A divisão bacteriana é efetuada por um complexo macromolecular conhecido como divisomo. Um componente central do divisomo é FtsZ, uma proteína homóloga de tubulina que se polimeriza no meio da célula formando uma estrutura em forma de anel (anel Z). O controle da divisão é exercido por proteínas que modulam a habilidade de FtsZ de formar o anel Z. Dois fatores principais estão envolvidos na seleção do correto sitio de divisão. O melhor estudado é o sistema Min, o qual é responsável pelo bloqueio específico de sítios de divisão não desejados nos polos da célula. O componente do sistema Min que inibe a polimerização de FtsZ é a proteína MinC e é sabido que MinC requer MinD para se ativar, mas o mecanismo dessa ativação não está completamente compreendido. No presente trabalho investigamos o papel da associação de MinD à membrana na ativação de MinC. Usando um mutante que não mais se associa à membrana (MinDΔMTS) mostramos que o efeito de MinC em inibir a divisão celular é altamente dependente de seu recrutamento à membrana por MinD. No entanto, ensaios in vitro mostraram que o complexo MinCDΔMTS é mais eficiente em desfazer polímeros de FtsZ que MinC sozinho, indicando que MinD promove a ativação de MinC por outro mecanismo além de recrutamento à membrana. Esta ativação pode resultar de um efeito alostérico ou da criação de um sítio para FtsZ na interface do complexo MinCD, porém resultados preliminares não conseguiram detectar aumento da afinidade de MinC por FtsZ quando na presença de MinD. / Bacterial division is performed by a macromolecular complex known as the divisome. The central component of the divisome is FtsZ, a tubulin protein homolog, which polymerizes at the mid-cell forming a ring-like structure (Z-ring). This division is regulated by proteins that modulate ability of FtsZ to form the Z-ring. Two principal factors are involved in selecting the correct site of division. The best-studied factor is the Min system, which is responsible for the specific blockade of unwanted potential sites in the cell poles. The component of the Min system that inhibits FtsZ polymerization is the MinC protein. MinC requires the MinD protein for activation, but the mechanism of this activation is not completely understood. Here, we investigate the role of the association of MinD to the membrane during MinC activation. Using a mutant that does not interact with the membrane (MinDΔMTS) we show that the effect of MinC in inhibiting cell division is highly dependent on its recruitment to the membrane by MinD. However, in vitro assays show that MinCDΔMTS is more efficient in disrupting FtsZ polymers than MinC alone, indicating that MinD promotes MinC activation by a mechanism other than membrane recruitment. This activation could be due to an allosteric effect or the formation of a site for FtsZ on the MinCD interface; however, preliminary results could not detect any increase in the affinity of FtsZ to MinC in the presence of MinD.

A divisão bacteriana é efetuada por um complexo macromolecular conhecido como divisomo. Um componente central do divisomo é FtsZ, uma proteína homóloga de tubulina que se polimeriza no meio da célula formando uma estrutura em forma de anel (anel Z). O controle da divisão é exercido por proteínas que modulam a habilidade de FtsZ de formar o anel Z. Dois fatores principais estão envolvidos na seleção do correto sitio de divisão. O melhor estudado é o sistema Min, o qual é responsável pelo bloqueio específico de sítios de divisão não desejados nos polos da célula. O componente do sistema Min que inibe a polimerização de FtsZ é a proteína MinC e é sabido que MinC requer MinD para se ativar, mas o mecanismo dessa ativação não está completamente compreendido. No presente trabalho investigamos o papel da associação de MinD à membrana na ativação de MinC. Usando um mutante que não mais se associa à membrana (MinDΔMTS) mostramos que o efeito de MinC em inibir a divisão celular é altamente dependente de seu recrutamento à membrana por MinD. No entanto, ensaios in vitro mostraram que o complexo MinCDΔMTS é mais eficiente em desfazer polímeros de FtsZ que MinC sozinho, indicando que MinD promove a ativação de MinC por outro mecanismo além de recrutamento à membrana. Esta ativação pode resultar de um efeito alostérico ou da criação de um sítio para FtsZ na interface do complexo MinCD, porém resultados preliminares não conseguiram detectar aumento da afinidade de MinC por FtsZ quando na presença de MinD. / Bacterial division is performed by a macromolecular complex known as the divisome. The central component of the divisome is FtsZ, a tubulin protein homolog, which polymerizes at the mid-cell forming a ring-like structure (Z-ring). This division is regulated by proteins that modulate ability of FtsZ to form the Z-ring. Two principal factors are involved in selecting the correct site of division. The best-studied factor is the Min system, which is responsible for the specific blockade of unwanted potential sites in the cell poles. The component of the Min system that inhibits FtsZ polymerization is the MinC protein. MinC requires the MinD protein for activation, but the mechanism of this activation is not completely understood. Here, we investigate the role of the association of MinD to the membrane during MinC activation. Using a mutant that does not interact with the membrane (MinDΔMTS) we show that the effect of MinC in inhibiting cell division is highly dependent on its recruitment to the membrane by MinD. However, in vitro assays show that MinCDΔMTS is more efficient in disrupting FtsZ polymers than MinC alone, indicating that MinD promotes MinC activation by a mechanism other than membrane recruitment. This activation could be due to an allosteric effect or the formation of a site for FtsZ on the MinCD interface; however, preliminary results could not detect any increase in the affinity of FtsZ to MinC in the presence of MinD.

