Les copépodes sont des petits crustacés de longueur autour de 1 mm en stade adulte. Leurs réponses à différents facteurs de stress tels que la salinité et la température peuvent être observées à différentes échelles d’organisation allant du gène, cellule jusqu’à l’organisme. Jusqu'à présent, aucune observation des effets de stress de température ou de salinité sur les copépodes n’a été faite par microscopie optique. Dans ce travail, nous avons mis en œuvre pour l'étude de ces copépodes les techniques de microscopie linéaire et non linéaires. D’abord avec la technique CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) nous avons pu étudier, caractériser et quantifier les effets de stress appliqués sur le copépode calanoïde Pseudodiaptomus marinus maintenu en culture pendant plusieurs générations dans le laboratoire à des conditions favorables et stables de salinité (30 psu) et de température (18 °C). Ces différents stress appliqués sont: une forte diminution de la température (18 à 4 ° C), des diminutions mineure et majeure de la salinité (de 30 respectivement à 15 PSU et à 0 PSU) et enfin, un stress mélangé d’une baisse simultané de la température et de la salinité (de 18 ° C et 30 psu à 4 ° C et 0 PSU). Nos observations ont été concentrées sur le muscle du copépode.Cette étude a été complétée par la technique SHG/TPEF qui nous a répondu à quelques questions à propos de la disparition des stries musculaires. Cette technique a été suivie par la technique de transformation de Fourier (FFT) appliquée sur les profils des stries musculaires pour mieux comprendre l’état des stries dans chaque stress. Enfin, nous avons appliqué la microscopie CARS qui a été développée dans notre laboratoire à l'imagerie de ces échantillons. Avec cette technique d’imagerie on a pu identifier les stries musculaires et les réserves lipidiques. / Copepods are small crustaceans with length about 1mm in adult stage. Their responses to different external strain factors such as salinity and temperature can be observed at different scales from genes to organism (individual). Until now, no observation of the effects of temperature or salinity stresses on copepods has been done by light microscopy In this work we exploited optical imaging techniques and specifically nonlinear microscopy linear and nonlinear. First of all CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) allow studying, characterisation and quantifying stress effect applied on calanoid Pseudodiaptomus marinus copepod maintained during several generations in the laboratory at favorable and stable condition of salinity (30 psu) and temperature (18° C). These stresses applied were: a sharp decrease in temperature (18 to 4°C), a moderate and a major decrease in salinity (from 30 respectively to 15 psu and 0 psu), and finally a mixed stress with a decrease both in temperature and salinity (from 18°C and 30 psu to 4°C and 0 psu). Our observations are concentrated on copepod muscles regions.This study has been completed with SHG/TPEF techniques to answer some questions about stripes disappearance. This technique was followed by Fourier transformation (FFT) applied on the stripes muscles profiles to more understanding about stripes situations in each stress. Finally, we applied CARS microscopy which was developed in our laboratory to image these samples. With this technique we were able to identify these muscles stripes and also lipid reserves.

