Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-05-03T14:46:00Z No. of bitstreams: 1 Ellen Leal Clementino.pdf: 1364888 bytes, checksum: 1a3b7cf184f74c3f95b093c74e973c3a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-03T14:46:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ellen Leal Clementino.pdf: 1364888 bytes, checksum: 1a3b7cf184f74c3f95b093c74e973c3a (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / The fibrinolytic proteases, due to its potential use in the treatment of thrombosis, have drawn attention from researchers because such diseases are a leading cause of death worldwide. The objective of this research was to produce and extract simultaneously the fibrinolytic protease by Mucor subtilissimus UCP 1262 through extractive fermentation with PEG/sodium sulfate. Homogeneous fermentations were carried out by changing the nitrogen source (soybean flour or wheat -1%), carbon source with 1% glucose, agitation 120 rpm and 30°C. Extractive fermentation assays were made using a 23 factorial design, changing the PEG molar mass (4,000, 6,000 and 8,000 g/mol), the PEG concentration (18, 24 and 30%) and salt concentration (10; 11,5; 13%). After 72 hours fermentation, the fibrinolytic protease had its best output in soy flour obtaining 13.43 U/mL and specific activity 749.27 U/mg in homogeneous cultures. However in the extractive fermentation, the sodium sulfate rich phase showed 15.40 U/mL fibrinolytic activity and 34.17 U/mg for specific activity in the assay comprises of sodium sulphate concentration (10%) and PEG (18%) and PEG molar mass (8000g/mol) and yields (Y) of 80% of the fibrinolytic protease. The protease has a pH optimum between 7.0 and stability pH 6.0 to 8.5 and optimum temperature 50°C, stable between 10°C to 50°C. It has similar specificity to chymotrypsin enzyme it has been classified as a serine protease having molecular weight of 52-kDa. Thus it was possible to pre-purify the fibrinolytic protease having a low cost process and considerably faster when compared to other isolated production and purification techniques by replacing the initial stages of conventional separation processes. / As proteases fibrinolíticas, em virtude do seu potencial para uso no tratamento de trombose, têm chamado a atenção de pesquisadores, pois tal doença é uma das principais causas de morte no mundo. O objetivo desta pesquisa foi produzir e extrair de forma integrada a protease fibrinolítica por Mucor subtilissimus UCP 1262 através de fermentação extrativa utlilizandoSistema de Duas Fases Aquosas (SDFA) PEG/Sulfato de sódio. Foram realizadas fermentações homogêneas alterando a fonte de nitrogênio (farinha de soja ou trigo - 1%), fonte de carbono com 1% de glicose, agitação de 120 rpm e temperatura de 30°C. Os ensaios das fermentações extrativas foram constituídos através de um planejamento fatorial 23, modificando a massa molar do PEG (4000, 6000 e 8000 g/mol), concentração do PEG (18, 24 e 30%) e concentração do sal (10; 11,5 e 13%). Após 72 horas de fermentação, a protease fibrinolítica teve sua melhor produção na farinha de soja obtendo 13,43 U/mL e com atividade específica de 749,27 U/mg em cultivos homogêneos. No entanto na fermentação extrativa, a fase rica em sulfato de sódio apresentou 15,40 U/mL de atividade fibrinolítica e 34,17 U/mg de atividade específica no ensaio composto por concentração de sulfato de sódio (10%) e de PEG (18%) e massa molar do PEG (8000 g/mol), tendo recuperação (Y) de 80% da protease fibrinolítica. A protease tem pH ótimo 7,0 e estabilidade entre os valores de pH 6,0 e 8,5, e temperatura ótima aos 50°C, sendo estável entre 10°C a 50°C. Tem especificidade semelhante à enzima quimiotripsina e foi classificada como uma serino protease, apresentando massa molar de 52kDa. Deste modo foi possível pré-purificar a protease fibrinolítica com um processo de baixo custo e de considerável rapidez quando comparado a outras técnicas de produção e purificação isoladas substituindo etapas iniciais de processos de separação convencionais.

