Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-19T12:26:10Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 18256 bytes, checksum: ec60d71ddac70af12d876c9945806d90 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T12:26:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 18256 bytes, checksum: ec60d71ddac70af12d876c9945806d90 (MD5) Previous issue date: 2005-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho foram realizadas a clonagem e a caracterização parcial de um fragmento de 7,1Kb contendo o gene que codifica a nitrato redutase no fungo basidiomiceto Crinipellis perniciosa. A análise da seqüência parcial desse fragmento revelou a organização em cluster do gene nia com o gene que codifica a nitrito redutase e permitiu uma comparação filogenética com seqüências homólogas em outros fungos filamentosos. Foi realizada, também, a análise parcial comparativa das seqüências putativas das proteínas homólogas ao regulador geral positivo AREA, ao regulador específico NIRA e ao transportador de nitrato CRNA, depositadas no banco de dados do projeto genoma de C. perniciosa. O alinhamento das seqüências revelou maior proximidade genética de C. perniciosa ao fungo basidiomiceto Hebeloma cylindrosporum. A caracterização do gene nia em dez isolados de C. perniciosa de distintos biótipos e regiões geográficas por PCR-RFLP e hibridização revelou polimorfismo para os isolados do biótipo-S e biótipo-L. Não foi possível agrupar os isolados por hospedeiro ou região geográfica a partir da comparação das seqüências do gene que codifica a nitrato redutase, porém, os dados evidenciaram variabilidade genômica intraespecífica nessa espécie. A transformação da linhagem mutante niaD- de Penicillium griseoroseum, PG63, com o plasmídeo contendo o fragmento de 7,1 Kb resultou no isolamento de poucos transformantes. A complementação da mutação em P. griseoroseum, com o gene heterólogo do basidiomiceto C. perniciosa demonstrou que o gene niaCP é expresso e funcional, sugerindo estar sujeito a um controle de regulação similar ao do gene niaD desse organismo. A análise da regulação do gene nia de C. perniciosa por RT-PCR foi feita a partir de RNA total extraído de micélio cultivado em diferentes fontes de nitrogênio. O transcrito detectado na presença de nitrato como indutor e ausência de fontes de nitrogênio prontamente metabolizáveis sugere uma via de regulação específica e geral. A transcrição do gene niaCP foi ativada também no micélio cultivado no meio acrescido do fruto de cacau liofilizado e moído. Estes resultados sugerem uma provável importância da enzima nitrato redutase para C. perniciosa durante o seu desenvolvimento no hospedeiro. / In this study cloning and partial characterization of a 7.1Kb fragment containing the gene that encodes nitrate reductase in the basidiomycete fungus Crinipellis perniciosa were performed. The analysis of the partial sequence of this fragment revealed a cluster organization of nia gene with the gene encoding nitrite reductase and allowed a phylogenetic comparison among homologous sequences of other filamentous fungi. A partial comparative analysis was done for putative sequences of proteins homologous to the positive general regulator AREA, the specific regulator NIRA and the nitrate transporter CRNA deposited in the data bank of the genome project of C. perniciosa. Sequences alignment revealed a closer genetic proximity of C. perniciosa to Hebeloma cylindrosporum. The characterization of nia gene in ten isolates of C. perniciosa from different biotypes and geographic regions of C. perniciosa by PCR-RFLP and hybridization revealed a polimorfism for isolates of the biotype S and biotype L. It was not possible to group the isolates by host or geographic region through nitrate reductase gene sequences, but these data evidenced an intraspecific genomic variability in this species. The transformation of niaD- mutant of Penicillium griseoroseum, PG63, with the plasmid containing the xi7.1Kb fragment resulted in the isolation of few transformants. The complementation of the mutation in P. griseoroseum with the heterologous gene of the basidiomycete C. perniciosa showed that niaCP gene is expressed and functional, which suggests that it is under a regulation control similar to the one of niaD gene of this organism. The analysis of the regulation of nia gene in C. perniciosa by RT-PCR was performed from total RNA extracted from cultivated mycelium in different nitrogen sources. The transcript detected in the presence of nitrate as inductor and in the absence of nitrogen sources readily metabolized suggests a specific and general regulation pathway. The transcription of niaCP gene was also activated in the mycelium cultivated in the medium added with lyofilized and triturated cacao fruit. These results suggest a probable importance of the nitrate reductase enzyme for C. perniciosa during its development in the host.