Ce travail présente le développement d'une nouvelle technique d'imagerie thermique utilisant une nanoparticule fluorescente comme capteur de température. La particule est fixée à l'extrémité d'une pointe de microscope à force atomique. En contact avec une surface ou un dispositif plus ou moins chaud, la fluorescence de la particule varie et permet de déterminer la température. La particule utilisée contient des ions de terres rares (erbium et ytterbium) dont certaines raies d'émission sont en équilibre thermique. La mesure de l'intensité relative de ces raies permet de déterminer la température absolue du matériau, et donc de la surface avec lequel il est en contact. Nous avons tout d'abord utilisé cette technique pour étudier l'échauffement de pistes résistives (aluminium et nickel) parcourues par un courant continu. Dans le cas de pistes d'aluminium, la résolution latérale thermique que nous avons obtenue est d'environ 250 nm, de l'ordre de la taille de la particule fluorescente. Nous avons ensuite utilisé cet instrument pour observer l'échauffement de pistes parcourue par un courant alternatif. Ce mode permet d'observer où sont localisées les variations de température, mais ne permet pas pour l'instant de déterminer la température absolue du dispositif. A l'aide de ce mode de fonctionnement, nous avons observé l'échauffement dans des pistes de nickel dont la largeur est de l'ordre de 200 nm. Enfin, en effectuant des courbes d'approche/retrait, nous avons aussi pu mesurer l'importance relative des différents mécanismes de transfert de chaleur entre la pointe et la surface. Dans le cas de pistes de taille submicronique, le transfert de chaleur par contact direct est de loin le plus efficace.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 octobre 2023) / Le mémoire s'inscrit dans un contexte de segmentation vasculaire en trois dimensions. Il s'intéresse à l'analyse d'angiogrammes cérébraux de souris acquis par microscopie deux photons in vivo. Le projet vise à départager automatiquement l'appartenance d'un voxel à l'architecture vasculaire cérébrale ou aux autres tissus. La littérature spécifique à la segmentation vasculaire d'angiogrammes acquis par microscopie deux-photons est émergente. Les modèles existants tentent de s'adapter aux limites physiques et biologiques de cette modalité afin d'extraire l'information vasculaire. La performance d'un modèle d'apprentissage profond récent est quantifiée. Les résultats motivent l'exploration des paramètres susceptibles de limiter la qualité et la robustesse de la segmentation. Un nouvel algorithme de segmentation est développé en intégrant la géométrie des vaisseaux sanguins au sein du processus de classification. La pertinence des métriques de segmentation est discutée dans un contexte de débalancement entre la classe vasculaire et les tissus. Le mémoire vise à fournir et comparer des outils numériques permettant de guider la segmentation automatique d'angiogrammes cérébraux acquis par microscopie deux-photons.

Les avancées technologiques concernant la microscopie ont permis la création d'une grande variété de systèmes optiques dédiés à l'investigation du comportement dynamique des cellules in vivo. En neuroscience, le dé réside dans l'observation des interactions entre des neurones marqués d'un fluorophore qui sont situés à différentes profondeurs dans le tissu. Afin d'y arriver, il est nécessaire de balayer l'échantillon sur plusieurs plans transverses pour couvrir entièrement son volume. Puisque cette procédure diminue la résolution temporelle, il a été proposé d'utiliser un axicon pour augmenter la profondeur de champ du microscope et réduire le nombre de balayages à effectuer. Cependant, l'axicon est di cile à fabriquer et possède généralement des défauts sur la pointe du cône, dégradant ainsi la qualité de la composante. En vue de remplacer l'axicon par une autre composante optique dont la fabrication n'entraîne pas de défaut, il a été envisagé d'utiliser une lentille à gradient d'indice couplée à une lentille simple (GRIN-axicon). Des simulations ont montré que le GRIN-axicon a le potentiel de produire un faisceau Bessel de bonne qualité. Toutefois, les tests expérimentaux ont été très brefs et il est nécessaire d'investiguer davantage le comportement de cette nouvelle composante en laboratoire. L'objectif de ce projet de maîtrise est donc de concevoir, fabriquer et caractériser un GRIN-axicon pour une application en microscopie multiphotonique. Comme objectif secondaire, on souhaite approfondir la théorie reliée à cette nouvelle composante. / Technological advances in microscopy have led to the creation of a wide variety of optical systems dedicated to the investigation of the dynamic behavior of cells in vivo. In neuroscience, the challenge lies in the observation of interactions between labeled neurons located at different depths in the tissue. In order to achieve this, it is necessary to scan the sample on several transverse planes to fully cover its volume. Since this procedure decreases the temporal resolution, it has been proposed to use an axicon to increase the depth of field of the microscope and reduce the number of scans to be performed. However, the axicon is di cult to manufacture and usually has defects on the tip of the cone, thus degrading the quality of the component. In order to replace the axicon by another optical component easier to manufacture, the use of a graded index lens coupled to a single lens (GRIN-axicon) was considered. Simulations have shown that the GRIN-axicon has the potential to produce a good quality Bessel beam. However, experimental tests have been very limited and it is necessary to further investigate the behaviour of this new component in the laboratory. The objective of this master's project is therefore to design, manufacture and characterize a GRIN-axicon for application in multiphoton microscopy. As a secondary objective, we wish to deepen the theory related to this new component.