As doenças cardiovasculares (DCVs) são um grupo de desordens do coração e dos vasos sanguíneos capazes de causar ataques cardíacos e acidentes vasculares cerebrais, eventos geralmente agudos oriundos principalmente de bloqueios que impedem o sangue de fluir para o coração ou o cérebro. Proteases fibrinolíticas são agentes que degradam a fibrina, principal componente de trombo sanguíneo, capazes de evitar e tratar DCVs. Fungos filamentosos têm se mostrado uma boa alternativa para a produção de enzimas fibrinolíticas, dentre esses os fungos da divisão dos zigomicetos. A cepa UCP 1262 do zigomiceto Mucor subtilissimus foi estudada com o objetivo geral de produzir protease com atividade fibrinolítica com base em trabalhos publicados em fermentação em estado sólido (FES) e cultivo submerso com a mesma cepa. Foram realizados cultivos submersos desta cepa em frascos agitados e em 2 diferentes biorreatores, com determinação da cinética de crescimento, consumo de glicose e produção de enzima. O meio utilizado foi o MS-2, com farelo de trigo como fonte de nitrogênio e glicose como fonte preferencial de carbono. A FES com a mesma fonte de nitrogênio e o cultivo submerso em diferentes condições de taxa de inóculo, pH e agitação deste estudo foram comparados, assim como duas metodologias diferentes para dosagem de concentração de biomassa, gravimetria e ergosterol. As maiores concentrações de atividade fibrinolítica e produtividade volumétrica obtidas foram de, respectivamente, 12,0 U/mL e 0,22 U/(mL.h), 92% e 89% menores, respectivamente, do que o valor reportado em FES. O valor de ?Xmax foi calculado com base no perfil de biomassa, glicose e produção de CO2 e não apresentou correlação com a produção da enzima. A maior simplicidade operacional e os dados de rendimento obtidos indicam que a FES é uma alternativa melhor para a produção dessa enzima com esta cepa. O zigomiceto Mucor subtilissimus demonstrou ser muito difícil de ser cultivado em sistemas submersos com o meio MS-2, em especial pela sua morfologia e aderência ao biorreator. / Cardiovascular diseases (CVDs) are a group of heart and blood vessels disorders capable of causing heart attacks and strokes, usually acute events caused mainly by blockages that prevent blood from flowing to the heart and brain. Fibrinolytic proteases are agents that degrade fibrin, the major component of blood thrombus. Filamentous fungi were shown to be a good alternative for the production of fibrinolytic enzymes, among them fungi of the zygomycetes division. The UCP 1262 strain of the zygomycete Mucor subtilissimus was studied with the general objective of producing protease with fibrinolytic activity based on published works on solid state fermentation (SSF) and submerged culture with the same strain. Submerged cultures of this strain were carried out in shaken flasks and in 2 different bioreactors, with determination of growth kinetics, glucose consumption and enzyme production. The medium used was MS-2, with wheat bran as the nitrogen source and glucose as the preferred carbon source. The SSF with the same nitrogen source and the submerged culture under different inoculum ratios, pH and agitation conditions of this study were compared, as well as two different methodologies for biomass, gravimetry and ergosterol dosage. The highest concentration of fibrinolytic activity and volumetric productivity obtained were, respectively, 12.0 U/mL and 0.22 U/(mL.h), 92% and 89% lower, respectively, than the value reported in SSF. The value of ?Xmax was calculated based on the biomass concentration, glucose and CO2 production profile and showed no correlation with the enzyme production. The greater operational simplicity and yield data obtained indicate that SSF is a better alternative for the production of this enzyme with this strain. The zygomycete Mucor subtilissimus showed to be very difficult to cultivate in submerged culture with the MS-2 medium, especially for its morphology and adherence to the bioreactor.

