Orientadora: Profa Dra Fernanda Dias da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A microplusina e um peptideo antimicrobiano (PAM), quelante de cobre e ferro, presente no carrapato bovino Riphicephalus microplus. Possui estrutura globular, arranjada em cinco ¿¿-helices e e rica em residuos de cisteina e histidina. As histidinas His-2 e His-74 estao entre os possiveis residuos de aminoacidos envolvidos na formacao do sitio de ligacao ao cobre, de acordo com dados de RMN. Seu amplo espectro de atividade contra bacterias Gram-positivas e fungos pode estar associado a sua capacidade de quelar cobre e estudos com Micrococcus luteus e Cryptococcus neoformans, mostraram que a adicao de cobre ao meio anula o seu efeito bacteriostatico e fungistatico, respectivamente. A microplusina ao ligar cobre, possivelmente, diminui a disponibilidade deste metal, o que pode afetar a atividade de enzimas dependentes de cobre. Culturas de M. luteus e C. neoformans tratadas com o peptideo apresentaram uma reducao no seu consumo de oxigenio e dados sugerem que a deplecao de cobre pode ter afetado a atividade de heme cobre oxidases pertencentes a uma das vias da cadeia transportadora de eletrons. A microplusina tambem interfere na sintese de melanina de C. neoformans, o que pode estar relacionado a uma diminuicao da atividade da lacase, uma enzima cobre dependente. Esses dados indicam o enorme potencial da microplusina como farmaco e estudos sobre quais aminoacidos de sua sequencia sao importantes para manutencao de sua estrutura e atividades tornam-se essenciais. Sendo assim, o presente projeto propos como objetivo principal avaliar o efeito da substituicao das histidinas amino-terminais His-1 e His-2 por residuos de alanina, utilizando-se para isso, a expressao recombinante de duas variantes da microplusina (MPmH1A e MPmH2A). Os resultados demonstraram o surgimento inesperado de mais de uma molecula com atividade antimicrobiana para a variante MPmH1A, indicando que mais estudos serao necessarios para avaliar a atividade destes peptideos. Por sua vez a variante MPmH2A teve sua atividade antimicrobiana mantida mesmo sem a presenca do residuo de histidina 2 (His- 2). Porem em ambas nao foi possivel detectar a atividade quelante de cobre, indicando assim que atividade antimicrobiana pode ter ocorrido por outras vias, bem como que o residuo de histidina 2 pode ser essencial para a atividade quelante de cobre. / Microplusin is an antimicrobial and chelating peptide (AMP) for both copper II and iron II, present in the cattle tick Riphicephalus microplus. Its structure is globular, with five alpha helices and rich in cysteine and histidine residues. The histidines His-2 and His-74 are the possible amino acids involved in the copper-binding site. Its broad activity spectrum against Gram-positive bacteria and fungi may be associated with its ability to chelate copper and studies with Micrococcus luteus and Cryptococcus meoformans have shown the copper addition in the media abrogate its bacteriostatic and fungistatic effect, respectively. The binding of microplusin to copper, possibly decreases the metal availability in the media, which may affect the activity of copper dependent enzymes. In fact, M. luteus and C. neoformans cultures treated with microplusin, shown a reduction in their oxygen consumption and data suggest the copper depletion may have affected the activity of heme copper oxidases, belonging to one of the transport chain of electrons.This peptide also affects the melanization of C. neoformans. The melanization reduction is related to a lacase activity decrease, a copper dependent enzyme. Microplusin activities indicate its huge potential as a promising therapeutic and studies about which amino acids in its sequence are important to its structure maintenance and activities become essential. Therefore, the main objective of this project was evaluate the effect of amino-terminal histidines His-1 e His-2 substitution for alanine residues, using, for that, a recombinant expression of two microplusin variants (MPmH1A e MPmH2A). The results showed the unexpected onset of more than one molecule with antimicrobial activity for MPmH1A variant, indicating that more studies are necessary to evaluate the activity of these peptides. In turn, the MPmH2A variant had its antimicrobial activity maintained even without the presence of histidine residue 2 (His-2). However in both has not been possible detect the chelating activity of copper, indicating that antimicrobial activity may have happened by other means well as the residue of histidine 2 can be essential for the chelating activity of copper.

