Der Verlauf von Prionenerkrankungen wird durch die Akkumulation einer abnormal gefalteten Isoform des zellulären Prion-Proteins PrPC bestimmt. Diese infektiöse Isoform, die PrPSc genannt wird, entsteht, indem sie mit PrPC interagiert und dieses die Konformation von PrPSc übernimmt. Die Konversion des zellulären Prion-Proteins PrPC in seine pathogene Isoform PrPSc und die damit verbundene PrPSc-Akkumulation sind demnach die wesentlichen Merkmale von Prionenerkrankungen und bieten mögliche therapeutische Ansatzpunkte. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass Antikörper, die gegen PrPC und/oder PrPSc gerichtet sind, in vitro und in vivo in den Konversionsprozess eingreifen können und so die PrPSc-Akkumulation inhibieren (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war somit die Generation neuer Anti-PrP-Antikörper, welche die PrPSc-Konversion effizient hemmen können und somit die Auswahl an Anti-PrP-Antikörpern für therapeutische und diagnostische Zwecke zu erweitern. Insgesamt wurden sieben Anti-PrP-Antikörper mittels „Hybridom“-Technik hergestellt. Zwei der Antikörper (B2-31-166 und B2-43-133) resultierten aus einer Fusion mit Milzzellen von Prnp0/0-Mäusen, die zuvor mit fibrillärem PrP immunisiert wurden. Bei fünf Antikörpern (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) wurde für die Immunisierung rekombinantes PrP verwendet. Alle Antikörper detektierten rekombinantes PrP sowie natives und denaturiertes PrPC und PrPSc. Die bestimmten Aviditäten und die relativ einheitlichen Dissoziationskonstanten (KD-Konstante) waren mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar. Das Epitop des Antikörpers B2-31-166 wurde im unstrukturierten N-Terminus von PrP lokalisiert (Reste 96-110), während die Antikörper 7-12-5, 12-29 und 48-11-5 PrP im globulären C-Terminus binden (Reste 158-176). Das Epitop der Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 wurde ebenfalls im C-Terminus bestimmt (Reste 142-157). Diese Antikörper binden PrP im Bereich der Helix 1 (Reste 144-152), einem Epitop, das bereits häufiger für inhibitorisch wirksame Antikörper bestimmt wurde. Drei der sieben Anti-PrP-Antikörper (7-12-5, 12-29 und B2-31-166) hemmten die PrPSc-Akkumulation in Prion-infizierten N2a-Zellen (ScN2a-Zellen) nicht. Der Antikörper 48-11-5 führte zu einer unvollständigen Reduktion des PrPSc-Gehalts, die sich auch durch die Verlängerung des Applikationszeitraums nicht verstärken ließ. Dagegen inhibierten die Antikörper 103-8, 110-10 und B2-43-133 die PrPSc-Akkumulation vollständig. Dieser Effekt wurde auf eine spezifische Interaktion der Antikörper mit PrP zurückgeführt, da ein zytotoxischer Effekt, der den PrPSc-Gehalt unspezifisch hätte verringern können, nicht beobachtet wurde. Bei der Analyse der Infektiosität von ScN2a-Zellen zeigte sich jedoch, dass der Antikörper 110-10 zwar die PrPSc-Akkumulation inhibierte, aber die Infektiosität der Zellen nicht reduzieren konnte. Die Behandlung mit dem Antikörper 103-8 reduzierte die Infektiosität der ScN2a-Zellen zwar, jedoch setzte 30 Tage nach Abschluss der Behandlung eine erneute PrPSc-Akkumulation in ScN2a-Zellen ein. Dagegen reduzierte die Behandlung mit dem Antikörper B2-43-133 die Infektiosität der ScN2a-Zellen vollständig. Des Weiteren wurde bei diesen Zellen auch nach 36 Tagen Kultivierung ohne Antikörper keine erneute PrPSc-Akkumulation detektiert. Die starke inhibitorische Wirkung dieses Antikörpers wird zusätzlich durch einen sehr niedrigen IC50-Wert (0,31 nM) unterstützt, der mit kommerziellen Referenzantikörpern vergleichbar ist. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass von den sieben neu generierten Anti-PrP-Antikörpern der Antikörper B2-43-133 ein Kandidat für weiterführende Experimente mit therapeutischem Hintergrund ist. Welchen Mechanismus die Anti-PrP-Antikörper für die Inhibition nutzen, konnte nicht geklärt werden. Obwohl der Antikörper B2-43-133 die Verweildauer von PrPC auf der Zelloberfläche (Retention) verlängerte, wodurch hypothetisch die gebundenen PrPC-Moleküle der PrPSc-Konversion entzogen werden können, wurde dies für einen Referenzantikörper, welcher einen ähnlichen inhibitorischen Effekt besitzt, nicht beobachtet. Dies spricht entweder dafür, dass die Verlängerung der Retention nur ein weiteres Charakteristikum der Antikörper ist und ein anderer Mechanismus genutzt wird, oder dafür, dass verschiedene Antikörper verschiedene Mechanismen nutzen können. Auch die Hypothese, dass die inhibitorische Wirkung des Antikörpers durch eine Komplexbildung mit PrP vermittelt wird, konnte nicht bestätigt werden, da eine stabile Komplexbildung des Antikörpers B2-43-133 mit rekombinantem PrP zu einer Erhöhung des IC50-Werts im Vergleich zu freiem Antikörper führte. / The development of prion diseases is characterized by accumulation of an abnormal folded isoform of the cellular prion protein (PrPC). This infectious isoform, called PrPSc, emerges through interaction with PrPC adopting the conformation of PrPSc. Thus, conversion of PrPC to its pathogenic isoform and the resulting PrPSc accumulation are substantial hallmarks of prion diseases that provide possible therapeutical intervention points. Recent studies have shown that antibodies recognizing PrPC and/or PrPSc interfere with the conversion process in vitro and in vivo and inhibit PrPSc accumulation (Enari et al., 2001; Feraudet et al., 2005b; Kim et al., 2004; Miyamoto et al., 2005; Pankiewicz