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-10T16:44:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 604815 bytes, checksum: 299964cd825884ce449176c3d3e98887 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T16:44:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 604815 bytes, checksum: 299964cd825884ce449176c3d3e98887 (MD5) Previous issue date: 2001-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gene que codifica nitrato redutase em Penicillium expansum foi isolado de um banco genômico construído no vetor fago lambda EMBL3. Um fragmento de DNA de 3,17 Kb, contendo parte da região codificadora do gene da nitrato redutase de Penicillium chrysogenum, foi utilizado como sonda. Quatro fagos recombinantes foram isolados e denominados λPENR1, λPENR3, λPENR5 e λPENR6, com fragmentos de DNA clonados de 14,4; 14,4; 12,3 e 12,6 Kb, respectivamente. A análise por hibridização do DNA dos fagos recombinantes, clivado com Sal I, identificou fragmentos cujos tamanhos correspondiam a 4,7 Kb (λPENR1), 6,0 Kb (λPENR3), 8,4 Kb (λPENR5) e 7,6 Kb (λPENR6). Para a construção do mapa físico de restrição do fago recombinante λPENR3, foram feitas clivagens simples e duplas com enzimas de restrição. A análise de restrição e hibridização dos fragmentos de DNA do fago recombinante λPENR3 revelou que o gene nia estava presente em um fragmento de 6,5 Kb. Este fragmento foi subclonado no plasmídeo pBluescript SK+, e o plasmídeo recombinante foi denominado pPENR. Para a construção do mapa físico de restrição de pPENR, foram feitas clivagens simples e duplas com enzimas de restrição. O plasmídeo recombinante pPENR foi utilizado na transformação dos mutantes Nia^- de P. expansum e Penicillium griseoroseum, sendo obtida uma freqüência de 16 transformantes por μg de DNA. / The gene encoding nitrate reductase from Penicillium expansum was isolated from a lambda EMBL3 genomic DNA library. A 3.17 Kb DNA fragment containing part of the coding region for nitrate reductase from Penicillium chrysogenum was used as a probe. Four recombinant phages were isolated and the recombinant phages were labeled λPENR1, λPENR3, λPENR5 e λPENR6, containing cloned DNA fragments of 14.4; 14.4; 12.3 and 12.6 Kb, respectively. DNA hybridization analysis of the recombinant phages cleaved with Sal I identified DNA fragments whose sizes were 4.7 Kb (λPENR1), 6.0 Kb (λPENR3), 8.4 Kb (λPENR5) and 7.6 Kb (λPENR6). For the construction of the a physical restriction map of the recombinant phage λPENR3, single and double digestions with restriction enzimes were performed. Restriction and hybridization analysis of the recombinant phage λPENR3 DNA fragments showed that the nia gene was present in a 6.5 Kb DNA fragment. This fragment was subcloned in the plasmid pBluescript SK+ resulting in plasmid pPENR. For the construction of the a physical restriction map of pPENR, single and double digestions with restriction enzymes were carried out. The recombinant plasmid pPENR was used for transformation of nitrate non-utilising strains of P. expansum and Penicillium. griseoroseum, and a frequency of 16 transformants per μg of DNA was achieved.

A nitrato redutase (NR) atua juntamente com a nitrito redutase (NiR) catalisando a primeira etapa da redução do nitrato. A NR, no citossol, é ativada, principalmente, pela luz e reduz o nitrato a nitrito. Em seguida, este é reduzido a amônio. Trabalhos anteriores demonstraram que a isoforma citossólica da NR está presente nas folhas e raízes do abacaxizeiro; já as associadas à membrana plasmática (NRMP) ainda não se tem registro. Sabe-se, no entanto, que a NRMP apresenta modos diferentes de ativação, como já constatados para outras espécies. Dentre os fatores que afetam sua atividade pode-se citar a temperatura. Pesquisas realizadas no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, acerca da influência do termoperíodo sobre os metabolismos nitrogenado e fotossintético de plantas de abacaxizeiro, aventaram a hipótese de que haveria uma nitrato redutase específica de membrana plasmática presente nas células radiculares, a qual seria regulada por termoperíodo, diferindo, portanto, da isoforma citossólica presente nas folhas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo principal demonstrar a existência de uma isoforma da NR associada à membrana plasmática, a qual seria responsável pelo incremento da atividade dessa enzima registrada nas raízes de Ananas comosus, quando plantas cultivadas in vitro são submetidas ao termoperíodo (28°C dia/ 15°C noite). Para tanto, determinou-se o tempo mínimo de exposição das plantas de abacaxizeiro ao termoperíodo, necessário à