Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte. Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%). In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys. Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren. Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte. Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war. Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen. Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen. Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei. Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.:Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VIII Abkürzungsverzeichnis XI 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Theoretische Grundlagen 3 2.1 Lysozym 3 2.1.1 Wirkmechanismen des Lysozyms 4 2.1.2 Anwendungsmöglichkeiten von Lysozym 7 2.1.3 Modifizierung des Lysozyms 8 2.1.3.1 Fibrillen und amyloide Strukturen von HEWL 9 2.1.3.2 Neue biologische Funktionen durch Konformationsänderung 13 2.1.4 Evolutionäre Entwicklung und Verwandtschaft zu α-Lactalbumin 14 2.2 Die enzymatische Vernetzung 15 2.2.1 Mikrobielle Transglutaminase 15 2.2.1.1 TGase katalysierte Reaktionen und Reaktionsmechanismus 17 2.2.1.2 Analytische Aspekte 19 2.2.1.3 Einsatz in der Lebensmittelindustrie 19 2.3 Nicht-enzymatische Vernetzung 21 2.3.1 Thermisch induzierte Vernetzung 21 2.3.2 In-Vacuo Zero-Length Cross-Linking 23 2.3.3 Anwendungsmöglichkeiten nicht-enzymatisch vernetzter Proteine 23 2.4 Wirkung hoher hydrostatischer Drücke auf Proteine 24 2.4.1 Wirkung von Hochdruck auf Hühnereiweiß-Lysozym 26 2.4.2 Wirkung von Hochdruck auf die mikrobielle Transglutaminase 27 3 Experimenteller Teil 29 3.1 Chemikalien, Materialien, Geräte und Software 29 3.1.1 Chemikalien 29 3.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 31 3.1.3 Untersuchungsmaterialien 33 3.1.4 Software 33 3.2 Erzeugung modifizierter Proteine 34 3.2.1 Enzymatische Vernetzung von Proteinen 34 3.2.1.1 Erzeugung von Protein-Oligomeren unter Hochdruck 34 3.2.1.2 Reinigung mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) 35 3.2.1.3 Konzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung 35 3.2.2 Thermisches und Vakuum-induziertes Zero-length Cross-linking 36 3.3 Erzeugung von HEWL-Fibrillen 38 3.4 Isolierung von α-Lactalbumin 38 3.5 Dialyse der Proteinlösungen 39 3.6 Aktivität der Transglutaminase 39 3.7 Analytische Verfahren zur Strukturuntersuchung und Charakterisierung der Proteinproben 41 3.7.1 Restwasserbestimmung mittels Karl-Fischer-Titration 41 3.7.2 Proteinbestimmung mittels Lowry 42 3.7.3 Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 44 3.7.4 Aminosäureanalytik (ASA) 47 3.7.4.1 Saure Hydrolyse 49 3.7.4.2 Enzymatische Hydrolyse 49 3.7.5 Hochdruckflüssigchromatographie mit anschließender Massenspektroskopie (RP-HPLC/ESI-TOF-MS) 51 3.7.5.1 Probenvorbereitung - Tryptischer Verdau 51 3.7.5.2 RP-HPLC/ESI-TOF-MS-Messung 51 3.7.6 Aktivitätsbestimmung für HEWL und HEWL-haltige Proben 52 3.7.6.1 Klassische Methode - Trübungsassay 52 3.7.6.2 Modifizierte Methode der Aktivitätsermittlung mit Blue-ML 53 3.7.7 Methode zur Oberflächenhydrophobitätsermittlung 54 3.7.8 Bestimmung der Sekundär- und Tertiärstruktur mittels Zirkulardichroismus Spektroskopie (CD-Spektroskopie) 56 3.7.9 Charakterisierung der HEWL-Fibrillen 57 3.7.9.1 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure-Assay (ANS-Assay) 57 3.7.9.2 Kongorot-Assay 58 3.7.9.3 Thioflavin-T-Assay 59 3.7.9.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 61 3.7.10 Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit 62 3.7.10.1 Agardiffusionstest 62 3.7.10.2 Bakterieller Hemmtest 63 4 Ergebnisse und Diskussion 64 4.1 Enzymatische Vernetzung von HEWL mittels mTGase und Einfluss verschiedener Reaktionsparameter 64 4.1.1 Geeignete Puffersysteme und pH-Werte 67 4.1.2 Einfluss variierender Inkubationsdauer und unterschiedlicher Drücke 68 4.1.3 Einfluss der Lysozymkonzentration 70 4.1.4 Einfluss der mTGase-Aktivität 71 4.1.5 Temperatur 73 4.1.6 Optimierte Parameter für den höchstmöglichen Vernetzungsgrad 74 4.2 Analytik