et al., 2006; White et al., 2003). This study was initiated to generate new anti-PrP antibodies that could efficiently inhibit the PrPSc conversion and thereby extend the repertoire of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic and diagnostic use. Altogether, seven antibodies could be established by hybridoma-technique: two mAbs from immunisation of Prnp0/0 mice with fibrillar PrP (B2-31-166 and B2-43-133) and the remainder (7-12-5, 12-29, 48-11-5, 103-8 und 110-10) by using recombinant PrP as immunogen. All antibodies were able to detect recombinant PrP as well as native and denaturated PrPC and PrPSc. The avidities and similar dissociation constants were comparable to commercial reference antibodies. The epitope of mAb B2-31-166 was determined in the unstructured N-terminal domain (residues 96-110), whereas mAbs 7-12-5, 12-29 and 48-115 detected an epitope in the C-terminal globular domain (residues 158-176). The epitopes of mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 are located in the C-terminus (residues 142-157) as well and correspond to the -helix 1 of PrPC (residues 144-152). This region was already determined as a potential epitope for other inhibitory effective antibodies. Three antibodies (7-12-5, 12-29 and B2-31-166) did not inhibit PrPSc accumulation in prion-infected cells (ScN2a cells). MAb 48-11-5 only led to an incomplete reduction of the PrPSc content. This effect could not be strengthened through extending the treatment period. In contrast, mAbs 103-8, 110-10 and B2-43-133 were able to completely inhibit the PrPSc accumulation in ScN2a cells. This effect was attributed to a specific interaction between antibodies and PrP as no cytotoxic effect was detectable that could lead to an unspecific reduction of the PrPSc content. Interestingly, analysis of the infectivity of antibody-treated ScN2a cells showed that mAb 110-10 was indeed able to inhibit PrPSc accumulation, although it did not affect the infectivity of ScN2a cells. MAb 103-8 reduced the infectivity level, but new PrPSc accumulation could be detected in ScN2a cells 30 days after the treatment had been finished. Only treatment with mAb B2-43-133 completely eliminated the infectivity of ScN2a cells and no PrPSc could be detected in ScN2a cells even 36 days after treatment. The strong inhibitory effect of this antibody is supported by a very low IC50 value (0,31 nM) which is also comparable with commercial anti-PrP antibodies. In summary, these results indicate that anti-PrP antibody B2-43-133 represents a good candidate for future immunotherapeutic approaches. Furthermore, it was impossible to clearly identify the underlying mechanisms of the antibodies for the inhibition of PrPSc accumulation. Although mAb B2-43-133 prolonged the retention of PrPC on the cell surface, whereby the bound PrPC molecules could hypothetical withdraw the PrPSc conversion, this could not be observed for commercial antibodies with similar inhibitory effect. These data imply that the prolongation of the PrP retention is only one feature of mAb B2-43-133. However, it is possible that different antibodies use different mechanisms to inhibit PrPSc conversion and that the retention is one of them. In addition, the inhibition of PrPSc accumulation is probably not mediated by the formation of an antibody-protein complex since the treatment of ScN2a cells with a stable complex consisting of B2-43-133 and recombinant PrP complex decreased the inhibitory effect compared to free antibody.

Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Gliotoxin und eine Charakterisierung der Eigenschaften dieser Antikörper sowie ihrer Fab-Fragmente im ELISA sowie in Zellkulturen. Insgesamt konnten fünf monoklonale Antikörper generiert werden, die spezifisch für das Mykotoxin Gliotoxin waren. / This work focuses at the production of Gliotoxin specific monoclonal antibodies and their characterization as well as their fab fragments in ELISA and cell culture. All in all, five specific antibodies could be isolated.

Synapsins are conserved synapse-associated hosphoproteins involved in the fine regulation of neurotransmitter release. The aim of the present project is to study the phosphorylation of synapsins and the distribution of phospho-synapsin in the brain of Drosophila melanogaster. Three antibodies served as important tools in this work, a monoclonal antibody (3C11/α-Syn) that recognizes all known synapsin isoforms and two antisera against phosphorylated synapsin peptides (antiserum PSyn(S6) against phospho-serine 6 and antiserum PSyn(S464) against phospho-serine 464). These antisera were recently generated in collaboration with Bertram Gerber and Eurogentec. ... / Synapsine sind konservierte, Synapsen-assoziierte Phosphoproteine, die an der Feinregulation der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind. Das Ziel des Projektes ist, die Phosphorylierung der Synapsine und die Verteilung des Phospho-Synapsins im Gehirn von Drosophila melanogaster zu untersuchen. Aus diesem Grunde wurden drei bestimmte Antikörper in dieser Arbeit verwendet: Ein monoklonaler Antikörper (3C11/α-Syn), der alle bekannten Isoformen von Synapsin erkennt, und zwei Antiseren gegen phosphorylierte Synapsinpeptide (das Antiserum PSyn(S6) gegen Phosphoserin 6 und das Antiserum PSyn(S464) gegen Phosphoserin 464). Diese Antiseren wurden unlängst in Zusammenarbeit mit Bertram Gerber und Eurogentec hergestellt.

