulares derivadas de tumores da cavidade oral e da faringe (FaDu, Hep-2, SCC9 e UM-SCC-38), em queratinócitos orais normais e em amostras de tumor e margens cirúrgicas pareadas de 34 pacientes com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço (CECP). Foi também investigada a correlação da expressão dos MiRs de interesse com as características clinicopatológicas de pacientes com CECP. Nas linhagens celulares, os níveis dos miRs foram similares ou mais baixos que os de queratinócitos normais, ou os miRs não se expressaram. Somente o miR-342 mostrou níveis elevados na linhagem FaDu. Em células Hep-2 tratadas com estradiol, a expressão de miR-let-7a mostrou-se reduzida. Em tumores primários, níveis baixos de miR-let-7a foram observados em carcinomas de soalho de boca e laringe. A expressão de miR-21, -205 e -342 mostrou grande variabilidade entre as amostras e foi reduzida em um dos sítios anatômicos. Não foi observada correlação entre a expressão dos miRs e as características clinicopatológicas dos pacientes com CECP. A análise de três genes alvo candidatos (LYZ, MGLL e SPRR3) mostrou, em carcinomas de soalho de boca e laringe, associação positiva entre a expressão de miR-let-7a e de seu alvo predito MGLL, uma lipase que pode favorecer o fenótipo maligno aumentando os níveis de ácidos graxos livres e sinais lipídicos oncogênicos. O significado dessa associação não pode ser deduzida dos experimentos realizados pelo presente trabalho. / MicroRNAs (miRNAs, miRs) are small, non-coding RNAs present in different organisms. They regulate the translation of target genes through sequence specific binding to mRNA. Depending on the degree of sequence complimentary, they can inhibit translation and/or degradation of target mRNAs In the present study, we used real time PCR to investigate the expression pattern of four microRNAs (miR-21, -205, -342 e let-7a ) in four cell lines derived from tumors of oral cavity and pharinx (FaDu, Hep-2, SCC9 e UM-SCC-38), in normal oral keratinocytes and in matched tumor / surgical margin samples from 34 patients with head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). We also aimed to correlate the miR expression with the clinicopathological features in HNSCC. In cell lines, the miR levels were similar or lower than those in normal keratinocytes, or even absent. Only miR-342 showed high levels in FaDu cell line. In Hep-2 cells treated with estradiol, miR-let-7a expression was reduced. In primary tumors, low miR-let-7a levels were observed in floor of the mouth and larynx carcinomas. The expression of miR-21, -205 and -342 showed high variability between samples and was reduced in one anatomical site. No correlation was observed between miR expression and clinopathological features of head and neck cancer patients. The analysis of three potential target genes (LYZ, MGLL e SPRR3) showed, in floor of the mouth and larynx carcinomas, a positive correlation between the expression of miR-let-7a and its predicted target gene MGLL, a lipase that may support the malignant phenotype by increasing levels of free fatty acids and oncogenic lipid signals. The meaning of such association was not clear from our data.