der Isopeptide 76 4.2.1 Identifizierung des N-ε-(γ-L-Glutamyl)-L-Lysin-Isopeptids (Glu_Lys) 76 4.2.2 Beurteilung einer intra- und intermolekularen Vernetzung 79 4.2.3 Lokalisierung der reaktiven Lysin- und Glutaminreste mittels HPLC/MS 80 4.2.4 Strukturvorschlag 88 4.3 Isolierung und Konzentrierung enzymatisch vernetzter Lysozym-Oligomere 89 4.3.1 Ammoniumsulfatfällung 89 4.3.2 Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie 91 4.4 Funktionelle Charakterisierung der LMW-, MMW- und HMW-Proben des HEWL 96 4.4.1 Vergleichende Untersuchungen der verbleibenden Enzymaktivität 97 4.4.2 Beurteilung der Oberflächenhydrophobität 100 4.4.3 Veränderung der Sekundär- und Tertiärstruktur 104 4.4.4 Fibrillbildung und -eigenschaften von HEWL 109 4.4.4.1 Etablierung der Charakterisierungmethoden für HEWL-Fibrillen 110 4.4.4.2 Fibrillinduktion an HEWL-Präparaten ausgewählter Vernetzungsgrade 118 4.4.5 Antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen 126 4.5 Vergleichende Untersuchungen an dem strukturanalogen Protein α-Lactalbumin 137 4.6 Orientierende Untersuchungen zur nicht-enzymatischen In-Vakuo-Thermo-Vernetzung von HEWL und ausgesuchten Proteinen 142 4.6.1 Einfluss verschiedener Reaktionsparameter auf die Vernetzung von HEWL 143 4.6.2 Identifizierung der gebildeten Isopeptide 145 4.6.3 Vergleich der nicht-enzymatischen und enzymatischen Vernetzung von HEWL 146 4.6.4 Vergleich der In-Vakuo-Thermo-Vernetzung an HEWL mit β-Casein und erste Untersuchungen an einem Molkenproteinisolat 149 4.7 Fazit der Untersuchungen zur enzymatischen und der nicht-enzymatischen Vernetzung verschiedener Proteine 152 5 Zusammenfassung 154 6 Literaturverzeichnis 157 Veröffentlichungen 172 Danksagung 173 Versicherung 174

Microbial and chemical processes in the sediment of standing waters have a big influence on the release of nutrients and the trophic state. Due to the strong interactions between sediment and water body and the storage of materials sediments can be consulted as an important additional source of information for the evaluation of the trophic state and for the estimation of future trophic developments. Because of relatively small fluctuations the parameters in the sediment and pore water are well suitable for a trophic validation. Sediments and pore water of four reservoirs with different trophic characteristics were sampled in regular intervals (Neunzehnhain I - oligotrophic; Muldenberg - oligotrophic, dystrophic; Saidenbach - mesotroph; Quitzdorf - polytrophic). Many chemical and microbial parameters were examined regarding the trophic dependancy and the possibility for including these parameters into a trophic evaluation system. The concentrations of SRP, ammonium, and alkalinity in the pore water and the metal:phosphorus-quotient (Al:P, Fe:P) in the dry sediment showed the biggest trophic dependancy, so that these parameters are applicable for a sediment referred trophic assessment of standing waters. The polytrophic reservoir Quitzdorf has exhibited an extreme abundance of the cyanobacterium Microcystis for years. Investigations of the water body showed that apart from parameters like the water temperature the mass growth of Microcystis in the reservoir is obviously very strongly affected by the nitrogen:phosphorus-quotients in the water body. In laboratory experiments with sediments of this reservoir the phosphorus release from the sediment could be significantly lowered by the addition of aluminum and a part of the phosphorus could be shifted from the reductively soluble iron bound phosphorus fraction into the stable aluminum bound phosphorus fraction. / Die chemischen und mikrobiellen Prozesse im Sediment von Standgewässern haben großen Einfluss auf die Freisetzung von Nährstoffen und die Trophie. Aufgrund der starken Wechselwirkungen zwischen Sediment und Wasserkörper und der Speicherung von Stoffen in den Sedimenten können Gewässersedimente als wichtige zusätzliche Informationsquelle für die Bewertung des Trophiezustandes und zur Abschätzung zukünftiger trophischer Entwicklungen herangezogen