Nosocomial pneumonia is mostly caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). However, the standard antibiotic therapy is affected by increasing emergence of bacterial resistance. Therefore, novel therapeutic options are in high demand. New antimicrobial agents alone cannot handle the problem of increasing bacterial resistance but innovative drug delivery strategies and fast identification of infection causing pathogens are required to diminish bacterial resistance development. A very promising approach to improve the therapy of pneumonia is presented by local drug delivery to the lung. This application method enables high local drug concentrations in the lung leading to shorter application of antibiotics and hence reduces the risk of resistance development. Furthermore, the systemic concentration is lowered reducing the emergence of adverse effects. Therefore, in this thesis several approaches to improve the therapy of MRSA pneumonia are studied. One approach to achieve an efficient local delivery of antibiotics are nano-sized drug delivery systems which enable the nebulization of poorly-soluble antibiotics and can lead to even higher local drug concentrations due to their small size since nanoparticles improve mucus penetration and decrease phagocytosis by alveolar macrophages. Here, an analytical setup was developed that facilitates the identification of optimal preparation conditions for drug polyelectrolyte nanoplexes. Another promising approach to support antimicrobial therapy of pneumonia is presented by antibody-based immunotherapy. Since the stability of the antibody and hence its therapeutic activity are endangered during production, transport, storage, and application, a stabilizing formulation was developed for hUK-66, an antibody targeting surface antigens of S. aureus. Furthermore, nebulization of this formulated monoclonal antibody was studied to enable local application. Finally, the immunotherapeutic efficacy of the nebulized hUK-66 formulation was investigated in an animal in vivo study. Furthermore, rapid identification of the infection triggering pathogen is very important. The selective detection of S. aureus was achieved using optical planar Bragg grating sensors functionalized with hUK-66. In addition, the reusability of this system was studied applying a surface functionalization based on the cross-linker SPDP which enables a reversible fixation of the antibody. / Die Behandlung von Infektionen, die durch Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Bakterien hervorgerufen wurden, stellt weltweit noch immer eine schwierige Herausforderung dar. Besonders durch MRSA ausgelöste nosokomiale Pneumonien stehen in direktem Zusammenhang mit erhöhter Morbidität und Mortalität sowie einer Verlängerung des Krankenhausaufenthaltes und der Beatmungsdauer. In Kapitel I dieser Dissertation werden die aktuellen Behandlungsempfehlungen für MRSA-Pneumonien und deren Nachteile diskutiert. Dabei wird in diesem Review aufgezeigt, dass aufgrund der drohenden Gefahr von schweren Nebenwirkungen und des Problems der steigenden Antibiotikakonzentrationen, die zur Bekämpfung von multiresistenten Krankheitserregern nötig sind, die alleinige systemische Anwendung von Antibiotika für eine Therapie der MRSA-Pneumonie mitunter nicht mehr ausreicht. Angesichts des vermehrten Auftretens von Resistenzen gegen die gängigen Antibiotika ist der Bedarf an neuen antimikrobiellen Mitteln sowie innovativen Strategien zur Wirkstoffapplikation hoch. Da die Entwicklung neuer Antibiotika in den letzten Jahrzehnten deutlich nachlässt, stellen Antikörper-basierte immuntherapeutische Ansätze eine vielversprechende Alternative dar. Darüber hinaus soll eine lokale Wirkstoffverabreichung in die Lunge die Pneumonie-Behandlung infolge erhöhter Wirkstoffkonzentration am Ort der Infektion und gleichzeitiger geringer systemischer Wirkstoffbelastung begünstigen, was das Risiko einer Resistenzentwicklung verringern kann. Verneblung ist hierbei ein direkter und einfacher Weg, Wirkstoffe bei intubierten Patienten an ihren Wirkort zu bringen und ist für die pulmonale Verabreichung von Antibiotika sowie Antikörpern gut erforscht. Zwar wurden weitere Fortschritte in der Weiterentwicklung der Gerätetechnologie und Wirkstoff-verabreichung für die Verneblung von Antibiotika und Antikörpern gemacht, diese wurden aber bisher kaum in der Behandlung von MRSA-Pneumonien umgesetzt. Deshalb konzentriert sich das erste Kapitel auf eine Übersicht über die Fortschritte in der lokalen Wirkstoffapplikation, welche potentiell auf die Behandlung von MRSA-Pneumonie mittels Antikörpern und Antibiotika übertragbar wären. Kapitel II beschäftigt sich mit „Drug Delivery“-Systemen für Antibiotika in Nanometergröße, welche eine Umgehung des Löslichkeitsproblems von schwer wasserlöslichen Wirkstoffen ermöglichen. Außerdem kann eine durch Nanopartikel verbesserte Mucuspenetration die Wirkstoffkonzentrationen am Wirkort erhöhen, was als Möglichkeit angesehen wird, das Auftreten von Antibiotikaresistenz zu vermindern. Nanopartikel-Komplexe (Nanoplexe), welche durch Selbst-Zusammenlagerung eines Wirkstoffs und eines entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyts hergestellt werden, erlauben eine noch höhere Wirkstoffbeladung als herkömmliche Nanopartikel. In diesem Kapitel wurde unter Verwendung von Ciprofloxacin (CIP) und Dextransulfat (DS) als Modellkomponenten ein analytisches Setup evaluiert, das geeignet sein soll, optimale Herstellungsbedingungen für die Bildung von Nanoplexen zu identifizieren. Hierbei wurde die Eignung von Isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) zusammen mit anderen analytischen Methoden als Selektions-Hilfsmittel für eine rationale Formulierungsoptimierung bewertet, indem der Einfluss von unterschiedlichen Salzen und verschiedenen ionischen Stärken auf die CIP/DS-Nanoplexbildung untersucht wurde. Die Anwesenheit von Salz führte hierbei zu kleineren und zahlreicheren Partikeln mit größerer Einheitlichkeit, hatte aber keinen Einfluss auf die Freisetzung von CIP aus den Nanoplexen. Bedeutsam ist auch, dass die Bindungsaffinität mit Partikelform und Morphologie korrelierte, was