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Expressão de AIF, PARP-1 e do microRNA-9 em modelo de isquemia cerebral experimental associada ao alcoolismo / Expression of AIF, PARP-1 and microRNA-9 in experimental model of cerebral ischemia associated to alcoholism

Dayana Pousa Siqueira Abrahão 27 June 2016 (has links)
Objetivo: Analisar e descrever o perfil de expressão das proteínas relacionadas ao mecanismo de apoptose (PARP e AIF), e o perfil de expressão gênica sérica do microRNA-9 relacionado ao mecanismo de apoptose, em ratos submetidos à isquemia cerebral focal por oclusão da ACM por 90 minutos, seguida de reperfusão de 48horas, associado ou não com modelo de alcoolismo crônico. Métodos: Foram utilizados 20 ratos Wistar adultos, subdivididos em 4 grupos experimentais: grupo controle (C): animais submetidos apenas à anestesia; grupo isquêmico (I): animais submetidos à isquemia cerebral focal por 90 minutos seguido por reperfusão de 48 horas; grupo alcoolizado (A): animais que receberam diariamente álcool etílico absoluto diluído a 20% em água durante quatro semanas; e, grupo isquêmico e alcoolizado (IA): animais submetidos ao mesmo tratamento do grupo A e que, após quatro semanas foram submetidos à isquemia cerebral focal durante 90 minutos, seguido por reperfusão de 48 horas. As amostras do encéfalo coletadas foram processadas para a análise imunohistoquímica (para a expressão protéica de PARP-1 e AIF); e o sangue da artéria ventral da cauda foi coletado para a análise da expressão gênica do miRNA-9, relacionada ao mecanismo de apoptose, pela técnica de PCR em tempo real. Resultados: A comparação entre os grupos identificou uma redução da expressão proteica de PARP-1 nos animais do grupo AI quando comparado com os demais. Foi observada marcação positiva nuclear para a proteína AIF somente no grupo IA. Não houve diferença estatisticamente significante da expressão sérica do miRNA-9 entre os grupos. Conclusão: O modelo proposto, pode não ter sido suficiente para promover a ativação de AIF nos grupos C, A e I e desta forma, a apoptose celular por essa via analisada. A expressão proteica de PARP-1 no grupo A, associado com a expressão nula de AIF, indica um efeito neuroprotetor do etanol neste grupo. A redução da expressão proteica de PARP-1 não afetou sua atividade enzimática, proporcionando, mesmo em baixas concentrações, ativação de AIF no grupo IA. A expressão de PARP- 1 no grupo I, associada a expressão nula de AIF indica que o modelo de isquemia possivelmente gerou leves danos no DNA o que estimulou a ativação de PARP-1 somente em níveis suficientes para promover a reparação do DNA e não a ativação do processo de apoptose pela translocação de AIF. A expressão gênica sérica do miRNA- 9 observada indicou que a mesma foi suprimida quando exposta a mecanismos de estresse (alcoolismo, isquemia e a associação dos mesmos). A correlação do miRNA-9 com a expressão proteica de PARP-1 e AIF, indicou um aspecto protetor da baixa regulação do miRNA-9 tanto em animais alcoolizados como em animais isquêmicos. O grupo IA apresentou uma tendência a baixa expressão do miRNA-9, baixa expressão de PARP-1 e alta expressão de AIF, indicando que a associação álcool e isquemia tenha interferido no efeito protetor do miRNA-9 visto nos demais grupos / Aim: To analyze and describe the expression profile of proteins related to apoptosis mechanism (PARP and AIF), and profile of gene expression of miRNA-9 related to apoptosis mechanism in rats submitted to focal cerebral ischemia by occlusion of the CMA for 90 minutes, followed by 48 hours of reperfusion, associated or without associated to chronic alcoholism model. Methods: 20 adult Wistar rats were used, divided into 4 groups: control group (C): animals submitted only to anesthesia; Ischemic group (I): animals subjected to focal cerebral ischemia for 90 minutes followed by 48 hours of reperfusion; alcoholic group (A): animals that received daily solution of 20% of absolute ethyl alcohol diluted in water during four weeks; and ischemic group and alcoholized (IA): Animals subjected to the same treatment group A and after four weeks were subjected to focal cerebral ischemia for 90 minutes followed by 48 hours of reperfusion. The brain samples were collected and processed for immunohistochemical analysis (for protein expression - PARP-1 and