Microwave hydrodiffusion and gravity (MHG) technique is an attempt towards development of green extraction, as this environment friendly technique has completely eliminated the use of organic solvents. After describing the effectiveness of microwave radiations in extraction field in the first part of this manuscript, we have optimized this noval extraction method to get antioxidants rich extract. Along with studying the temperature distributions in different parts of plant material under the effect of microwave irradiations, we have analyzed the influence of microwaves in enhancing the antioxidant activity of extracts by using different tests. We have got the promising results concerning about the antioxidant rich extracts of different onion varieties and sea buckthorn in generalization step against the conventional solvent extracts. The application of vacuum system in this extraction system helped in restraining the limitations like dry extract yield and flavonol contents. Incomparison to traditional and recent extraction systems, the MHG extracts doesn’t require any filtration and purification steps as it works in absence of any solvent and water and are highly recommended for direct application in industrial products / L'hydrodiffusion générée par micro-ondes est une nouvelle technique d'extraction mise au point au sein de l'Université d'Avignon et des Pays de Vaucluse. Ce procédé est une combinaison entre une technique traditionnelle et une technologie innovante. En effet, le chauffage par micro-ondes a permis d'initier et de générer le transfert de matière et de chaleur de l"intérieur des matrices végétales (oignons) vers l'extérieur et de réduire de façon considérable les temps d'extraction des antioxydants sans aucune intervention de solvant. A titre de comparaison, les polyphénols de différentes variétés d'oignons ont été extraits par l'hydrodiffusion générée par micro-ondes et par la technique conventionnelle, l'extraction par solvant. Les rendements obtenus par micro-ondes sont presque identiques à ceux obtenus à l'aide d’un solvant alors que les temps d'extraction sont réduits. La capacité antioxydante des extraits micro-ondes est supérieure à celle obtenue par technique conventionelle. Ce qui présage des potentialités d'application dans le domaine agroalimentaire en particulier pour la valorisation des co-produits. Une étude cinétique de l'extraction, ainsi qu'une observation au microscope optique(cytologie) des matrices traitées soumises aux micro-ondes et au solvant ont mis en évidence la spécificité de l'extraction sans solvant assistée par micro-ondes au niveau des mécanismes de libération et d'extraction des molécules antioxydantes au sein du végétal. L'effet des micro-ondes a pour conséquence une libération plus rapide des principes actifs contenue dans la plante grâce à l'ouverture quasi instantanée des glandes et l'explosion des cellules. L'explication de la différence de composition chimique entre les procédés d'extraction par solvant et par micro-ondes pourrait être basée principalement sur des phénomènes de solubilité, de polarisation diélectrique ainsi qu'un transfert de matière et de chaleur inversé

Dans cette thèse, nous proposons un modèle complet de la formation de l'image, qui s'applique à des objets microscopiques 3D translucides.Dans notre modèle, un objet translucide est défini comme une répartition discrète d'indices de réfraction et de coefficients d'absorption. Pour simuler le trajet de la lumière, nous proposons un modèle physique utilisant des techniques de lancer de rayons de la source vers l'observateur. Ce modèle physique sert à calculer l'espace objet éclairé. Pour simuler la génération d'images par le système optique, nous utilisons des principes d'optique ondulatoire. Nous modélisons la fonction de transfert 3D du microscope, qui dépend de la défocalisation. Après avoir choisi un plan de focalisation, nous calculons une image simulée en appliquant cette fonction de transfert à chaque plan plus ou moins défocalisé de l'espace objet éclairé. Une séquence d'images simulées est obtenue en faisant varier la focalisation.