indução da nitrato redutase radicular. Além disso, estudou-se a influência da idade das plantas na resposta ao tratamento com baixa temperatura noturna. Plantas cultivadas in vitro com 90 dias de idade ou com idades variadas foram transferidas para câmaras de crescimento com temperatura constante (28°C dia/noite controle experimental) ou com termoperíodo (28°C dia/ 15°C noite), fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 55 moles m-2 s -1. Elas permaneceram nessas condições por 1, 3, 5, 7, 15, 30, 40, 50 ou 60 dias. Após cada período, a atividade in vivo da NR foi analisada durante a fase de ausência de luz. Para que fosse possível identificar uma possível NRMP nas células radiculares de abacaxizeiro, um método de ensaio in vitro foi padronizado e a melhor técnica de isolamento de frações de membrana plasmática foi selecionada. Após as plantas com 60 dias de idade serem submetidas por 30 dias ao tratamento termoperiódico ou à temperatura constante, as frações de membrana plasmática das células radiculares foram isoladas e o ensaio in vitro da NR foi realizado, utilizando-se NADH, NADPH ou succinato como doadores de elétrons. Os resultados indicaram que o tempo mínimo de exposição das plantas de abacaxizeiro ao termoperíodo foi de 30 dias. O método de ensaio enzimático in vitro foi padronizado para as plantas de abacaxizeiro e a técnica de isolamento de frações de membrana plasmática que se mostrou mais adequada para essa bromélia foi a de fracionamento por sistema de duas fases com Dextran T-500 e PEG 3350. O grau de pureza das frações, avaliado pela detecção da atividade da enzima citoplasmática malato desidrogenase (MDH), foi em média de 95%, evidenciando a eficácia da pradronização do método. Os resultados obtidos para as frações de membranas plasmáticas, extraídas das raízes das plantas que estiveram sob o tratamento termoperiódico, mostraram que a baixa temperatura noturna influenciou positivamente a atividade da nitrato redutase. O aumento da atividade foi observado quando NADH, NADPH ou succinato foram utilizados como doadores de elétrons. Isso significa que, provavelmente, mais de uma isoforma da NRMP está presente nas raízes de abacaxizeiro. Além disso, há indícios de que a isoforma que está ligada externamente à membrana por uma âncora glicosídica (que utiliza succinato como doador de elétrons) está presente nas células radiculares do abacaxizeiro e respondeu positivamente ao estímulo da baixa temperatura noturna. Em contrapartida, nenhuma diferença pôde ser observada quando as atividades da NR foram medidas nas frações de citoplasma das plantas controle e daquelas que foram tratadas com termoperíodo. Não foi detectada atividade nas frações citossólicas quando succinato foi oferecido como poder redutor da NR. Concluiu-se, portanto, que o incremento na atividade da NR, verificado nas plantas que foram tratadas com termoperíodo, deveu-se à indução pela baixa temperatura noturna da NRMP. Esta pesquisa trouxe contribuições importantes acerca da existência de uma nitrato redutase associada à membrana plasmática em abacaxizeiro, nunca antes detectada em uma bromélia e muito pouco estudada nos demais vegetais. As padronizações realizadas serão essenciais para aplicação em outras pesquisas do Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, abrindo oportunidades para se aprofundar ainda mais o tema sobre o controle da ativação da NR. / The nitrate reductase (NR) acts together with the nitrite reductase (NiR) to catalyze the first step of the nitrate reduction. The NR localized in the cytosol is activated mainly by light and reduces nitrate to nitrite, followed by its reduction to ammonium. Previous work demonstrated that the cytosolic isoform of NR is present in leaves and roots of Ananas comosus, although the isoform associated with the plasma membrane (PM-NR) has not yet been registered in this species. The PM-NR has different modes of activation in comparison to the cytosolic NR, as already demonstrated in other species. Among the factors that affect its activity can be mentioned the temperature. Experiments developed in the Laboratory of Plant Physiology of IBUSP hypothesized that exists a specific plasma membrane NR in plant roots regulated by thermoperiod, differing from the cytosolic isoform present in leaves. The present work aimed to demonstrate the existence of this isoform of NR present in the plasma membrane, which would be responsible for the increase of its activity in Ananas comosus roots when plants were cultivated in vitro under thermoperiod of 28°C day/ 15°C night. Initially, it was important to determine the minimum time of exposure to thermoperiod necessary for the induction of nitrate reductase in roots of pineapple plants. Furthermore, it was analyzed the influence