AIF); and the blood from ventral artery of tail was collected for the analysis, by PCR in real time, of gene expression of miRNA-9 related to the mechanism of apoptosis. Results: The comparison between the groups identified a decrease in protein expression (PARP-1) in animals from IA group compared to others groups. Nuclear positive staining was observed for the AIF protein only in the IA group. There was no significant difference in serum expression of miRNA-9 between the groups. Conclusion: The proposed model may not have been sufficient to promote the activation of AIF in groups C, A and I, and thus the apoptosis analyzed in this way. Protein expression of PARP-1 in group A associated with a null expression of AIF, indicate a neuroprotective effect of ethanol in this group. The reduction of protein expression PARP-1 did not affect its enzymatic activity, providing even at low concentrations, activation AIF in IA group. The expression of PARP-1 in group I associated with null expression of AIF showed that model of ischemia, possibly, promoted light damage in DNA which stimulated PARP-1 activation just in sufficient levels to promote DNA repair, and without activation of apoptosis by translocation of AIF. The gene expression of miRNA-9 indicated that it was suppressed when exposed to mechanical stress (alcoholism, ischemia and combination thereof). The correlation of miRNA-9 with the protein expression (PARP-1 and AIF), indicated a protective aspect of downregulation of the miRNA-9 in both animals drunk as ischemic animals. IA group showed a trend to low expression of miRNA-9 and PARP- 1, in other hand an overexpression of AIF, indicating that the association between alcohol and ischemia interfered in protective effect of miRNA-9 seen in the other groups
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Perfil circadiano da expressão de microRNAs em células progenitoras CD133+ / Circadian variation of microRNA expression profile in CD133+ progenitor cells

Marina Marçola 28 January 2015 (has links)
Culturas de células primárias diferem de acordo com as condições ambientais nas quais se encontra o doador. Recentemente demonstramos que o ciclo claro/escuro impõe um programa molecular hereditário em cultura celular. Com o intuito de investigar os mecanismos moleculares da memória celular, no presente trabalho isolamos células progenitoras CD133+ de explante de músculo cremaster e investigamos se a expressão de microRNAs (miRNAs), resulta em fenótipos diferentes de acordo com o ciclo claro/escuro. O sequenciamento global de miRNAs utilizando a plataforma SOLiD 4 e analisado pelos programas EdgeR, TargetScan e Metacore resultou na identificação de 541 miRNAs maduros, os quais apresentam dois perfis de expressão distintos de acordo com a hora de obtenção das culturas. miR-1249 e miR-129-2-3p são mais expressos em células obtidas durante o dia e favorecem a manutenção da pluri/multipotência celular. Já células obtidas à noite expressam maior conteúdo dos miR-182, miR-96-5p, miR-223-3p, miR-146a-3p e miR-146a-5p resultando na inibição da resposta inflamatória e no favorecimento da maturação celular quando comparadas às células obtidas de dia. A análise funcional da inibição da resposta inflamatória em células obtidas à noite foi confirmada por PCR array que revelou na menor expressão de genes relacionados à via de sinalização TLR/NF-&kappa;B, incluindo Traf6, um alvo do miR-146a. Além disso, a translocação nuclear de NF-&kappa;B é reduzida à noite e é inversamente proporcional ao nível de melatonina plasmática. Demonstramos ainda que a melatonina in vitro favorece o estado de pluripotência celular por aumentar a expressão de CD133, miR-1249 e miR-129-2-3p. No entanto, esse efeito depende do contexto celular visto que a expressão de receptores de melatonina também varia de acordo com a hora de obtenção da cultura. Em conjunto, nossos dados sugerem que o ciclo claro/escuro interfere no perfil de expressão de miRNAs e impõe uma variação no fenótipo de células progenitoras CD133+ / The phenotype of primary cells in culture varies according to the donor environmental condition. We have recently shown that the light/dark cycle impose a molecular program that is hereditable in culture. In order to evaluate the molecular mechanisms of cellular memory, here we isolated CD133+ progenitor