A divisão celular em B. subtilis inicia-se pela formação de um complexo multiprotéico, o divisomo, no sítio onde a bactéria irá se dividir. FtsZ é a primeira proteína a se localizar no futuro sitio de divisão, formando uma estrutura em anel (anel Z) que se estende por toda a circunferência da célula. O anel Z funciona como um arcabouço responsável por recrutar outras quinze proteínas de divisão que irão participar da montagem do divisomo. Nesta tese, utilizamos abordagens quantitativas e qualitativas de microscopia de fluorescência vital para estudarmos duas questões ainda não esclarecidas sobre o funcionamento do divisomo. A primeira delas é como o divisomo é montado. Para estudarmos a montagem do divisomo nós realizamos ensaios de co-localização entre o anel Z (FtsZ-mCherry) e as proteínas ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB , DivIVA, e MinC fusionadas a GFP. Quanto maior a freqüência de co-localização entre FtsZ e outra proteína de divisão, mais inicial é a participação da proteína na formação do divisomo. Portanto, a medida da freqüência de co-localização entre o anel Z e as proteínas componentes do divisomo permite que se deduza uma cinética da montagem deste complexo. Estes ensaios demonstraram uma freqüência de co-localização de 97,33% para ZapA; 98,31% para EzrA; 83,90% para FtsW; 78,43% para FtsL; 50% para YpsB; 41,7% para DivIVA e 31,64% para MinC. Estes resultados sugerem que o divisomo seja formado em três etapas. ZapA e EzrA se associam ao divisomo imediatamente após a formação do anel Z, em seguida FtsW e FtsL são recrutados para o divisomo, e por último YpsB, DivIVA, MinC associam-se ao divisomo. A segunda questão que investigamos nesta tese foi o mecanismo da mudança de posição do divisomo que ocorre durante a esporulação em B. subtilis. Na fase de esporulação a célula divide-se assimetricamente, com a formação do septo próxima a um dos pólos. Durante o crescimento vegetativo a divisão não ocorre próxima aos pólos por causa da ação das proteínas MinC, MinD e DivIVA, importantes reguladores espaciais da divisão. MinCD e DivIVA são inibidores da formação do anel Z que durante o crescimento vegetativo se localizam nos pólos das células.. Uma hipótese para explicar o uso dos sítios polares para a divisão durante a esporulação seria que as proteínas MinCD e DivIVA seriam removidas dos pólos celulares. Para testarmos esta hipótese, estudamos a localização das proteínas MinCD e DivIVA durante a esporulação. Nossos resultados demonstraram que MinCD e DivIVA se re-localizam e saem dos pólos celulares durante a esporulação. Porém esta dinâmica ocorre após a formação do anel Z assimétrico, sugerindo que o anel Z seja insensível a estes inibidores durante a esporulação. Por ensaios genéticos em B. subtilis demonstramos que a proteína SpoIIE, conhecida como provável proteína responsável por promover a formação do septo assimétrico, seja capaz de contrapor a ação de MinC no início da esporulação. Dessa maneira nós propomos um novo modelo de mudança da divisão simétrica para assimétrica durante a esporulação, diferentemente da simples saída do complexo MinCD dos pólos como é proposto na literatura. / Bacillus subtilis division begins through the formation of a multiprotein complex, the divisome, at the site of division. FtsZ is the earliest known protein to localize to the future division site where the protein forms a ring-like structure (Z-ring) that extends around the circumference of the cell. The Z-ring functions as a scaffold and recruits about fifteen other division proteins that compose the divisome. In this work, we used quantitative and qualitative methods of vital fluorescence microscopy to study two questions that have not been elucidated about the divisome dynamics. The first is how divisome is assembled. To address that problem, we made co-localization between Z-ring (FtsZ-mCherry) and proteins ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB, DivIVA, and MinC fused to GFP. Higher is the match between GFP fusions to Z-ring, earlier is the assembly of division proteins to divisome. Therefore, the co-localization frequency between Z ring and divisome proteins will allow us to deduce the assemble kinetics of the divisome. This assays showed a co-localization frequency of 97,33% for ZapA; 98,31% for EzrA; 83,90 for FtsW; 78,43% for FtsL; 50% for YpsB; 41,7% for DivIVA and 31,64% for MinC. This data suggests that the divisome does not assemble in two but in three steps. ZapA and EzrA assemble into the divisome immediately after Z ring formation, secondly FtsW and FtsL were recruited to the divisome, and finally YpsB, DivIVA, MinC associated with the divisome. The