werden. Durch relativ geringe Schwankungen sind die Parameter im Sediment und Porenwasser gut für eine Trophieeinschätzung geeignet. Die Sedimente und das Porenwasser von vier Talsperren mit unterschiedlichen trophischen Eigenschaften wurden in regelmäßigen Abständen beprobt (Neunzehnhain I ? oligotroph; Muldenberg ? oligotroph, dystroph; Saidenbach ? mesotroph; Quitzdorf ? polytroph). Es wurden viele chemische und mikrobielle Parameter im Sediment und Porenwasser im Hinblick auf die Trophieabhängigkeit und eine mögliche Einbeziehbarkeit in ein trophisches Bewertungssystem untersucht. Die größte trophische Abhängigkeit konnte bei den Konzentrationen von SRP, Ammonium, und Alkalinität im Porenwasser und den Metall:Phosphor-Quotienten (Al:P, Fe:P) im Trockensediment gefunden werden, sodass diese Parameter gut für eine sedimentbezogene Trophiebewertung von stehenden Gewässern geeignet sind. Die polytrophe Talsperre Quitzdorf weist seit Jahren ein extremes Massenwachstum des Cyanobakteriums Microcystis auf. Untersuchungen des Wasserkörpers haben gezeigt, dass das Microcystis-Massenaufkommen in der Talsperre neben Parametern wie der Wassertemperatur offensichtlich sehr stark von den Stickstoff:Phosphor-Quotienten im Wasserkörper beeinflusst wird. Laborversuche mit Sedimenten dieser Talsperre haben ergeben, dass die P-Freisetzung aus dem Sediment durch die Zugabe von Aluminium signifikant herabgesetzt werden und ein Teil des Phosphors von der reduktiv löslichen eisengebundenen P-Fraktion in die stabile aluminiumgebundene P-Fraktion verlagert werden konnte.

Das Ziel der Arbeit war die Untersuchung der Kohlenstoff- und Stickstoffdynamik in Waldböden unter dem Einfluß atmogener Stickstoffeinträge. Dabei wurden biotische und abiotische Schlüsselprozesse zweier unterschiedlich stark stickstoffbelasteter Waldböden des Nordwest- und Nordostdeutschen Tieflandes (Kreinitz und Thülsfeld) analysiert und miteinander verglichen. Um detaillierte Informationen über potentielle Kohlenstoff- und Stickstoffumsätze zu erhalten, wurden die untersuchten Böden sowohl horizont- als auch tiefenstufenbezogen stratifiziert. Über einen Zeitraum von 14 Wochen wurden sämtliche Kohlenstoff- und Stickstoffeinträge sowie -austräge zwischen den einzelnen Tiefenstufen beobachtet und analysiert. Nach Beendigung der Versuche wurden die einzelnen Bodenhorizonte mit spezifischen Kohlenstoff- und Stickstoffextraktionsverfahren aufgeschlossen. Mit Hilfe dieser Versuchsanordnung war es möglich, eine vollständige tiefenstufenbezogene Kohlenstoff- und Stickstoffbilanzierung für den Kreinitzer und Thülsfelder Boden zu erstellen. Zur Prüfung der Übertragbarkeit der Laborergebnisse auf aktuelle Standortbedingungen wurde ein Langzeitfeldversuch (ein Jahr) mit einer ähnlichen Versuchsanordnung am Standort Kreinitz durchgeführt. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erzielt: 1. Der TOC-Gehalt war der Hauptparameter, in dem sich der stark stickstoffbelastete Standort Thülsfeld von dem weniger stark stickstoffbelasteten Standort Kreinitz zu Beginn der Untersuchung deutlich unterschied. 2. Der KCl-extrahierbare mineralische Stickstoff (NminKCl) reagierte an beiden Versuchs-standorten am stärksten auf die Stickstoffdüngung und wurde mit Hilfe der Diskriminanzanalyse als Hauptsensitivitätsparameter für Stickstoffeinträge im Boden ermittelt. 3. Die Kreinitzer organische Auflage reagierte in bezug auf die mittelfristig umsetzbare Kohlenstoff- und Stickstofffraktion (Chwe, Nhwe) deutlich stärker auf die N-Einträge als die Thülsfelder Auflage. Infolgedessen besitzt die Kreinitzer Auflage ein höheres Kohlenstoff- und Stickstoffmobilisierungspotential, die hochkomplexen organischen C- und N-Verbindungen in weniger komplexe Verbindungen abzubauen. 4. Der Thülsfelder Mineralboden 5. besitzt aufgrund der höheren Anteile des Nhwe am TN ein höheres Mobilisierungspotential für den kurz- und mittelfristig umsetzbaren Stickstoff (Nhwe) als der Kreinitzer Mineralboden. 6. Die für die Mikroorganismen verfügbaren Kohlenstoffquellen scheinen sich durch die historischen und die zusätzlich simulierten Stickstoffeinträge vom POC in der Sand-Braunerde zum WSOC und CKCl im Sand-Podsol zu verschieben. 7. Als verfügbare Stickstoffquelle nutzen die Mikroorganismen am Standort Kreinitz den PN, während sich für den Standort Thülsfeld keine eindeutige Stickstofffraktion als Hauptnahrungsquelle ermitteln ließ. 8. Sowohl in den Laborversuchen als auch im Freilandversuch führten die Stickstoffeinträge zur Verengung nahezu aller C/N-Verhältnisse in den untersuchten Extraktionsverfahren.