möglicherweise eine Optimierung entscheidender Qualitätseigenschaften basierend auf ITC-Daten ermöglicht. Insgesamt erwies sich ITC zusammen mit den ergänzenden Methoden als nützliches Instrument für die Evaluierung von Bedingungen für Mischungsverhältnis, Art des Salzes und ionische Stärke für die Bildung von Nanoplexen. In Kapitel III wird der Rahmen der Behandlungsmöglichkeiten für MRSA-Infektionen auf Antikörper-basierte Immuntherapien erweitert. Einen vielversprechenden Ansatz, die Abtötung der Bakterien zu fördern, stellt der zielgerichtete Angriff auf Komponenten der Bakterienoberfläche mit immunogenen Eigenschaften durch den humanisierten monoklonalen Antikörper hUK-66 dar. Allerdings werden therapeutische Proteine während ihrer Herstellung und bis zum Ende ihrer Aufbrauchsfrist mit einer Vielzahl von externen Einflüssen konfrontiert, die ihre Konformation und somit Stabilität beeinträchtigen können. Um eine wirksame Wirkstoffverabreichung zu ermöglichen und ungewollte Reaktionen des Immunsystems aufgrund Aggregation des Proteinmoleküls zu vermeiden, erstrebt dieses Kapitel die Identifizierung einer Formulierung für hUK-66, welche dessen physikalische und chemische Proteinstabilität bewahrt. Mit Hilfe von Ergebnissen der Charakterisierung des Antikörpers wurde ein optimaler pH-Wert für die Formulierung in einer Stabilitätsstudie mit kurzer Laufzeit evaluiert. In direktem Anschluss wurden verschiedene Kombinationen von Hilfsstoffen und Darreichungsformen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Antikörperstabilität zu bewahren, analysiert, indem unterschiedliche flüssige und gefriergetrocknete Formulierungen in einer Langzeitstabilitätsstudie bei verschiedenen Lagerungstemperaturen untersucht wurden. Eine Lyophilisierung von hUK-66 in Histidinpuffer, pH 6, zusammen mit den Stabilisatoren Saccharose und Polysorbat 20 konnte die Stabilität dieses Antikörpers während des gesamten Formulierungsprozesses und einer Langzeit-Einlagerung bei 2-8°C nachweislich bewahren. Um therapeutische Proteine über die Lunge zu applizieren, ist es nötig, ein inhalierbares Aerosol zu erzeugen. Da sich jedoch während des Verneblungsprozesses die Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche erheblich vergrößert, werden die Biomoleküle einem Grenzflächen-stress ausgesetzt. Deshalb werden in Kapitel IV die zuvor entwickelten hUK 66-Formulierungen hinsichtlich ihrer Eignung untersucht, den Antikörper während der Verneblung durch einen Düsenvernebler zu stabilisieren. Da zum Vernebeln eine sehr große Probenmenge benötigt wird, wurde zuerst ein In-vitro-Ersatzverfahren entwickelt, welches den Verneblungsstress simuliert, um den Wirkstoffverbrauch zu reduzieren. Die hUK-66-Formulierung mit Saccharose und Polysorbat 20 bewies, dass sie die Stabilität dieses Proteins sowohl im Vorversuch als auch bei der eigentlichen Verneblung bewahren konnte. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass eine Verneblung keinen nachteiligen Effekt auf die chemische Stabilität des Antikörpers ausgeübt hat. Zuletzt konnte die immuntherapeutische Wirksamkeit der vernebelten hUK-66-Formulierung bewiesen werden, da die Überlebensrate von Mäusen, die intranasal mit S. aureus infiziert worden waren, durch Inhalation der Antikörper-formulierung verlängert werden konnte. Für diese In-vivo-Studie wurde ein spezieller Aufbau erfolgreich entwickelt, der die Applikation des Aerosols an wache und normal atmende Mäuse ermöglicht. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Aufbaus war, dass die Mäuse dem Aerosol nur mit der Nase ausgesetzt waren, was die Nachteile einer Ganzkörperverneblung, wie Absorption über die Haut und Bedarf an großen Mengen an Aerosol, verringerte. Insgesamt gefährdeten die vielfache Verneblung und Rezirkulation der Proteinlösung innerhalb des Reservoirs die Konformation des formulierten Antikörpers unwesentlich. Somit konnte in dieser Arbeit die Stabilität von hUK-66 in einer optimierten Formulierung während einer Verneblung bewiesen sowie sein immuntherapeutisches Potential für eine effektive Behandlung von S. aureus Infektionen bei pulmonaler Verabreichung gezeigt werden. Ein weiterer wichtiger Punkt für eine effektive und schnelle Behandlung von Pneumonien ist die umgehende Detektion und Identifikation derjenigen Krankheitserreger, welche die Infektion auslösen. Eine anschließende geeignete Wahl der Medikation ist entscheidend, um eine systemische Verbreitung und Fortdauer der Infektion genauso wie das Auftreten von Antibiotikaresistenzen zu vermeiden. Deshalb sind effiziente Detektionsmethoden für Pathogene im Bereich der klinischen Diagnostik sehr gefragt. In Kapitel V wurden Biosensoren als vielversprechende Alternative zur Verbesserung der Pathogendetektion untersucht, da sie eine sensitive, spezifische und schnelle Analyse diverser Proben erlauben. Durch Immobilisierung von hUK-66-Antikörpern auf der Oberfläche eines optischen planaren Bragg-Gitter-Sensors konnte eine selektive Detektion von S. aureus erreicht werden. Um weiterhin die Wiederverwendbarkeit der Sensoren zu verbessern sowie Installationszeit, Kosten und Vorbereitungsaufwand zu reduzieren, wurde eine Sensoroberflächen-funktionalisierung dahingehend evaluiert, ob sie eine wiederholte Verwendung des Sensors für die Antikörper-basierte Detektion von lebenden Bakterien ermöglicht. Die Anbindung von hUK-66, einem Fänger-Antikörper spezifisch für S. aureus, auf der Sensoroberfläche mit Hilfe eines spaltbaren Linkers sowie die anschließende spezifische Bindung von S. aureus konnten in Echtzeit nachverfolgt werden, was die Anwendbarkeit von optischen Sensoren für eine spezifische und schnelle Detektion von großen biologischen Strukturen hervorhebt. Die Wiederverwendbarkeit der mit Bakterien gesättigten Sensoren konnte erfolgreich durch eine Abspaltung des Antikörpers zusammen mit den angebundenen Bakterien mittels Reduktion der Disulfidbindungen und anschließender Refunktionalisierung mit aktiviertem Antikörper gezeigt werden und führte zu einer vergleichbaren Sensitivität gegenüber S. aureus.

For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. / Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern.