cells from cremaster muscle explants and investigated whether the expression of microRNAs (miRNAs), could result in different phenotypes according the phase of ligh/dark cycle when cells were obtained. The global miRNA sequencing using SOLiD4 Platform, and analyzed by EdgeR, TargetScan and MetaCore, revealed the expression of a total of 541 mature miRNAs, and two distinct miRNAs signatures according to the hour when cells were obtained. miR-1249 and miR-129-2-3p are more expressed during daytime and favor the maintenance of cellular pluri/multipotency. Nighttime cells express higher amounts of miR-182, miR96-5p, miR-223-3p, miR-146a-3p and miR-146a-5p that inhibit the inflammatory response and favor the cellular maturation when compared to daytime cells. The functional analysis of the inflammatory response inhibition during nighttime was confirmed by PCR array and revealed lower expression level of genes related to TLR/NF-&kappa;B pathway, including Traf6, a putative target mRNA of miR-146a. Additionally, the nuclear translocation of NF-&kappa;B is reduced in nighttime cells and it is inversely correlated to the nocturnal the plasma level of melatonin. We also showed that melatonin in vitro favors the cellular pluri/multipotency, increasing CD133, miR-1249 and miR-129-2-3p expression. However, this effect depends on cellular context, as the expression of melatonin receptors also shows a daily variation. Altogether, our data suggest that the light/dark cycle interferes on miRNAs expression profile and imposes a rhythmic phenotype variation in CD133+ cells
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Estudo in vitro da produção de quimiocinas e pró-colágeno I por fibroblastos de gengiva, ligamento periodontal e polpa dental humanos / In vitro study of chemokines and procollagen I by human gingival, periodontal ligament and dental pulp fibroblasts

Carla Renata Sipert 19 August 2011 (has links)
Fibroblastos são as células mais numerosas encontradas nos tecidos orais como gengiva, ligamento periodontal e polpa dental. Além de exercerem função estrutural, estas células também desempenham papel importante na resposta imune destes tecidos através do reconhecimento de antígenos e produção de mediadores inflamatórios e citocinas. Evidências apontam ainda para o fato de que fibroblastos não constituem um grupo único de células. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram: (I) avaliar a produção diferencial de fibroblastos de gengiva, ligamento periodontal e polpa dental de dentes permanentes e decíduos quanto à produção das quimiocinas CCL3 e CXCL12; (II) avaliar a produção de pró-colágeno I pelas células de polpa e (III) avaliar a expressão diferencial dos fibroblastos quanto a microRNAs. Dentes recentemente extraídos (terceiros molares hígidos) e fragmentos de gengivas saudáveis de três pacientes adultos foram obtidos no Laboratório de Farmacologia e Fisiologia Clínica da Faculdade de Odontologia de Bauru. Caninos decíduos de dois pacientes com indicação para extração por motivos ortodônticos foram obtidos na Clínica de Odontopediatria da mesma unidade. Culturas primárias de fibroblastos de gengiva (n=3), ligamento periodontal (n=3) e polpa de dente permanente (n=3) e polpa dental de dente decíduo (n=2) foram estabelecidas a partir de tecidos humanos por meio de técnica de explant. Após a quarta passagem, a produção de CCL3 e de CXCL12 foi avaliada após estímulo com concentrações crescentes (0 10 µg/mL) de ácido lipoteicóico de Enterococcus faecalis (EfLTA), lipopolissacarídeo de Porphyromonas gingivalis (PgLPS) ou LPS de Escherichia coli (EcLPS) por ELISA após 1, 6 e 24 h. O RNAm para as quimiocinas no grupo estimulado com EcLPS por 24 h foi avaliado por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa. A produção de pró-colágeno I por células de polpa estimuladas com EfLTA e PgLPS foi avaliada por imunofluorescência. O perfil de expressão de microRNAs foi investigado por ensaio de microarranjo. A produção de CCL3 foi aumentada (p< 0,05) pelos antígenos empregados, porém de maneira mais evidente para EcLPS em células de gengiva. A quimiocina CXCL12 foi detectada em níveis basais em todos os grupos de células, porém em maiores quantidades em fibroblastos de gengiva seguidos pelos de ligamento periodontal. A adição dos antígenos diminuiu a produção de CXCL12 