Mikrobielle Prozesse spielen eine wichtige Rolle im Sediment von Talsperren und Seen. Demgegenüber stehen nur unzureichende Erkenntnisse über die Zusammensetzung mikrobieller Biozönosen in Sedimenten sowie deren Aktivität zur Verfügung. Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung und der Vergleich der Zusammensetzung und der Struktur mikrobieller Gemeinschaften in Sedimenten um eine Abschätzung der mikrobiellen Diversität in Talsperrensedimenten unterschiedlicher Trophie zu erreichen. Durch die Kombination der in dieser Arbeit verwendeten Methoden (Vergleichende 16S rDNA Analyse, Fingerprinttechniken, klassische Methoden) konnte eine Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung der obersten 5 cm von den Talsperrensedimenten Neunzehnhain, Muldenberg, Quitzdorf und Saidenbach erzielt werden. Die vergleichende 16S rDNA Analyse offenbarte in 2541 analysierten rekombinanten Klonen 528 verschiedene Sequenztypen, welche zu 293 OTUs zusammengefaßt werden konnten. Obwohl die Gemeinschaften der verschiedenen Talsperren nur schwach auf der Ebene der phylogenetischen Gruppen differierten, konnte durch die Verwendung von Ähnlichkeitsindices gezeigt werden, dass jede Talsperre eine spezifische mikrobielle Sedimentgemeinschaft aufweist. Über 60% aller Klone zeigten Ähnlichkeiten von mehr als 97% zu 16S rDNA-Sequenzen kultivierter Organismen oder phylogenetisch eingeordneten Sequenzen (14 bekannte phylogenetische Gruppen). Alle anderen Klone zeigten hohe Sequenzhomologien zu unidentifizierten, phylogenetisch bisher nicht eingeordneten Bakterien. Diese Bakterien waren mit Anteilen zwischen 19,8% (Muldenberg) und 54,6% (Saidenbach) in den 16S rDNA Bibliotheken repräsentiert. Mittels Fingerprinttechniken (DGGE, T-RFLP, ARISA) konnten komplexe Muster der mikrobiellen Diversität erzeugt werden. Dabei konnten die Ergebnisse der 16S rDNA Analyse bestätigt werden. Durch die verwendeten Methoden konnte eine komplexe mikrobielle Diversität in den Sedimenten aufgedeckt werden und die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die mikrobielle Diversität in Sedimenten wesentlich höher ist als bisher angenommen.

To investigate the influence of the internal micellar structure on the course of enzymatic cross-linking especially in the initial phase of the reaction, casein micelles isolated from raw milk via ultracentrifugation were incubated with microbial transglutaminase (mTG) in comparison with non-micellar sodium caseinate. Reactive lysine and glutamine residues were identified using a label-free approach, based on the identification of isopeptides within tryptic hydrolysates by targeted HRMS as well as manual monitoring of fragmentation spectra. Identified reactive sites were furthermore weighted by tracking the formation of isopeptides over an incubation time of 15, 30, 45 and 60 min, respectively. Fifteen isopeptides formed in the early stage of mTG cross-linking of caseins were identified and further specified concerning the position of lysine and glutamine residues involved in the reaction. The results revealed lysine K176 and glutamine Q175 of β-casein as the most reactive residues, which might be located in a highly flexible region of the molecule based on different possible reaction partners identified in this study. Except for the isopeptide αₛ₁ K34–αₛ₂ Q101 in sodium caseinate (SC), all reactive sites were detected in micellar and in non-micellar casein, indicating that the initial phase of enzymatic cross-linking is not affected by micellar aggregation of caseins.

