Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines SREBP-1, Sterol Response Element Binding Proteins, sont des régulateurs clés du métabolisme des lipides et du cholestérol. A ce titre, ils ont été largement étudiés dans le foie et le tissu adipeux. Les facteurs SREBP-1 sont également exprimés dans le muscle squelettique au sein duquel ils sont les principaux médiateurs des effets géniques de l'insuline.Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont eu pour but de définir le rôle spécifique de SREBP-1 dans le muscle squelettique. L'étude transcriptomique de cellules musculaires humaines révèle plus de1500 gènes régulés par SREBP-1 dans le muscle squelettique humain, dont la moitié est réprimée. L'analyse fonctionnelle de ces gènes révèle l'implication de SREBP-1 dans des fonctions musculaires dépassant la cadre du métabolisme glucido-lipidique. Ainsi, SREBP-1 inhibe l'expression de plusieurs gènes impliqués dans la différenciation et le maintien du phénotype musculaire. En conséquence, la sur expression de SREBP-1 bloque la différenciation myogénique in vitro et induit une atrophie marquée in vitro, sur des myotubes différenciés et in Vivo, dans le muscle squelettique de souris.En parallèle, deux répresseurs transcriptionnels : BHLHB2 et BHLHB3 apparaissent, après étude de leur promoteur, comme deux nouvelles cibles directes de SREBP-1. Ainsi, 20% des gènes inhibés par SREBP-1sont des cibles de BHLHB2 et BHLHB3, de nombreux gènes muscle-spécifiques y compris. De plus, BHLHB2 apparaît, de la même façon que SREBP-1, comme un acteur essentiel dans l'action de l'insuline sur le muscle squelettique, et dans le développement de l'insulino-résistance musculaire chez les patients diabétiques de type2.Le blocage de la différenciation myogénique et l'atrophie induite par SREBP-1 in vitro étant reversées par l'inhibition de l'expression de BHLHB2 et BHLHB3, nous concluons que BHLHB2 et BHLHB3 sont responsables de l'effet répressif de SREBP-1 sur le phénotype musculaire.Ces résultats mettent donc en évidence un nouveau rôle pour les facteurs SREBP-1 dans la régulation de la myogenèse et le maintien de la masse musculaire. SREBP-1 intègrent ainsi la régulation métabolique au contrôle du phénotype musculaire

La phospholipase D (PLD) hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes cellulaires, libérant le messager acide phosphatidique. La capacité de la PLD à influer sur la voie de signalisation de mTOR, acteur central dans le contrôle du tissu musculaire, nous a incités à étudier son rôle dans ce tissu. Mes travaux de thèse ont pour but d'étudier les mécanismes par lesquels la PLD intervient dans la différenciation myogénique et dans la régulation de la masse musculaire. Dans un premier temps, nous avons montré que le contrôle de la différenciation des myoblastes L6 par la PLD met en jeu l'activation des deux complexes de mTOR (mTORC1 et mTORC2). mTORC2 active la différenciation, probablement via son effecteur PKCalpha, alors que mTORC1 la réprime via son effecteur S6K1, en induisant la phosphorylation de rictor, un composant de mTORC2, et l'inhibition de ce complexe. Nous avons par ailleurs montré que l'extinction de PLD par interférence de I'ARN induit l'atrophie de myotubes L6 en culture, ainsi qu'une baisse de la phosphorylation de S6K1 et 4E-BP1, effecteurs de mTORC1. Inversement, la surexpression de PLD à l'aide de vecteurs adénoviraux induit une hypertrophie des myotubes, associée à une activation de la voie mTORC1, et de Akt, effecteur de mTORC2. De plus, la surexpression de PLD atténue l'atrophie induite par la dexaméthasone. Ces résultats mettent en évidence un rôle hypertrophique et anti-atrophique de la PLD, qui pourrait s'exercer par stimulation de la voie mTOR. Nos résultats suggèrent que la PLD est susceptible de jouer un rôle clé dans le muscle squelettique, en agissant tant au niveau de la régénération du tissu qu'au niveau de la régulation de sa masse.