As doenças cardiovasculares (DCVs) são um grupo de desordens do coração e dos vasos sanguíneos capazes de causar ataques cardíacos e acidentes vasculares cerebrais, eventos geralmente agudos oriundos principalmente de bloqueios que impedem o sangue de fluir para o coração ou o cérebro. Proteases fibrinolíticas são agentes que degradam a fibrina, principal componente de trombo sanguíneo, capazes de evitar e tratar DCVs. Fungos filamentosos têm se mostrado uma boa alternativa para a produção de enzimas fibrinolíticas, dentre esses os fungos da divisão dos zigomicetos. A cepa UCP 1262 do zigomiceto Mucor subtilissimus foi estudada com o objetivo geral de produzir protease com atividade fibrinolítica com base em trabalhos publicados em fermentação em estado sólido (FES) e cultivo submerso com a mesma cepa. Foram realizados cultivos submersos desta cepa em frascos agitados e em 2 diferentes biorreatores, com determinação da cinética de crescimento, consumo de glicose e produção de enzima. O meio utilizado foi o MS-2, com farelo de trigo como fonte de nitrogênio e glicose como fonte preferencial de carbono. A FES com a mesma fonte de nitrogênio e o cultivo submerso em diferentes condições de taxa de inóculo, pH e agitação deste estudo foram comparados, assim como duas metodologias diferentes para dosagem de concentração de biomassa, gravimetria e ergosterol. As maiores concentrações de atividade fibrinolítica e produtividade volumétrica obtidas foram de, respectivamente, 12,0 U/mL e 0,22 U/(mL.h), 92% e 89% menores, respectivamente, do que o valor reportado em FES. O valor de ?Xmax foi calculado com base no perfil de biomassa, glicose e produção de CO2 e não apresentou correlação com a produção da enzima. A maior simplicidade operacional e os dados de rendimento obtidos indicam que a FES é uma alternativa melhor para a produção dessa enzima com esta cepa. O zigomiceto Mucor subtilissimus demonstrou ser muito difícil de ser cultivado em sistemas submersos com o meio MS-2, em especial pela sua morfologia e aderência ao biorreator. / Cardiovascular diseases (CVDs) are a group of heart and blood vessels disorders capable of causing heart attacks and strokes, usually acute events caused mainly by blockages that prevent blood from flowing to the heart and brain. Fibrinolytic proteases are agents that degrade fibrin, the major component of blood thrombus. Filamentous fungi were shown to be a good alternative for the production of fibrinolytic enzymes, among them fungi of the zygomycetes division. The UCP 1262 strain of the zygomycete Mucor subtilissimus was studied with the general objective of producing protease with fibrinolytic activity based on published works on solid state fermentation (SSF) and submerged culture with the same strain. Submerged cultures of this strain were carried out in shaken flasks and in 2 different bioreactors, with determination of growth kinetics, glucose consumption and enzyme production. The medium used was MS-2, with wheat bran as the nitrogen source and glucose as the preferred carbon source. The SSF with the same nitrogen source and the submerged culture under different inoculum ratios, pH and agitation conditions of this study were compared, as well as two different methodologies for biomass, gravimetry and ergosterol dosage. The highest concentration of fibrinolytic activity and volumetric productivity obtained were, respectively, 12.0 U/mL and 0.22 U/(mL.h), 92% and 89% lower, respectively, than the value reported in SSF. The value of ?Xmax was calculated based on the biomass concentration, glucose and CO2 production profile and showed no correlation with the enzyme production. The greater operational simplicity and yield data obtained indicate that SSF is a better alternative for the production of this enzyme with this strain. The zygomycete Mucor subtilissimus showed to be very difficult to cultivate in submerged culture with the MS-2 medium, especially for its morphology and adherence to the bioreactor.