Different aspects of interaction of metals other than iron with metallophore mixtures were elucidated. Metal chelation besides iron and greater than with pure desferrioxamine B is documented by enhanced performance of soil mineral dissolution following application of diverse metallophore mixtures. New insights from genome to product of metallophores from Gordonia rubripertincta CWB2 under different cultivation conditions and under metal stress, particularly induced by rare earth elements are given. This evaluation led to increase by a factor of 13. Structure analyses showed that the strain produces citrate and different desferrioxamines. A robust RP-HPLC-based method quantified metal complexation. Further metal immobilization methods for metallophores for metal extraction from solutions with low concentrations were established. Moreover, catechol and hydroxamate metallophores from Arthrobacter oxydans ATW2 and Kocuria rosea ATW4 demonstrate the enhancement of Ge and rare earth element bioavailability, plant growth promotion and phytoextraction potential.:CONTENTS Abstract ..........................................................................................................1 CHAPTER 1 Introduction ......................................................................................5 CHAPTER 2 Mobilization of trace elements in soil extracts by bacterial siderophores in dependence of the pH-value..................................31 CHAPTER 3 Cultivation dependent formation of siderophores by Gordonia rubripertincta CWB2........................................................................41 CHAPTER 4 Data on metal-chelating, -immobilization and biosorption properties by Gordonia rubripertincta CWB2 in dependency on rare earth adaptation.......................................................................................67 CHAPTER 5 Analysis of desferrioxamine-like siderophores and their capability to selectively bind metals and metalloids: development of a robust analytical RP-HPLC method. ..........................................................97 CHAPTER 6 Secondary metabolites released by the rhizosphere bacteria Arthrobacter oxydans and Kocuria rosea enhance plant availability and soil–plant transfer of germanium (Ge) and rare earth elements (REEs) .........................................................................................120 CHAPTER 7 Conclusion remarks and further perspectives ...............................154 References .......................................................................................................162 Acknowledgement .........................................................................................185 Curriculum Vitae ..........................................................................................187 List of publications ..........................................................................................189 List of oral and poster presentations ..........................................................190 List of proceedings ..........................................................................................191 / En este trabajo se han dilucidado diferentes aspectos de la interacción de los metales con las mezclas de metalóforos desde distintos ángulos. La quelación de metales por debajo del hierro se pone de manifiesto en la mejora del rendimiento de la disolución de los minerales del suelo debido a la aplicación de diversas mezclas de metanóforos en comparación con la deferoxamina B pura. Se ofrecen nuevos conocimientos desde el genoma hasta el producto de los metanóforos de Gordonia rubripertincta CWB2 en diferentes condiciones de cultivo y bajo estrés por metales, especialmente inducido por elementos de tierras raras. Esta evaluación condujo a una sobreproducción de un factor de 13. El análisis estructural muestra que la cepa produce citrato y diferentes desferrioxaminas. Un método robusto basado en RP-HPLC cuantificó la complejación de metales. Se establecieron otros métodos de inmovilización de metales para la extracción de metales a partir de soluciones poco concentradas. Además, los metalóforos de catecol e hidroxamato de Arthrobacter oxydans ATW2 y Kocuria rosea ATW4 demuestran la mejora de la biodisponibilidad de GE y REE, la promoción del crecimiento vegetal y el potencial de fitoextracción.:CONTENTS Abstract ..........................................................................................................1 CHAPTER 1 Introduction ......................................................................................5 CHAPTER 2 Mobilization of trace elements in soil extracts by bacterial siderophores in dependence of the pH-value..................................31 CHAPTER 3 Cultivation dependent formation of siderophores by Gordonia rubripertincta CWB2........................................................................41 CHAPTER 4 Data on metal-chelating, -immobilization and biosorption properties by Gordonia rubripertincta CWB2 in dependency on rare earth adaptation.......................................................................................67 CHAPTER 5 Analysis of desferrioxamine-like siderophores and their capability to selectively bind metals and metalloids: development of a robust analytical RP-HPLC method. ..........................................................97 CHAPTER 6 Secondary metabolites released by the rhizosphere bacteria Arthrobacter oxydans and Kocuria rosea enhance plant availability and soil–plant transfer of germanium (Ge) and rare earth elements (REEs) .........................................................................................120 CHAPTER 7 Conclusion remarks and further perspectives ...............................154 References .......................................................................................................162 Acknowledgement .........................................................................................185 