La myogénèse est un processus multi-étapes hautement régulé impliquant la prolifération et la différenciation de myoblastes. Bien que la myogenèse ait été largement décrite, les mécanismes de régulation qui régissent ce processus complexe sont encore mal connus, notamment les réseaux de gènes et les interactions potentielles entre les voies de signalisation impliquées. Afin d'identifier de nouveaux gènes jouant un rôle dans la différenciation myogénique, j’ai mis en place un nouveau protocole in vitro, basé sur la lignée myoblastique C2C12, l’utilisation de l’ARN interférence et l'analyse quantitative d'images d'une grande quantité de myoblastes différenciés. J’ai pu inactiver une centaine de gènes et par une analyse quantitative de la densité cellulaire, de la quantité de myotubes, de la morphologie du myotube et de l'indice de fusion, j’ai pu montrer que six gènes parmi les 100 sont impliqués à la fois dans la prolifération et la différenciation des cellules C2C12 et 13 gènes jouant un rôle uniquement dans l’étape de différenciation. Nos résultats montrent que notre crible peut être un outil efficace pour détecter aussi bien les phénotypes subtils permettant l'identification de nouveaux régulateurs myogéniques chez les mammifères. / Myogenesis is a highly regulated multi-step process involving myoblast proliferation and differentiation. Although studies over the last decades have identified several factors governing these distinct major phases, many of them are not yet known. In order to identify novel genes, we took advantage of the C2C12 myoblastic line to establish a functional siRNA screen combined with quantitative-imaging analysis of a large amount of differentiated myoblasts. We knocked down 100 mouse-preselected genes without a previously characterized role in muscle. Using image analysis, we tracked gene-silencing phenotypes by quantitative assessment of cellular density, myotube quantity, myotube morphology and fusion index. Our results have revealed six genes involved in both stages of C1C12 myogenesis and 13 genes specific to the differentiation stage. These findings prove that our RNAi-based screen could be an efficient tool to detect clear and subtle phenotypes allowing the identification of new myogenic regulators in Mammals.

La phospholipase D (PLD) hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes cellulaires, libérant le messager acide phosphatidique. La capacité de la PLD à influer sur la voie de signalisation de mTOR, acteur central dans le contrôle du tissu musculaire, nous a incités à étudier son rôle dans ce tissu. Mes travaux de thèse ont pour but d'étudier les mécanismes par lesquels la PLD intervient dans la différenciation myogénique et dans la régulation de la masse musculaire. Dans un premier temps, nous avons montré que le contrôle de la différenciation des myoblastes L6 par la PLD met en jeu l'activation des deux complexes de mTOR (mTORC1 et mTORC2). mTORC2 active la différenciation, probablement via son effecteur PKCalpha, alors que mTORC1 la réprime via son effecteur S6K1, en induisant la phosphorylation de rictor, un composant de mTORC2, et l'inhibition de ce complexe. Nous avons par ailleurs montré que l'extinction de PLD par interférence de I'ARN induit l'atrophie de myotubes L6 en culture, ainsi qu'une baisse de la phosphorylation de S6K1 et 4E-BP1, effecteurs de mTORC1. Inversement, la surexpression de PLD à l'aide de vecteurs adénoviraux induit une hypertrophie des myotubes, associée à une activation de la voie mTORC1, et de Akt, effecteur de mTORC2. De plus, la surexpression de PLD atténue l'atrophie induite par la dexaméthasone. Ces résultats mettent en évidence un rôle hypertrophique et anti-atrophique de la PLD, qui pourrait s'exercer par stimulation de la voie mTOR. Nos résultats suggèrent que la PLD est susceptible de jouer un rôle clé dans le muscle squelettique, en agissant tant au niveau de la régénération du tissu qu'au niveau de la régulation de sa masse. / Phospholipase D (PLD) hydrolyzes phosphatidylcholine of cell membranes, releasing the lipid messenger phosphatidic acid. The ability of PLD to affect mTOR signaling pathway, a central actor in the control of muscle tissue, prompted us to study its role in this tissue. My thesis aims at investigating how PLD is involved in myogenic differentiation, and how it regulates muscle mass. We first showed that the mechanism by which PLD controls differentiation of L6 myoblasts involves the activation of the two mTOR complexes (mTORC1 and mTORC2). mTORC2 activates differentiation, probably via its effector PKCalpha, whereas mTORC1 represses differentiation via its effector S6K1, by inducing the phosphorylation of Rictor, a component of mTORC2, and the inhibition of this complex. Besides, we showed that extinction of PLD by RNA interference induces the atrophy of L6 myotubes, and decreases the phosphorylation of the mTORC1 effectors S6K1 and 4E-BP1. Conversely, overexpression of PLD using adenoviral vectors induces the hypertrophy of myotubes and the activation of both mTORC1 pathway and the mTORC2 effector Akt. Furthermore, PLD overexpression attenuates atrophy induced by dexamethasone. These results highlight a hypertrophic and anti-atrophic role of PLD, which could be achieved through stimulation of the mTOR pathway. Our results suggest that PLD is likely to play a key role in skeletal muscle homeostasis, by acting at both the tissue regeneration and mass regulation levels.