La technique de microscopie SEEC (Surface Enhanced Ellipsometric Contrast) permet l'observation directe de couches moléculaires. Notre objectif global est d'exploiter cette possibilité pour étudier la structure d'équilibre de domaines amphiphiles d'épaisseur nanométrique et d'étendue finie (quelques microns) déposés sur une surface solide. Ces domaines subissent une pression de Laplace importante, qui dépend de leur rayon R comme 1/R. Cette pression agit sur ces systèmes 2D comme une contrainte externe qu'on peut moduler en faisant varier la taille des domaines. La mesure de leur épaisseur en fonction de leur taille est donc une façon d'explorer les isothermes de ces systèmes, ce qui est le pendant pour des systèmes supportés des études effectuées au moyen d'une cuve de Langmuir sur les monocouches à la surface de l'eau. Idéalement, ces domaines se réduisent à une simple monoou bicouche. En pratique, ils adoptent souvent la forme de ziggourats constitués de plusieurs étages (gouttes terrassées). Le travail présenté dans cette thèse est une première étape dans la démarche évoquée ci-dessus. Il a permis de mettre en évidence pour la première fois les effets de la tension de Laplace sur la structure de domaines bicouches. L'étude est réalisée à l'aide de molécules amphiphiles de natures très différentes : 1) des copolymères à blocs symétriques, 2) des phospholipides. Elle exige la maîtrise du dépôt, de l'environnement et de l'évolution de nano-gouttes smectiques sur une surface, et le développement d'outils d'analyse adaptés. Elle implique principalement deux techniques : la Microscopie à Force Atomique (AFM) et la microscopie optique en contraste SEEC.

L'utilisation des nanolabels avec une émission forte et cohérente constitue un développement prometteur de la microscopie de génération de second harmonique (GSH). Dans ce travail de thèse, nous proposons pour la première fois les études de KTiOPO4 (KTP), un matériau non-linéaire bien connu, sous microscopie de GSH à l'échelle de nanoparticule unique. Ce nanosource de lumière peut trouver de nombreuses applications, par exemple comme sonde active de microscopie en champ proche, ou comme marqueur pour la biologie. Nottre approche est générique et peut être appliquée pour d'autre type de nanocristaux pour la microscopie cohérente.

La synchronisation des cellules est importante pour l'analyse des processus moléculaires impliqués dans l'étalement et la motilité. Les interactions électrostatiques entre les cellules et les surfaces ont été étudiées dans le but de synchroniser la première étape de l'adhésion cellulaire. Les cellules Dictyostelium discoideum marquées avec LimE-GFP ont été utilisées pour le suivi en fluorescence des événements de polymérisation de l'actine. Des pics de fluorescence ont été observés pour les cellules individuelles pendant l'étalement en tampon phosphate. Dans une solution de concentration faible (0.17 mM tampon phosphate sucrose) les cellules lévitent au dessous des surfaces conductrices (Indium Tin Oxide, ITO), à cause de la répulsion électrostatique. Un dispositif électrochimique a été construit dans le but d'appliquer un pulse électrique (+2.5 V/Ag,AgCl) sur une surface de ITO pendant 0,1 secondes. Dans ces conditions, l'oxydation de l'eau produit des protons qui réduisent la charge de surface négative de l'ITO et ainsi, les cellules sont attirées simultanément. Ces contacts irréversibles avec la surface déclenchent l'étalement cellulaire. Pour 37 parmi les 47 cellules étudiées (80%), apparaissent des pics de fluorescences successives plus au moins réguliers en temps, montrant une activité de polymérisation de l'actine oscillante. Remarquablement, aucun pic de fluorescence n'apparaît dans les 7 premières secondes d'après l'application du pulse. De plus, 29 des cellules parmi les 37 ont eu le premier pic dans un intervalle de 4 secondes, entre 7,5 et 11,5 secondes après le pulse. Ainsi, nous avons obtenu, pour la première fois, la synchronisation de l'étalement cellulaire d'un groupe de cellules grâce à une méthode électrochimique.

Nous présentons une étude expérimentale de la dynamique des structures de solidification directionnelle eutectiques fibreuses non-facettées en échantillons semi-massifs. L'alliage transparent utilisé est le succinonitrile-camphre droit. Nous utilisons un dispositif optique original d'observation en vue oblique, qui permet de suivre en temps réel l'ensemble de la structure avec une résolution micronique. La symétrie de base de la structure fibreuse est hexagonale. Nous montrons qu'une courbure résiduelle des isothermes, provoquant un étirement continuel de la structure, conduit à un régime permanent au voisinage du seuil supérieur de stabilité (instabilité de branchement). Les branchements sont alors une source continuelle de défauts. Nous montrons aussi que le seuil inférieur de stabilité (élimination de fibres) coïncide avec le seuil de l'instabilité d'Eckhaus mesuré en échantillons minces. Nous avons étudié d'autres instabilités de la structure fibreuse (oscillation, ovalisation).