second question that we investigated in this work is the mechanism responsible for change the divisome position that occurs during sporulation in B. subtilis. In sporulation the cell divides asymmetrically, with a septum formation near poles. During vegetative grown the divisiome does not occur near poles because of MinC, MinD and DivIVA action, relevant for spatial regulation of division. MinCD and DivIVA are inhibitors of Z ring formation that during vegetative growth are located at poles. A hypothesis to explain the use of polar sites for division during sporulation would be that MinCD and DivIVA would be removed from cellular poles. To test this hypothesis, we studied the location of MinCD and DivIVA proteins during sporulation. Our results demonstrated that MinCD and DivIVA re-localize and leave to cell poles during sporulation. However this process occurs after asymmetric Z ring formation, suggesting that Z ring would be unresponsive to this inhibitors during sporulation. Through genetics assays in B. subtilis we demonstrated that SpoIIE protein, known to probably play a role in asymmetric septum formation, would be able to contrapose MinC action during early sporulation. Therefore, we propose a novel model for change the symmetric to asymmetric division during sporulation, unlike the release of MinCD from pole proposed in the literature.

A divisão celular em B. subtilis inicia-se pela formação de um complexo multiprotéico, o divisomo, no sítio onde a bactéria irá se dividir. FtsZ é a primeira proteína a se localizar no futuro sitio de divisão, formando uma estrutura em anel (anel Z) que se estende por toda a circunferência da célula. O anel Z funciona como um arcabouço responsável por recrutar outras quinze proteínas de divisão que irão participar da montagem do divisomo. Nesta tese, utilizamos abordagens quantitativas e qualitativas de microscopia de fluorescência vital para estudarmos duas questões ainda não esclarecidas sobre o funcionamento do divisomo. A primeira delas é como o divisomo é montado. Para estudarmos a montagem do divisomo nós realizamos ensaios de co-localização entre o anel Z (FtsZ-mCherry) e as proteínas ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB , DivIVA, e MinC fusionadas a GFP. Quanto maior a freqüência de co-localização entre FtsZ e outra proteína de divisão, mais inicial é a participação da proteína na formação do divisomo. Portanto, a medida da freqüência de co-localização entre o anel Z e as proteínas componentes do divisomo permite que se deduza uma cinética da montagem deste complexo. Estes ensaios demonstraram uma freqüência de co-localização de 97,33% para ZapA; 98,31% para EzrA; 83,90% para FtsW; 78,43% para FtsL; 50% para YpsB; 41,7% para DivIVA e 31,64% para MinC. Estes resultados sugerem que o divisomo seja formado em três etapas. ZapA e EzrA se associam ao divisomo imediatamente após a formação do anel Z, em seguida FtsW e FtsL são recrutados para o divisomo, e por último YpsB, DivIVA, MinC associam-se ao divisomo. A segunda questão que investigamos nesta tese foi o mecanismo da mudança de posição do divisomo que ocorre durante a esporulação em B. subtilis. Na fase de esporulação a célula divide-se assimetricamente, com a formação do septo próxima a um dos pólos. Durante o crescimento vegetativo a divisão não ocorre próxima aos pólos por causa da ação das proteínas MinC, MinD e DivIVA, importantes reguladores espaciais da divisão. MinCD e DivIVA são inibidores da formação do anel Z que durante o crescimento vegetativo se localizam nos pólos das células.. Uma hipótese para explicar o uso dos sítios polares para a divisão durante a esporulação seria que as proteínas MinCD e DivIVA seriam removidas dos pólos celulares. Para testarmos esta hipótese, estudamos a localização das proteínas MinCD e DivIVA durante a esporulação. Nossos resultados demonstraram que MinCD e DivIVA se re-localizam e saem dos pólos celulares durante a esporulação. Porém esta dinâmica ocorre após a formação do anel Z assimétrico, sugerindo que o anel Z seja insensível a estes inibidores durante a esporulação. Por ensaios genéticos em B. subtilis demonstramos que a proteína SpoIIE, conhecida como provável proteína responsável por promover a formação do septo assimétrico, seja capaz de contrapor a ação de MinC no início da esporulação. Dessa maneira nós propomos um novo modelo de mudança da divisão simétrica para assimétrica durante a esporulação, diferentemente da simples saída do complexo MinCD dos pólos como é proposto na literatura. / Bacillus subtilis division begins through the formation of a multiprotein complex, the divisome, at the site of division. FtsZ is the