Les ARN hélicases DDX5 et DDX17 sont des protéines " multi-tâches ", elles sont impliquées dans de nombreuses étapes de la régulation du métabolisme des ARNs dont la transcription, l'épissage et la dégradation des ARNs. Lors de processus biologiques complexes tels que la myogénèse, les programmes d'expression génique sont profondément modifiés. Durant mon travail de thèse, j'ai contribué à montrer que DDX5 et DDX17 sont des protéines orchestratrices de la différenciation en coordonnant de manière directe et dynamique plusieurs niveaux de régulation génique. DDX5 et DDX17 contrôlent l'activité du facteur de transcription MyoD, régulateur majeur de la myogénèse ainsi que des microARNs spécifiques du muscle miR-1 et miR-206. Ceux-ci ciblent et régulent en retour l'expression de DDX5 et DDX17 mettant en place une boucle de rétro-contrôle négative induisant la diminution d'expression de ces deux protéines au cours de la différenciation. Enfin, cette diminution d'expression permet la mise en place d'un programme d'épissage participant à l'acquisition de phénotypes morphologiques des cellules différenciées. D'un point de vue mécanistique, il apparaît qu'un sous-groupe des événements d'épissage régulés durant la différenciation est contrôlé par la coopération de DDX5 et DDX17 avec le facteur d'épissage hnRNP H/F. D'autre part, DDX5 a aussi été impliqué dans un contexte pathologique du muscle. Cette hélicase interagit avec la mutation responsable de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). Durant ma thèse, j'ai produit des résultats préliminaires suggérant un rôle de DDX5 dans la mise en place des défauts d'épissage observés dans cette pathologie

Les protéines SREBP-1, Sterol Response Element Binding Proteins, sont des régulateurs clés du métabolisme des lipides et du cholestérol. A ce titre, ils ont été largement étudiés dans le foie et le tissu adipeux. Les facteurs SREBP-1 sont également exprimés dans le muscle squelettique au sein duquel ils sont les principaux médiateurs des effets géniques de l’insuline.Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont eu pour but de définir le rôle spécifique de SREBP-1 dans le muscle squelettique. L’étude transcriptomique de cellules musculaires humaines révèle plus de1500 gènes régulés par SREBP-1 dans le muscle squelettique humain, dont la moitié est réprimée. L’analyse fonctionnelle de ces gènes révèle l’implication de SREBP-1 dans des fonctions musculaires dépassant la cadre du métabolisme glucido-lipidique. Ainsi, SREBP-1 inhibe l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la différenciation et le maintien du phénotype musculaire. En conséquence, la sur expression de SREBP-1 bloque la différenciation myogénique in vitro et induit une atrophie marquée in vitro, sur des myotubes différenciés et in Vivo, dans le muscle squelettique de souris.En parallèle, deux répresseurs transcriptionnels : BHLHB2 et BHLHB3 apparaissent, après étude de leur promoteur, comme deux nouvelles cibles directes de SREBP-1. Ainsi, 20% des gènes inhibés par SREBP-1sont des cibles de BHLHB2 et BHLHB3, de nombreux gènes muscle-spécifiques y compris. De plus, BHLHB2 apparaît, de la même façon que SREBP-1, comme un acteur essentiel dans l’action de l’insuline sur le muscle squelettique, et dans le développement de l’insulino-résistance musculaire chez les patients diabétiques de type2.Le blocage de la différenciation myogénique et l’atrophie induite par SREBP-1 in vitro étant reversées par l’inhibition de l’expression de BHLHB2 et BHLHB3, nous concluons que BHLHB2 et BHLHB3 sont responsables de l’effet répressif de SREBP-1 sur le phénotype musculaire.Ces résultats mettent donc en évidence un nouveau rôle pour les facteurs SREBP-1 dans la régulation de la myogenèse et le maintien de la masse musculaire. SREBP-1 intègrent ainsi la régulation métabolique au contrôle du phénotype musculaire / Transcription factors SREBP-1, Sterol Response Element Binding Proteins, are key regulators of lipid and cholesterol homeostasis. Their function has been largely studied in liver and adipose tissue, but they are also well expressed in skeletal muscle where they mediate insulin transcriptional effects.This work aims to define the muscle specific role of SREBP-1. Microarray analysis of human myotubes over-expressing SREBP-1 identifies more than 1500 SREBP-1 target genes in human skeletal muscle, including number of repressed genes. Gene ontology analysis reveals the involvement of SREBP-1 in a large variety of biological functions in muscle cells. In fact, SREBP-1 represses expression of a number of muscle-specific genes and markers of muscle differentiation. As a result, SREBP-1 over-expression leads to blockage of in vitro myogenic differentiation and marked atrophy in vitro as in Vivo.In the same time, we identified the transcriptional repressors BHLHB2 and BHLHB3 as new direct target genes of SREBP-1, by promoter analysis. 20% of SREBP-1 repressed genes are also target genes of BHLHB2 and BHLHB3. Furthermore, BHLHB2, like SREBP-1, is involved in insulin action on skeletal muscle and muscular insulin-resistance in type 2 diabetic patients.As SREBP-1 effects on atrophy and myogenic differentiation inhibition are reversed by silencing BHLHB2 and BHLHB3 expression, we can conclude that BHLHB2 and BHLHB3 mediate negative SREBP-1action on muscular phenotype.These results confer a new role for SREBP-1 in the regulation of muscle mass and muscle cell differentiation, thus linking the control of muscle mass to metabolic pathways