Der humane, monoklonale IgG Antikörper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunität dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden können. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und näher charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei über ein affinitätschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS über die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antikörper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr häufig bei den natürlichen IgM Antikörpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antikörpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zelluläre Prozesse ausübt. Durch die Bindung hemmte der Antikörper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem für metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antikörperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladhäsion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellulären Prozesse sind wichtig für sich im Körper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgeführten Analysen handelte es sich um vom Antikörper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Bindungsverhalten des Antikörpers genauer charakterisieren zu können. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antikörper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antikörpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen ermöglicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunität als auch neue Optionen für die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellulären, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue Möglichkeit für Diagnostik- und Therapieansätze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen ermöglicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentitäten könnte diese Zielstruktur für die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilität und Tumorzelladhäsion, könnte der BARB-4 Antikörper besonders für die Prävention einer Metastasierung von Bedeutung sein. / BARB-4, a human monoclonal IgG antibody originally isolated from a stomach cancer patient using human hybridoma technology, is a germ-line encoded and innate immunity-related antibody, as are only few other tumor-specific IgG immunoglobulins. In this study, the antigen of the BARB-4 antibody was identified and characterized. The potential target was isolated from tumor cell membrane extracts using affinity chromatography and further analyzed by a peptide mass fingerprint method (MALDI-MS). By this approach, we identified a human TAF15 protein with a molecular weight of approximately 78 kDa. In contrast to the wild-type TAF15 protein, this TAF15 variant is exclusively present in tumor cells and could not be detected in normal tissue. Immunohistochemical stainings revealed a coexistence of wild-type TAF15 and tumor-specific TAF15BARB-4 in malignant tissue suggesting a tumor-specific modification of BARB-4 antigen. Importantly, a carbohydrate as potential epitope, typical for natural IgM antibodies, could be excluded. Functional analyses demonstrated that BARB-4 inhibits proliferation of tumor cells and induces apoptosis. In addition, incubation of tumor cells with BARB-4 diminished cell adhesion and motility, which are crucial steps during formation of metastases. We applied additional assays to obtain more detailed information about the binding properties of the antibody. Specifically, immunofluorescence approaches confirmed binding of BARB-4 to the tumor cell surface and its subsequent internalisation by endocytosis. All these findings appear to be directly antibody-mediated effects. The characterization of the BARB-4 antibody and its target TAF15BARB-4 may lead to deeper insights into the function of the innate immune system. Moreover, the identification of a tumor-specific antibody offers novel opportunities for the diagnosis of malignant tumors and may foster the development of novel, antibody-based therapeutic approaches. Based on the exclusive expression of TAF15BARB-4 on tumor cell surface, BARB-4 enables the discrimination of malignant and normal tissues, and the expression of TAF15BARB-4 in various cancer entities might be the basis for the development of tumor-specific therapies. By arresting tumor cell adhesion and tumor cell motility, BARB-4 could be especially useful for the prevention of metastases in malignant tumors.

Tumor angiogenesis is essential for the growth of solid tumors as their proliferation and survival is dependent on consistent oxygen and nutrient supply. Anti-angiogenic treatments represent a therapeutic strategy to inhibit tumor growth by preventing the formation of new blood vessels leading to starvation of the tumor. One of the best characterized anti angiogenic therapeutics is the monoclonal antibody bevacizumab (Avastin), which targets and neutralizes VEGF leading to disruption of the VEGF signaling pathway. Until today, bevacizumab has found its way into clinical practice and has gained approval for treatment of different types of cancer including colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer and renal cell carcinoma. Signaling of VEGF is mediated through VEGF receptors, mainly VEGFR2, which are primarily located on the cell surface of endothelial cells. However, there has been evidence that expression of VEGF receptors can also be found on tumor cells themselves raising the possibility of autocrine and/or paracrine signaling loops. Thus, tumor cells could also benefit from VEGF signaling, which would promote tumor growth. The aim of this study was to investigate if bevacizumab has a direct effect on tumor cells in vitro. To this end, tumor cell lines from the NCI-60 panel derived from four different tumor types were treated with bevacizumab and angiogenic gene and protein expression as well as biological outputs including proliferation, migration and apoptosis were investigated. Most of the experiments were performed under hypoxia to mimic the in vivo state of tumors. Overall, there was a limited measurable effect of bevacizumab on treated tumor cell lines according to gene and protein expression changes as well as biological functions when compared to endothelial controls. Minor changes in terms of proliferation or gene regulation were evident in a single tumor cell line after VEGF-A blockade by bevacizumab, which partially demonstrated a direct effect on tumor cells. However, the overall analysis revealed that tumor cell lines are not intrinsically affected in an adverse manner by bevacizumab treatment. Besides the functional analysis of tumor cells, embryonic stem cell derived endothelial cells were characterized to delineate vascular Hey gene functions. Hey and Hes proteins are the best characterized downstream effectors of the evolutionary conserved Notch signaling pathway, which mainly act as transcriptional repressors regulating downstream target genes. Hey proteins play a crucial role in embryonic development as loss of Hey1 and Hey2 in mice in vivo leads to a severe vascular phenotype resulting in early embryonic lethality. The major aim of this part of the thesis was to identify vascular Hey target genes using embryonic stem cell derived endothelial cells utilizing a directed endothelial differentiation approach, as ES cells and their differentiation ability provide a powerful in vitro system to study developmental processes. To this end, Hey deficient and Hey wildtype embryonic stem cells were stably transfected with an antibiotic selection marker driven by an endothelial specific promoter, which allows selection for endothelial