Curriculum Vitae ..........................................................................................187 List of publications ..........................................................................................189 List of oral and poster presentations ..........................................................190 List of proceedings ..........................................................................................191 / Es wurden verschiedene Aspekte der Wechselwirkung von anderen Metallen als Eisen mit Metallophormischungen untersucht. Die Chelatbildung mit anderen Metallen als Eisen, die größer ist als bei reinem Desferrioxamin B, wird durch eine verbesserte Leistung bei der Auflösung von Bodenmineralien nach Anwendung verschiedener Metallophormischungen dokumentiert. Es werden neue Erkenntnisse vom Genom bis zum Produkt von Metallophoren aus Gordonia rubripertincta CWB2 unter verschiedenen Anbaubedingungen und unter Metallstress, insbesondere induziert durch Seltene Erden, gegeben. Diese Auswertung führte zu einer Steigerung um den Faktor 13. Strukturanalysen zeigten, dass der Stamm Citrat und verschiedene Desferrioxamine produziert. Eine robuste RP-HPLC-basierte Methode quantifizierte die Metallkomplexierung. Weitere Methoden zur Metallimmobilisierung von Metallophoren für die Metallextraktion aus Lösungen mit niedrigen Konzentrationen wurden etabliert. Darüber hinaus zeigen Catechol- und Hydroxamat-Metallophore aus Arthrobacter oxydans ATW2 und Kocuria rosea ATW4 die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Ge und Seltenen Erden, die Förderung des Pflanzenwachstums und das Phytoextraktionspotenzial.:CONTENTS Abstract ..........................................................................................................1 CHAPTER 1 Introduction ......................................................................................5 CHAPTER 2 Mobilization of trace elements in soil extracts by bacterial siderophores in dependence of the pH-value..................................31 CHAPTER 3 Cultivation dependent formation of siderophores by Gordonia rubripertincta CWB2........................................................................41 CHAPTER 4 Data on metal-chelating, -immobilization and biosorption properties by Gordonia rubripertincta CWB2 in dependency on rare earth adaptation.......................................................................................67 CHAPTER 5 Analysis of desferrioxamine-like siderophores and their capability to selectively bind metals and metalloids: development of a robust analytical RP-HPLC method. ..........................................................97 CHAPTER 6 Secondary metabolites released by the rhizosphere bacteria Arthrobacter oxydans and Kocuria rosea enhance plant availability and soil–plant transfer of germanium (Ge) and rare earth elements (REEs) .........................................................................................120 CHAPTER 7 Conclusion remarks and further perspectives ...............................154 References .......................................................................................................162 Acknowledgement .........................................................................................185 Curriculum Vitae ..........................................................................................187 List of publications ..........................................................................................189 List of oral and poster presentations ..........................................................190 List of proceedings ..........................................................................................191

Background: Soil microbes are key drivers of carbon (C) and nutrient cycling in terrestrial ecosystems, and their properties are influenced by the relationship between resource demand and availability. - Aims: Our objective was to investigate patterns of microbial properties and their controls to understand whether they differ between soils derived from geochemically contrasting parent material in tropical montane forests. - Methods: We measured microbial biomass C (MBC/Soil), potential extracellular enzyme activity (pEEA), and assessed microbial investments in C and nutrient acquisition at the beginning and end of a 120-day laboratory incubation experiment using soils developed from three geochemically contrasting parent material (i.e., mafic, mixed sediment, and felsic) and three soil depths (0–70 cm). - Results: We found that MBC/Soil and pEEA were highest in soils developed from the mafic parent material. Microbial investment in C acquisition was highest in soils developed from mixed sedimentary rocks and lowest in soils developed from the felsic parent material. We propose that our findings are related to the strength of contrasting mineral-related C stabilization mechanisms and varying C quality. No predominant microbial investment in nitrogen (N) acquisition was observed, whereas investment in phosphorus (P) acquisition was highest in subsoils. We found lower microbial investment in C acquisition in subsoils indicating relatively high C availability, and that microbes in subsoils can substantially participate in C cycling and limit C storage if moisture and oxygen conditions are suitable. Geochemical soil properties and substrate quality were important controls on MBC/Soil per unit soil organic C (MBC/SOC), particularly after the exhaustion of labile and fast cycling C, that is, at the end of the incubation. - Conclusion: Although a laboratory incubation experiment cannot reflect real-world conditions, it allowed us to understand how soil properties affect microbial properties. We conclude that parent material is an important driver of microbial properties in tropical montane forests despite the advanced weathering degree of soils.