Les ARN hélicases DDX5 et DDX17 sont des protéines « multi-tâches », elles sont impliquées dans de nombreuses étapes de la régulation du métabolisme des ARNs dont la transcription, l’épissage et la dégradation des ARNs. Lors de processus biologiques complexes tels que la myogénèse, les programmes d’expression génique sont profondément modifiés. Durant mon travail de thèse, j’ai contribué à montrer que DDX5 et DDX17 sont des protéines orchestratrices de la différenciation en coordonnant de manière directe et dynamique plusieurs niveaux de régulation génique. DDX5 et DDX17 contrôlent l’activité du facteur de transcription MyoD, régulateur majeur de la myogénèse ainsi que des microARNs spécifiques du muscle miR-1 et miR-206. Ceux-ci ciblent et régulent en retour l’expression de DDX5 et DDX17 mettant en place une boucle de rétro-contrôle négative induisant la diminution d’expression de ces deux protéines au cours de la différenciation. Enfin, cette diminution d’expression permet la mise en place d’un programme d’épissage participant à l’acquisition de phénotypes morphologiques des cellules différenciées. D’un point de vue mécanistique, il apparaît qu’un sous-groupe des événements d’épissage régulés durant la différenciation est contrôlé par la coopération de DDX5 et DDX17 avec le facteur d’épissage hnRNP H/F. D’autre part, DDX5 a aussi été impliqué dans un contexte pathologique du muscle. Cette hélicase interagit avec la mutation responsable de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). Durant ma thèse, j’ai produit des résultats préliminaires suggérant un rôle de DDX5 dans la mise en place des défauts d’épissage observés dans cette pathologie / RNA helicases DDX5 and DDX17 are “multi-tasks” proteins involved in nearly all aspects of RNA metabolism such as transcription, splicing and RNA degradation. During complex biological processes like myogenesis, gene expression programs are deeply modified. During my PhD, I contributed to show that DDX5 and DDX17 are orchestrators of differentiation by dynamically and directly orchestrating several layers of gene expression. DDX5 and DDX17 control the activity of the transcription factor MyoD, master regulator of myogenesis, as well as the expression of miR1/206, muscle-specific micro-RNAs. During myogenesis, these miRNAs downregulate the protein expression of DDX5 and DDX17 in a negative feedback loop, contributing to the switch of splicing programs observed in differenciated cells. Mechanistically, this splicing subprogram appear to be in part regulated by DDX5 and DDX17 in cooperation with hnRNP H/F splicing factors. Moreover DDX5 has been involved in a pathological muscular pathology : Myotonic Dystrophy type 1 (DM1). This helicase interact with the DM1 pathological mutation. During my PhD, I produced preliminary results suggesting a role for DDX5 in the establishment of the splicing defects observed in DM1

Le tonus myogénique (TM) est la capacité des artères de résistance à se contracter suite à une élévation de la pression intraluminale. Il permet la protection des capillaires contre une augmentation excessive de pression, et régule les débits sanguins locaux. L'implication du TM dans le développement de certaines pathologies fait de lui une cible thérapeutique intéressante. Cela nécessite une identification précise des protagonistes moléculaires. La voie RhoA/Rho-kinase joue un rôle important dans le TM en régulant la sensibilisation au calcium de l'appareil contractile. Nous nous sommes donc particulièrement intéressés à des éléments pouvant moduler ou être modulés par cette voie. Ainsi, nous avons mis en évidence que l'intervention de la voie RhoA/Rho-kinase dans le TM implique tout d'abord une localisation membranaire de RhoA, afin d'interagir avec la cavéoline-1 et d'activer ses effecteurs tels que Rho-kinase. De plus l'activation de RhoA par la pression est régulée par le récepteur Notch3 intervenant ainsi comme un mécanosenseur. Nos travaux montrent aussi le rôle du facteur de réponse au sérum (SRF) dans le TM via la régulation du cytosquelette et de l'activité des canaux mécanosensibles. Pour finir, l'inhibition de l'activité de RhoA, lors d'un traitement avec du Sildénafil, entraine une surexpression de RhoA qui est responsable d'une élévation du TM et d'une hypertension à l'arrêt du traitement. Cette thèse apporte de nouvelles connaissances sur l'implication de RhoA, Notch3 et SRF dans le TM permettant une meilleure compréhension de ce mécanisme. Cela offre de nouvelles cibles thérapeutiques pour combattre les pathologies impliquant des dysfonctions vasculaires.