cells. ESC-derived endothelial cells exhibited typical endothelial characteristics as shown by marker gene expression, immunofluorescent staining and tube formation ability. In a second step, Hey deficient ES cells were stably transfected with doxycycline inducible Flag-tagged Hey1 and Hey2 transgenes to re-express Hey proteins in the respective cell line. RNA-Sequencing of Hey deficient and Hey overexpressing ES cells as well as ESC-derived endothelial cells revealed many Hey downstream target genes in ES cells and fewer target genes in endothelial cells. Hey1 and Hey2 more or less redundantly regulate target genes in ES cells, but some genes were regulated by Hey2 alone. According to Gene Ontology term analysis, Hey target genes are mainly involved in embryonic development and transcriptional regulation. However, the response of ESC-derived endothelial cells in regulating Hey downstream target genes was rather limited when compared to ES cells, which could be due to lower transgene expression in endothelial cells. The limited response also raises the possibility that target gene regulation in endothelial cells is not only dependent on Hey gene functions alone and thus loss or overexpression of Hey genes in this in vitro setting does not influence target gene regulation. / Tumorangiogenese ist essential für das Wachstum von Tumoren, da ihr Überleben und ihre Proliferation von einer dauerhaften Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen abhängig sind. Anti-angiogene Therapeutika inhibieren das Wachstum von Tumoren, indem sie die Bildung von neuen Blutgefäßen unterbinden, was zu einem „Verhungern“ des Tumors führt. Zu den am besten untersuchten anti-angiogenen Therapeutika gehört der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin), welcher den Wachstumsfaktor VEGF bindet und neutralisiert, was schließlich zu einer Unterbrechung des VEGF-Signalweges führt. Bevacizumab wird aktuell zur Behandlung verschiedener Tumortypen, unter anderem Colonkarzinom, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, Brustkrebs und Nierenzellkarzinom in der Praxis angewandt. VEGF bindet an VEGFR2 und andere VEGF-Rezeptoren, welche primär an der Oberfläche von Endothelzellen lokalisiert sind. Dennoch gibt es Hinweise, dass die Expression von VEGF-Rezeptoren nicht ausschließlich auf Endothelzellen begrenzt ist, sondern auch auf Tumorzellen nachgewiesen werden konnte. Die tumorale Expression von VEGF-Rezeptoren ermöglicht eine direkte autokrine und/oder parakrine Stimulation von Tumorzellen. Tumorzellen könnten dadurch selbst vom VEGF-Signalweg profitieren, was das Tumorwachstum fördern würde. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob Bevacizumab in vitro einen direkten Einfluss auf Tumorzellen ausübt. Dazu wurden verschiedene Tumorzelllinien von vier unterschiedlichen Tumortypen aus der NCI-60 Sammlung mit Bevacizumab behandelt und anschließend die Gen- und Proteinexpression von angiogenen Markern sowie biologische Funktionen wie Proliferation, Migration und Apoptose untersucht. Die Experimente wurden hauptsächlich unter Hypoxie durchgeführt, um den in vivo Status von Tumoren nachzuahmen. Insgesamt war ein direkter Effekt von Bevacizumab auf Tumorzellen im Vergleich zu Endothelzellen nicht nachweisbar. Gen- und Proteinexpression sowie biologische Funktionen waren in Tumorzellen nach Bevacizumab Behandlung bis auf wenige Ausnahmen unverändert. Geringe Veränderungen in der Proliferationsrate sowie in der Genregulation nach Inhibition von VEGF durch Bevacizumab konnten jeweils in einer einzelnen Zelllinie nachgewiesen werden, wodurch zumindest teilweise eine direkte Wirkung von Bevacizumab auf Tumorzellen gezeigt werden konnte. Dennoch zeigt die umfassende Analyse der verschiedenen Tumorzellen, dass die Bevacizumab-Behandlung sich insgesamt nicht negativ auf Tumorzellen auswirkt und diese nicht intrinsisch beeinflusst werden. Neben der funktionellen Analyse von Tumorzellen wurden Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen gewonnen wurden, charakterisiert, um anhand derer die Rolle der Hey Gene in der vaskulären Entwicklung näher zu bestimmen. Hey und Hes Proteine sind die am besten charakterisierten nachgeschalteten Effektoren des evolutionär konservierten Notch-Signalweges. Als Transkriptionsfaktoren sind Hey Proteine an der Regulation von Zielgenen beteiligt, wobei sie meist als transkriptionelle Repressoren fungieren. Hey Proteine spielen eine sehr wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, da der gemeinsame Verlust von Hey1 und Hey2 in Mäusen in vivo einen vaskulären Phenotyp hervorruft, der in sehr früher embryonaler Letalität endet. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, vaskuläre Hey Zielgene mit Hilfe von Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen differenziert wurden, zu identifizieren. Die Fähigkeit embryonaler Stammzellen verschiedene Zelltypen zu bilden, liefert dabei ein wertvolles in vitro System, um entwicklungsbiologische Prozesse zu analysieren. Dazu wurden Hey-defiziente und Hey-Wildtyp embryonale Stammzellen mit einem antibiotischen Selektionsmarker versehen, dessen Expression von einem Endothel spezifischen Promoter kontrolliert wird und daher die Selektion von Endothelzellen erlaubt. Die differenzierten Endothelzellen wiesen typische endotheliale Charakteristika auf, was durch Markergen-Expression, Immunfluoreszenzfärbungen und der Bildung netzwerkähnlicher Strukturen gezeigt werden konnte. In einem zweiten Schritt wurden Doxyzyklin-induzierbare Flag-markierte Hey1 bzw. Hey2 Konstrukte stabil in Hey-defiziente Zellen integriert, um Hey1 bzw. Hey2 kontrollierbar zu re-exprimieren. Die Zielgensuche mittels RNA-Seq Analyse lieferte viele Hey Zielgene in embryonalen Stammzellen, jedoch weitaus weniger Zielgene in ausdifferenzierten Endothelzellen. Zusammengefasst zeigten Hey1 und Hey2 eine redundante Regulation von Zielgenen in embryonalen Stammzellen, wobei einige wenige Gene alleine durch Hey2 reguliert wurden. Die Gen-Ontologie Analyse zeigte, dass diese Zielgene hauptsächlich an der embryonalen Entwicklung und der transkriptionellen Regulation von anderen Genen beteiligt sind. Dennoch war die Anzahl der Hey regulierten Gene in Endothelzellen weitaus geringer als in embryonalen Stammzellen. Das könnte auf eine geringere Transgen-Expression in Endothelzellen im Vergleich zu embryonalen Stammzellen zurückzuführen sein. Die weitaus geringere Anzahl an Hey Zielgenen in Endothelzellen lässt außerdem vermuten, dass die Regulation von Zielgenen in Endothelzellen nicht ausschließlich von der Funktion der Hey Gene abhängig ist. Die Regulation von Hey Zielgenen in Endothelien wurde durch den Verlust bzw. die Überexpression von Hey1 und Hey2 in dem angewandten in vitro System nur geringfügig beeinflusst.

Um eine Signaltransduktion mittels agnostischer Antikörper an Rezeptoren der TNFRSF zu bewirken, ist eine vorherige Immobilisation über des Fc Anteil des Antikörpers Grundvorraussetzung. In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit der Verankerung über eine andere Bindungsdomäne untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Immobilisation mittels scFv:CD70 zu einer starken Signalaktivierung führt. / In order to effect signal transduction by means of agnostic antibodies at receptors of TNFRSF, prior immobilization via the Fc part of the antibody is a basic requirement. In this thesis the possibility of anchoring via a different binding domain should be investigated. It could be shown that immobilization by means of scFv: CD70 leads to strong signal activation.