de maneira distinta entre células e entre antígenos (p< 0,05). Fibroblastos de polpa decídua não apresentaram qualquer alteração na produção desta quimiocina pelos antígenos (p> 0,05). No período experimental de 24 h, a expressão do RNAm para CXCL12 não foi alterada enquanto a de CCL3 não foi detectada. A produção de pró-colágeno I se mostrou aumentada (p< 0,05) na presença do desafio antigênico em células de polpa com exceção para fibroblastos de polpa permanente que apresentaram diminuição na produção desta proteína quando estimulados com EfLTA. Em condições basais, fibroblastos do mesmo doador apresentaram perfil distinto de expressão de microRNAs envolvidos com a produção das proteínas-alvo deste estudo. A expressão de imunomiRs por EcLPS também se mostrou modificada de maneira distinta entre os fibroblastos, em especial os de ligamento periodontal. Com base nestes resultados, pode-se concluir que fibroblastos de diferentes tecidos orais apresentam comportamento diferencial frente a antígenos bacterianos comumente relacionados a patologias que afetam a cavidade oral. / Fibroblasts are the dominant cells within oral tissues such as gingiva, periodontal ligament and dental pulp. Besides the architectural maintenance of the connective tissues, fibroblasts are also involved in connective tissue immune response through antigen recognition and production of inflammatory mediators and cytokines. Recent studies also demonstrated that fibroblasts do not constitute a unique group of cells. Taken this togeter, the objectives of the present study were: (I) to evaluate the production of the chemokines CCL3 and CXCL12 by human gingival, periodontal ligament as well as permanent and deciduous dental pulp fibroblasts; (II) to evaluate the production of procollagen I by dental pulp fibroblasts and (III) to evaluate the differential pattern of expression of microRNAs by the oral fibroblasts. Recently extracted teeth (non-carious third molars) and fragments of healthy gingiva from three adults were obtained at the Laboratory for Clinical Pharmacology and Physiology at Dental School of Bauru. Deciduous canines from two patients with orthodontic indication for extraction were obtained at Pediatrics Clinics of Dental School of Bauru. Primary cultures of fibroblasts from gingiva (n=3), periodontal ligament (n=3) as well as permanent pulp (n=3) and deciduous pulp (n=2) were established through an explant technique. After the fourth passage, fibroblasts were challenged with increasing concentrations (0 10 µg/mL) of Enterococcus faecalis lipoteichoic acid (EfLTA), Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (PgLPS) or Escherichia coli LPS (EcLPS) for 1, 6 and 24 h. The chemokines were assessed through ELISA while the mRNA for CCL3 and CXCL12 (EcLPS at 24 h) were assessed through reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction. The expression of microRNAs was screened through a microarray assay. The production of CCL3 on cell supernatants was detected in all cellular groups, with higher amounts at gingival fibroblasts. EcLPS induced more important chemokine differences compared to the other antigens. CXCL12 basal levels were higher for gingival fibroblasts followed by periodontal ligament ones, but also detected in dental pulp fibroblasts. The production of this chemokine was decreased by stimulation in a different fashion for each antigen and cell type. Deciduous pulp fibroblasts did not display any differences in CXCL12 synthesis even in the presence of the microbial challenge. No differences were detected at mRNA level for CXCL12, while no expression for CCL3 could be detected at 24 h. Increased production of procollagen type I was observed for dental pulp cells in general, with the only exception for permanent pulp cells which displayed decreased production of the protein with EfLTA. Microarray analysis showed differential expression pattern of microRNAs comparing unstimulated cells from the same donnor. EcLPS was able to alter immunomiRs expression in some of the cellular groups, in particular periodontal ligament fibroblasts. In conclusion, our results showed that fibroblasts from distinct oral tissues display differential behavior against bacterial antigens commonly related to the diseases that affect the oral cavity.

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