L’atteinte de la fonction endothéliale représente une phase précoce de l’athérosclérose, un stade où les patients sont généralement asymptomatiques. Il existe donc un intérêt certain à détecter la dysfonction endothéliale. Nous avons développé une technique de mesure des variations de flot artériel au niveau des membres supérieurs, basée sur la spectroscopie proche infrarouge (NIRS). Cette approche permettrait d’étudier le niveau d’atteinte vasculaire et probablement de quantifier le degré de dysfonction endothéliale périphérique lors d’une hyperémie réactive. L'expérience a été exécutée sur deux cohortes de 13 et de 15 patients et a été comparée à la pléthysmographie par jauge de contrainte (SGP) qui est considérée comme une méthode de référence. Par la suite, nous avons caractérisé la réponse endothéliale par modélisation de la courbe hyperémique du flot artériel. Des études préliminaires avaient démontré que la réponse hyperémique adoptait majoritairement une forme bi-modale. Nous avons tenté de séparer les composantes endothéliales-dépendantes et endothéliales-indépendantes de l’hyperémie. La quantification des deux composantes de la réaction hyperémique permet de calculer un indice de la ‘santé’ du système endothélial local. Cet indice est nommé le ηfactor. Les résultats montrent une forte corrélation des mesures de flots entre la technique développée et la méthode de référence (r=0.91). Nous avons conclu que NIRS est une approche précise pour la mesure non-invasive du flot artériel. Nous avons obtenu une bonne répétabilité (ICC = 0.9313) pour le ηfactor indiquant sa robustesse. Cependant des études supplémentaires sont nécessaires pour valider la valeur de diagnostic du facteur défini. Mots clés: hyperémie réactive, réponse myogénique, oxyde nitrique, athérosclérose, spectroscopie proche infrarouge / Atherosclerotic diseases are mainly caused by coronary and peripheral blood vessel disorders. Endothelial dysfunction represents an early phase in these diseases, when patients are generally asymptomatic. We developed a technique, based on near infrared spectroscopy (NIRS), for measurement of arterial blood flow variations in limbs during reactive hyperemia. The technique allows the study of the level of vascular impairment and probably quantifying the level of endothelial dysfunction at peripheral arteries. The experiment was performed on two cohorts of 13 and 15 patients and was compared to strain gauge plethysmography (SGP) which is considered as gold standard. Afterward, we characterized endothelial reaction during reactive hyperemia through blood flow variations by modeling the hyperemic curve. Preliminary studies have shown that the hyperemic response generally adopts a bimodal form. The first peak was attributed to myogenic reaction that is endothelial independent and the second one to local endothelial cells reaction. The quantification of the two hyperemic response components makes it possible to calculate an index of ‘health’ for local endothelial cells, named ηfactor. The results showed a strong correlation (r = 0.91) of blood flow measurements between the developed method and the gold standard. We concluded that NIRS is a precise technique for non-invasive measurement of blood flow. Moreover, we found a high repeatability (ICC = 0.9313) of the ηfactor in repeated measurements indicating its robustness. Nonetheless, more studies are required to validate the diagnosis value of the defined factor. Key words: reactive hyperemia, myogenic response, endothelial dependent vasodilatation, nitric oxide, atherosclerosis, near infrared spectroscopy (NIRS)