Background GDF-15 is a divergent member of the TGF-superfamily, which was first described as macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1), revealing an immune modulatory function. GDF-15 is a soluble protein which is, under physiological conditions, highly expressed in the placenta and found in elevated levels in blood sera of pregnant women. Apart from the placenta, GDF-15 is expressed in healthy tissue, albeit to a lower extent and overexpressed in many solid tumors. A variety of different functions are attributed to GDF-15 in healthy as well as diseased humans. On the one hand, GDF-15 is required for successful pregnancy and low GDF-15 serum levels during pregnancy correlate with fetal abortion. On the other hand, overexpression of GDF-15, which can be observed in several malignancies is correlated with a poor prognosis. Furthermore, tumor derived GDF-15 leads to cancer associated anorexia-cachexia syndrome in mice. The aim of my PhD thesis was to further investigate the role of GDF-15 as an immune modulatory factor in cancer, in particular, by inhibiting the target molecule in vitro and in vivo. Therefore, the main focus was placed on the generation and characterization of monoclonal GDF-15 specific blocking antibodies, which were tested in vitro and in vivo, which represents a substantial part of my work. Results Here, GDF-15 was shown to be highly expressed in human gynecological cancer and brain tumors. We could then demonstrate that GDF-15 modulates effector immune cells in vitro. GDF-15 mediated a slight downregulation of the activating NKG2D receptor on NK and CD8+ T cells, which is crucial for proper anti-tumoral immune responses. Furthermore, we could demonstrate that GDF-15 reduces the adhesion of CD4+ and CD8+ T cells on endothelial cells in vitro. A negatively affected trans-endothelial migration of leukocytes into inflamed tissue could explain the low T cell infiltration in GDF-15 expressing tumors, which were observed in vivo, where mice bearing (shRNA mediated) GDF-15 deficient glioma cells revealed enhanced immune cell infiltrates in the tumor microenvironment, compared with the GDF-15 expressing control group. Those animals further exhibited a decreased tumor growth and prolonged survival. GDF-15 is a soluble protein, secreted by more than 50 % of solid tumors and associated with grade of malignancy. Therefore a neutralizing monoclonal antibody to GDF-15 was assumed to be an auspicious therapeutically anti-cancer tool. Such an antibody was thus generated in GDF-15 knock out mice against human GFD-15. Amongst many clones, the GDF-15 antibody clone B1-23 was found to be applicable in Western Blot as well as in ELISA techniques, detecting a three-dimensional epitope of the mature GDF-15 dimer with high affinity and specificity. To enable the humanization for a later administration in humans, the variable regions of antibody B1-23 were identified by a special PCR method using degenerate primers and cloned into a sequencing vector. The sequence obtained thereby enabled the generation of chimeric and humanized B1-23 variants. After further comprehensive characterization, the original mouse antibody B1-23 as well as the chimeric antibody (ChimB1-23) and the humanized B1-23 antibody (H1L5) were applied in a melanoma xenograft study in vivo. None of the antibodies could significantly inhibit tumor growth. .However of utmost importance, body weight loss mediated by tumor derived GDF-15 could be significantly prevented upon administration of all three GDF-15 specific antibodies, which confirmed the antagonizing functionality of the immunoglobulin. Conclusion GDF-15 is a promising cancer target, involved in tumor progression and cancer related cachexia. A monoclonal GDF-15 antibody was generated, which served on one hand as a tool for molecular biological applications (Western Blot, ELISA, etc.) and on the other hand was applied as an antagonizing antibody in vitro and in vivo. Even though tumor growth inhibition by GDF-15 depletion in T cell deficient athymic mice failed using B1-23, the same antibody and derivates thereof (chimeric and humanized) impressively prevented tumor associated cachexia in UACC-257 melanoma bearing nude mice. The missing anti-tumor effect in our own melanoma model in nude mice can only partially be explained by the missing secondary immunity, in particular cytotoxic T cells, in the athymic animals, since in a similar melanoma model, performed by an external company, a tumor reduction in immunocompromised animals was observed, when B1-23 was administered. These findings support the idea that T cells are substantial for an effective tumor immunity and are in line with the results of the syngeneic, T cell comprising, mouse glioma model, where silencing of tumor expressed GDF-15 led to an enhanced intratumoral T cell infiltration and a prolonged survival. Taken together our data allow for the conclusion that tumor associated cachexia can be combatted with the GDF-15 antibody B1-23. Further, B1-23 might elicit direct anti-tumor effects in immune competent models, which contain T cells, rather than in an athymic, T cell deficient nude mouse model. / Hintergrund GDF-15 ist ein divergentes Mitglied der TGF-Superfamilie, welches zuerst als „macrophage inhibitory cytokine-1“ (MIC-1) mit immunmodulatorischen Eigenschaften beschrieben wurde. GDF-15 ist ein lösliches Protein, das unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich in der Plazenta exprimiert wird und welches im Serum von Schwangeren in erhöhten Konzentrationen nachgewiesen werden kann. Mit Ausnahme der Plazenta wird GDF-15 in verschiedenen gesunden Geweben gefunden, hier jedoch in deutlich niedrigeren Konzentrationen, und ist in vielen soliden Tumoren überexprimiert. GDF-15 werden sowohl bei gesunden, als auch bei kranken Menschen, unterschiedlichste Funktionen zugeschrieben. Zum einen ist GDF-15 für eine erfolgreiche Schwangerschaft notwendig. Niedrige GDF-15 Spiegel im Serum während der Schwangerschaft korrelieren mit dem Verlust des Fötus. Zum anderen korreliert die Überexpression von GDF-15, welche bei unterschiedlichen Malignitäten beobachtet werden kann, mit einer schlechten Prognose. Darüber hinaus verursacht das von Tumorzellen sezernierte GDF-15 das sogenannte „Anorexie-Kachexie Syndrom“ in Mäusen. Das Ziel meiner Arbeit war es, die immunmodulatorische Funktion von GDF-15 im Tumorkontext zu untersuchen, insbesondere durch eine Hemmung des Zielmoleküls in vitro und in vivo. Aus diesem Grund wurde der Schwerpunkt auf die Generierung und Charakterisierung monoklonaler, GDF-15 spezifischer, blockierender Antikörper gelegt. Diese wurden sowohl in vitro als auch in vivo getestet, was einen großen Teil dieser Arbeit darstellt. Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass GDF-15 in humanen gynäkologischen Tumoren wie auch in Hirntumoren überexprimiert ist. Weiterhin ließ sich zeigen, dass GDF-15 Effektorzellen des Immunsystems in vitro moduliert. Dabei verursacht GDF-15 eine moderate Herunterregulation des aktivierenden Killing Rezeptors NKG2D auf NK und CD8+ T Zellen, welcher eine hohe Bedeutung für eine effektive anti-tumorale Immunantwort hat. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass GDF-15 die Adhäsion von CD4+ und CD8+ T Zellen auf Endothelzellen in vitro herabsetzt. Eine daraus resultierende Reduktion der trans-endothelialen Migration von Leukozyten in entzündetes Gewebe erklärt möglicherweise die niedrige T Zell Infiltration in GDF-15 exprimierenden Tumoren, welche in vivo beobachtet werden konnten. Mäuse, denen (auf shRNA basierende) GDF-15-defiziente Gliomzellen appliziert wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche GDF-15-exprimierenden Gliomzellen erhalten hatte, ein verlängertes Überleben, vermindertes Tumorwachstum und eine erhöhte Immunzellinfiltration in das Tumormikromillieu. GDF-15 ist ein lösliches Protein, das von mehr als 50 % aller soliden Tumore sezerniert wird und mit dem Grad der Malignität korreliert. Daher wurde postuliert, dass ein neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen GDF-15 eine effektive neue Antikrebstherapie ermöglichen sollte. Solch ein Antikörper wurde entsprechend in GDF-15-defizienten Mäusen generiert. Unter verschiedenen Klonen wurde der Antikörper Klon B1-23 identifiziert, welcher sowohl im Western Blot als auch im ELISA anwendbar ist. Dieser Klon detektiert ein drei-dimensionales Epitop des maturen GDF-15 Dimers mit hoher Affinität und Spezifität. Um den Antikörper für eine spätere Anwendung im Menschen humanisieren zu können, wurden die variablen Regionen des Klons B1-23 durch eine spezielle PCR Methode unter Verwendung degenerierter Primer und nachfolgender Klonierung in einen Sequenzierungsvektor identifiziert. Die hierdurch gewonnenen Sequenzen ermöglichten die Generierung von chimären und humanisierten Varianten von B1-23. Nach anschließender intensiver Charakterisierung konnte sowohl der ursprüngliche Maus-Antikörper B1-23 als auch der chimäre B1-23 Antikörper (ChimB1-23) und der humanisierte B1-23 Antikörper (H1L5) in einer Melanom Xenograft Studie in vivo getestet werden. Zwar ließ sich mit keinem der Antikörper eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums beobachten. Als herausragendes Ergebnis zeigte sich allerdings, dass der durch GDF-15 induzierte Gewichtsverlust signifikant durch die Verabreichung der GDF-15 spezifischen Antikörper verhindert werden konnte, was die antagonisierende Funktionalität des entwickelten Immunglobulins bestätigte. Schlussfolgerung GDF-15 ist ein vielversprechendes Zielmolekül bei Krebserkrankungen, welches bei der Tumorprogression und Tumor-assoziierter Kachexie beteiligt ist. Es konnte ein monoklonaler Anti-GDF-15 Antikörper generiert werden, welcher zum einen molekularbiologisch zum Einsatz kam (z.B. Western Blot, ELISA, etc.) und zum anderen als antagonisierender Antikörper sowohl in vitro als auch in vivo Anwendung fand. Auch wenn B1-23 scheinbar keine Tumorwachstumshemmung durch die Depletion von GDF-15 in T Zell defizienten athymischen Mäusen zeigte, konnte derselbe Antikörper wie auch die abgeleiteten Varianten (chimärisiert und humanisiert) eindrücklich die Tumor assoziierte Kachexie im UACC-257 Melanom Modell verhindern. Der ausgebliebene antitumorale Effekt in unserem Melanom Modell in Nacktmäusen lässt sich nur zum Teil durch eine fehlende sekundäre Immunkomponente, insbesondere das Fehlen zytotoxischer T Zellen, erklären, da es in einem ähnlichen Xenograft Melanom Modell, welches in Auftragsforschung (CRO) durchgeführt wurde, zu einer Reduktion des Tumorwachstums durch die Applikation von B1-23 kam. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass T Zellen unerlässlich für eine effektive antitumorale Antwort sind, eine Annahme, die durch die Ergebnisse des syngenen Gliom Maus-Modells unterstützt wird, in welchem es durch das Ausschalten von Tumor produziertem GDF-15 zu einer erhöhten intratumoralen T Zell Infiltration und einem längeren Überleben kam. Zusammengenommen erlauben uns diese Daten den Schluss, dass eine tumorbedingte Kachexie durch den GDF-15-Antikörper B1-23 bekämpft werden kann. Allerdings sind direkte B1-23 vermittelte antitumorale Effekte eher in immunkompetenten Modellen mit T Zellen als in einem athymischen, T Zell defizienten Nacktmaus-Modell zu erwarten.

Es sollten Checkpoint inhibierende anti-TNFRSF Rezeptor Antikörper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert werden. Die agonistische Aktivität TNFR-spezifischer Antikörper wird maßgeblich durch eine Immobilisation über Fcγ-Rezeptoren beeinflusst. In dieser Arbeit erfolgte die Immobilisation der Antikörper-Fusionsproteine über den PD-L1. In funktionellen Assays konnte eine Aktivitätssteigerung der TNFR-spezifischen Domänen mittels PD-L1 vermittelter Immobilisation gezeigt werden. / Checkpoint inhibiting anti-TNFRSF receptor antibody fusion proteins should be prepared and characterized. The agonistic activity of TNFR-specific antibodies is significantly influenced by immobilization via Fcγ receptors. In this work, immobilization of the antibody fusion proteins was performed via the PD-L1. Functional assays revealed an increase in activity of TNFR-specific domains using PD-L1-mediated immobilization.