These are the abstracts of the presentations of the 7th PhD conference held on 9 June 2023 in Freiberg.

These are the abstracts of the oral presentations of the 8th PhD conference held on 7 June 2024 in Freiberg.

Cyanobakterien sind die einzig bekannten Prokaryoten, die in der Lage sind oxygene Photosynthese zu betreiben. Sie besitzen ein großes Potenzial als nachhaltige Ressourcen für die Herstellung zahlreicher industriell und medizinisch relevanter Wirkstoffe. Trotz ihrer essentiellen Bedeutung ist jedoch das Wachstum von Cyanobakterien bis jetzt nur unzureichend verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich daher ein mathematisches Modell entwickelt, das das Wachstum von Cyanobakterien auf der Grundlage von intrazellulärer Proteinverteilung beschreibt. Dabei wurde das Proteom in wenige relevante Protein-Klassen unterteilt, die an fundamentalen zellulären Prozessen beteiligt sind, darunter Kohlenstoffaufnahme, -fixierung und -stoffwechsel, sowie Photosynthese und Proteintranslation. Besonders interessant sind die aus dem Modell resultierenden sogenannten mikrobiellen Wachstumsgesetze, sprich die Korrelationen zwischen der Wachstumsrate und der Proteinverteilung, die im stationären Zustand des Wachstums beobachtet werden. Das Modell prognostiziert eine charakteristische Krümmung für die Wachstumsgesetze jener Proteine, welche mit Lichtabsorption und Proteintranslation assoziiert werden. Verursacht wird diese Krümmung durch hohe Lichtintensitäten, die eine Abnahme der Wachstumsrate zur Folge haben. Die prognostizierten Wachstumsgesetze werden durch Proteindaten, die mittels Massenspektrometrie erhoben wurden, vom Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 gestützt. Des Weiteren bietet das Modell einen geeigneten Ausgangspunkt für die Erweiterung von der Charakterisierung von Einzelzellen zu einer Population von Zellen in einem lichtlimitierten Chemostat. Das erweiterte Modell stellt einen Zusammenhang her zwischen intrazellulärer Proteinverteilung, Wachstum der Population und Kultivierungseigenschaften, und bietet somit einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung und Verbesserung der Kultivierung von phototrophen Organismen und die Optimierung der photosynthetischen Produktivität. / Cyanobacteria are the only known prokaryotes that perform oxygenic photosynthesis, and therefore, hold significant potential as sustainable resources for the production of numerous industrially and medically relevant compounds. Despite their importance, however, the (molecular) limits and cellular economy of photoautotrophic growth are still insufficiently understood. In this thesis, I present a mathematical model based on a coarse-grained description of cellular protein allocation to describe cyanobacterial growth. The model describes cellular trade-offs considering only proteins that are involved in key cellular processes (carbon uptake, fixation, and metabolism, as well as photosynthesis and protein translation). Of particular interest are the resulting microbial growth laws, i.e., correlations between the growth rate and the protein distribution observed during balanced growth. The model predicts a characteristic kink for the growth laws of the light harvesting components and the translational machinery induced by photoinhibition, a decrease in growth rate due to high light intensities. The resulting growth laws are supported by quantitative mass spectrometry-based proteomics data of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. The proteomics data shows that the mathematical model has intrinsic predictive power, and thus, provides a suitable starting point for extending it from describing single cells to describe a growing population in a light-limited chemostat. The extended modeling framework goes beyond current models using phenomenological growth equations and establishes a mechanistic link between intracellular protein allocation, population growth and cultivation properties. The extended model provides a novel approach to study and guide phototrophic cultivation improvements that maximize photosynthetic productivity.