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-28T13:17:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO.pdf: 1904426 bytes, checksum: 881aba48363b69adb462f39f38edbbe8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-28T13:17:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO.pdf: 1904426 bytes, checksum: 881aba48363b69adb462f39f38edbbe8 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / As proteases são enzimas com a capacidade de hidrolisar proteínas em peptídeos menores ou aminoácidos livres, sendo essenciais para animais, plantas e micro-organismos devido à sua atuação na regulação metabólica. As proteases são utilizadas com diversas finalidades, no processo industrial da fabricação de detergentes, na indústria farmacêutica e de alimentos, além de ser utilizada na recuperação e aproveitamento de resíduos e subprodutos. Em virtude da grande importância das proteases este trabalho teve como objetivo comparar a produção de proteases produzidas por Mucor subtilissimus UCP 1262 em fermentação em estado sólido (FES) e submersa (FS), bem como extrair em Sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/Fosfato, as colagenases oriundas de ambas as fermentações. O meio de produção da FES e FS no qual o micro-organismo foi cultivado era constituído principalmente de farelo de soja e farinha de soja. As determinações enzimáticas e dosagem proteica foram realizadas após 72h de fermentação. Para montagem do SDFA foram realizados dois planejamentos fatoriais 23, o primeiro planejamento foi realizado com amostras da FES e o segundo com amostras da FS. Neste sistema foi analisada a influência de três variáveis no processo de extração: massa molar do PEG (200, 550 e 1000 g/mol), concentração do PEG (17,5; 20 e 22,5%) e concentração do sal fosfato de sódio (15; 17,5 e 20%). A maior produção de proteases (362,66 U/ml) ocorreu na FES, enquanto que na FS obteve-se apenas 26,33 U/ml. Dentre as atividades proteásicas específicas: colagenolítica, fibrinolítica e queratinolítica, os melhores resultados foram obtidos para a atividade colagenolítica, sendo esta de: 179,81 U/ml, em FES. A colagenase presente no extrato bruto obtida nos processos fermentativos foram particionadas para fase rica em PEG do SDFA. O maior valor para a variável resposta Fator de purificação (FP=3,49) foi obtido no sistema que utilizou o extrato obtido por FES. Com base nas condições estudadas, os dois sistemas mostraram-se viáveis para a extração de colagenase, pois além de ser um processo que pode ser utilizado em larga escala é constituído por componentes de baixo custo e as condições utilizadas no SDFA favoreceram a extração desta enzima. Todavia, a extração da colagenase oriunda da FES foi mais promissora em virtude da maior concentração da enzima de interesse encontrada nesse tipo de fermentação. / Proteases are enzymes with the ability to hydrolyze proteins into smaller peptides and free amino acids. They are vital for animals, plants and micro-organisms due to their role in metabolic regulation. Proteases have been used in various purposes, in the industrial process of detergents, pharmaceutical and food industry, as well as being used in the recovery and utilization of waste and by-products. Due to their economic feasibility and great medical and farmaceutical importance this study aimed to compare the production of proteases produced by Mucor subtilissimus UCP 1262 in solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SF) as well as extract collagenolytic proteases using Aqueous two-phase system (ATPS) -PEG/Phosphate from both fermentations. The medium composition for the fungal fermentation in SSF and SF was based in soybean flour. Enzymatic determinations and protein levels were performed after 72 hours of fermentation. To mount the ATPS were two 23 factorial design, the first planning was carried out with samples of SSF and the second with samples of SF. In this system was analyzed the influence of three variables in the extraction process: PEG molar mass (200, 550 and 1000), the PEG concentration (17,5; 22,5 and 20%) and sodium phosphate salt concentration (15; 17,5 and 20%). The higher proteolytic activity (362,66 U/ml) was produced using SSF, while in the FS was obtained 26,33 U/ml. Among the specific proteolytic activities: collagenolytic, fibrinolytic and keratinolytic, the best results were obtained for the collagenolytic activity, this being: 179,81 U / ml in the SSF. The Collagenase present in the crude extract obtained in the fermentative processes partitioned preferencially to the PEG-rich phase. The highest value for the variable response Purification Factor (PF = 3,49) was obtained in the system that used SSF crude extract. According with the showed results, both extraction systems seemed to be feasible for collagenase extraction, as well as being a process that can be used in large scale, constituted by low cost components and conditions used in this ATPS favored the enzyme extraction. Furthermore, the collagenase extraction from the SSF was more promising because of the higher interest enzyme concentration found in this type of fermentation.