earliest known protein to localize to the future division site where the protein forms a ring-like structure (Z-ring) that extends around the circumference of the cell. The Z-ring functions as a scaffold and recruits about fifteen other division proteins that compose the divisome. In this work, we used quantitative and qualitative methods of vital fluorescence microscopy to study two questions that have not been elucidated about the divisome dynamics. The first is how divisome is assembled. To address that problem, we made co-localization between Z-ring (FtsZ-mCherry) and proteins ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB, DivIVA, and MinC fused to GFP. Higher is the match between GFP fusions to Z-ring, earlier is the assembly of division proteins to divisome. Therefore, the co-localization frequency between Z ring and divisome proteins will allow us to deduce the assemble kinetics of the divisome. This assays showed a co-localization frequency of 97,33% for ZapA; 98,31% for EzrA; 83,90 for FtsW; 78,43% for FtsL; 50% for YpsB; 41,7% for DivIVA and 31,64% for MinC. This data suggests that the divisome does not assemble in two but in three steps. ZapA and EzrA assemble into the divisome immediately after Z ring formation, secondly FtsW and FtsL were recruited to the divisome, and finally YpsB, DivIVA, MinC associated with the divisome. The second question that we investigated in this work is the mechanism responsible for change the divisome position that occurs during sporulation in B. subtilis. In sporulation the cell divides asymmetrically, with a septum formation near poles. During vegetative grown the divisiome does not occur near poles because of MinC, MinD and DivIVA action, relevant for spatial regulation of division. MinCD and DivIVA are inhibitors of Z ring formation that during vegetative growth are located at poles. A hypothesis to explain the use of polar sites for division during sporulation would be that MinCD and DivIVA would be removed from cellular poles. To test this hypothesis, we studied the location of MinCD and DivIVA proteins during sporulation. Our results demonstrated that MinCD and DivIVA re-localize and leave to cell poles during sporulation. However this process occurs after asymmetric Z ring formation, suggesting that Z ring would be unresponsive to this inhibitors during sporulation. Through genetics assays in B. subtilis we demonstrated that SpoIIE protein, known to probably play a role in asymmetric septum formation, would be able to contrapose MinC action during early sporulation. Therefore, we propose a novel model for change the symmetric to asymmetric division during sporulation, unlike the release of MinCD from pole proposed in the literature.

Exactly constrained (EC) design is a robust design method which can be used for mechanical assemblies. It entails using the minimum number of constraints to eliminate all desired motion. While found by some engineers in industry to have many benefits (including robust assembly, no binding or play, ease of assembly, and the ability to tolerate the wear of parts), EC designs remain somewhat unrecognized by academia. One reason for this minimal exposure may be the lack of a quantitative foundation for such designs. This thesis describes the history and current background for EC designs, and it also begins to develop a quantitative foundation for EC design based on several mathematical methods. EC designs can be analyzed quite simply by understanding that they are statically determinate. Because of this, the equations of equilibrium can be used to validate the rules and the nesting force window that have been defined by Blanding [1999]. In addition, a generalized method using the equations of equilibrium has been developed in this thesis to analyze an EC design based on the locations of the constraints and to find the nesting force window. The direct linearization method (DLM) is another mathematical method used to quantify information in an EC design. While EC designs provide many advantages, some EC assemblies may be "better" than others. A quantitative measure of goodness is developed in this thesis using the DLM. The goodness value assigned to each design through this process can either be used to make a decision on an individual design, or it can be used to compare similar EC designs. Finally, the robust nature of EC design is examined using a Monte Carlo simulation. In general, the results show that EC designs have a higher rate of assembly than similar designs that are over-constrained. They are more robust. In addition, EC designs have lower assembly error than the similarly over-constrained assemblies.