Orientadora: Prof. Dra. Fernanda Dias da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A microplusina e um peptideo antimicrobiano, quelante de Cu2+ e Fe2+, isolado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Estudos com macrofagos murinos, derivados de camundongos C57BL/6, demonstraram que a microplusina induziu a producao de TNF- ¿¿ e IL-6, independente da adicao de mediadores do sistema imune como o LPS e IFN-¿Á e potencializou a atividade dos macrofagos estimulados com IFN-¿Á, aumentando a sintese de NO e TNF-¿¿, o que sugere uma possivel atividade pro-inflamatoria da microplusina. Porem, estudos adicionais eram necessarios a fim de se elucidar sua atividade imunomoduladora. Sendo assim, este projeto teve como objetivo investigar a capacidade da microplusina induzir respostas anti-inflamatorias, atraves da sintese da enzima arginase I, ou pro-inflamatorias, atraves da sintese de oxido nitrico (NO), em macrofagos J774, derivados de camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que a microplusina recombinante (25¿Êg/mL) induziu a producao de arginase I, com 6 horas de estimulo, com igual eficacia ao controle positivo estimulado pelo extrato de Bordetella parapertussis (30¿Êg/mL), porem nao foi capaz de induzir a sintese de NO, independente da dose do peptideo (5, 25 e 50 ¿Êg/mL), do tempo de estimulo da cultura (24h ou 72h) ou mesmo da adicao de IFN-¿Á (500 pg/mL), o que indica um efeito anti-inflamatorio da microplusina sobre essas celulas. Essa divergencia de resultado entre as duas linhagens pode ser devido a um perfil de respostas imune distinto entre as mesmas. Macrofagos derivados de camundongos BALB/c sao menos sensiveis ao estimulo com IFN-¿Á do que macrofagos derivados de C57BL/6, consequentemente produzindo menos NO. Por outro lado, a linhagem J774 tambem tende a produzir respostas anti-inflamatorias, como por exemplo, a arginase I, em resposta ao LPS. Os dados obtidos mostram que o efeito imunomodulador da microplusina pode variar de uma linhagem celular para outra, sendo necessarios mais estudos a fim de elucidar melhor seu potencial imunomodulador, para que futuramente possa ser estudada em modelos de infeccao. / The microplusin is an antimicrobial peptide, chelating of Cu2+ and Fe2+, isolated from the wood tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Studies with murine macrophages, extracted from C57BL/6 mouse, demonstrated that the microplusin induced the production of TNF-á and IL-6 by these cells, regardless of the addition of mediators of the immune system such as the LPS and IFN-ã, and it also enhanced the macrophages activity stimulated by IFN-ã, increasing the synthesis of NO and TNF-á, suggesting a potential post inflammatory microplusin activity. However, further studies were necessary to elucidate its immunomodulatory effect. Therefore, this project aimed to investigate the ability of microplusin to induce anti-inflammatory responses through the production of the arginase I enzyme, or proinflammatories, through the production of nitric oxide (NO) in the J774 macrophages lineage, derived from BALB/c mouse strain. The results show that recombinant microplusin (25ìg/ml) induced the production of arginase I, within 6 hours of stimulation, having equal efficacy as the positive control stimulated by the extract Bordetella parapertussis (30ìg/ml), but it was not able to induce the production of NO, independently of the peptide dosage (5, 25 e 50 ìg/mL), culture stimulus time (24h or 72h), or even adding IFN-ã (500 pg/mL), indicating a microplusin anti-inflammatory effect on these cells. This divergence of results between these two lineages might be due a distinct immune response profile among themselves. Macrophages derived from BALB/c mouse strain are less sensitive to IFN-ã stimulation than macrophages derived from C57BL/6 mouse strain, thus producing less NO. Moreover, the J774 strain also tends to produce anti-inflammatory responses, such as arginase I in response to LPS. The data show that the immunomodulating effect of microplusin may vary from one cell line to another, requiring further studies to better elucidate immunomodulating potential, so that hereafter, it can be studied in infection models.