of age in the response of plants to low night temperature treatment. For this purpose, plants with different ages cultivated in vitro were transferred to growth chambers either with constant temperature (28°C day/night experimental control) or with thermoperiod (28°C day/ 15°C night). The plants were cultivated in these conditions during 1, 3, 5, 7, 15, 30, 40, 50 or 60 days and then the in vivo NR activity was analyzed in the shoot and root tissues during the dark period. In order to identify a probable PM-NR in the pineapple root cells, it was also necessary to develop a NR in vitro assay protocol specific for Ananas comosus and the appropriate technique for plasma membrane isolation (Dextran T-500 and PEG 3350). The purity of the fractions, determined by the activity of cytoplasmic enzyme malate dehydrogenase (MDH), was on average 95%, indicating the effectiveness of the method. The next step was to evaluate the NR activity in citoplasmic and plasma membrane fractions of root tissues of Ananas comosus. Using 60 daysold plants exposed either to 30 days under the thermoperiodic treatment or to constant temperature, the plasma membrane fractions of roots were isolated and the in vitro NR assay was performed using NADH, NADPH or succinate as electron donators. The results indicated that the minimum thermoperiod exposure time necessary to induce NR activity was 30 days. Furthermore, it was demonstrated that low temperatures during the dark period positively influenced the activity of nitrate reductase in plasma membrane fractions and that the increase in its activity was observed when NADH, NADPH or succinate were used as electron donors. On the other hand, no difference in NR activity was observed in the cytoplasmic fraction of control plants and those which were treated with thermoperiod. Moreover, no NR activity was detected in cytosolic fractions when succinate was provided as electron donor. All together, this results showed that probably diferents isoforms are presents in pineapple roots. The extracellular isoform that is attached to the plasma membrane by a lipophilic anchor (using succinate as electron donor) can be present in root cells of pineapple and responded positively to the low night temperature stimulus. This study has made important contributions to the knowledge of the metabolism and physiology of Ananas comosus. This is the first time that the existence of a nitrate reductase associated with the plasma membrane, a very little studied enzyme, is documented in Bromeliaceae.

O nitrato é uma das principais fontes de nitrogênio disponível para as plantas, sendo a nitrato redutase (NR) a enzima responsável pela sua redução a nitrito. O nitrito é considerado tóxico em altas concentrações e, por esse motivo, a atividade da NR possui uma regulação complexa, principalmente em nível transcricional e pós-traducional. Trabalhos anteriores do nosso grupo, utilizando plantas de abacaxizeiro cultivadas in vitro, demonstraram que, em condições de termoperíodo de 28ºC dia/15ºC noite, as raízes apresentaram um estímulo positivo de atividade da NR na ausência de luz quando comparado às plantas crescidas em temperatura constante de 28ºC, associado posteriormente à atividade da NR de membrana plasmática (NRPM). Baseado nesses resultados questionou-se qual seria a influência da aplicação do estímulo de frio associado ou não à presença de luz na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro. Este trabalho teve como objetivos investigar os efeitos do frio na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro em diferentes tempos de exposição, na presença ou ausência da luz e em diferentes fases do ciclo de 24 horas (claro/escuro). Buscou-se averiguar qual NR estaria envolvida nessas respostas: a NR citossólica (NRc) ou de membrana plasmática (NRPM), assim como verificar o envolvimento do NO na sinalização pela baixa temperatura. O ritmo diário de atividade da NR também foi avaliado, logo após a exposição ao frio, em diferentes fases do ciclo de claro/escuro. As plantas foram expostas a 1, 3, 6 ou 9 horas a 10ºC ou 25ºC (controle) na luz ou no escuro. A NR foi avaliada pelo método in vitro. O estímulo positivo na atividade da NR pelo frio ocorreu principalmente após 6 horas no claro, para as folhas, e após 6 horas no escuro, para as raízes. Novas plantas foram submetidas às mesmas condições para o fracionamento celular, mostrando que, tanto em folhas como em raízes, o incremento de atividade da NR observado a 10ºC foi associado à NR citossólica (NRc). Em ambos os casos, o estímulo ocorreu utilizando-se o NADPH como doador de elétrons, sugerindo o possível envolvimento de uma isoforma NAD(P)H biespecífica. A quantificação do NO foi realizada por leitura em espectrofluorímetro, apontando uma maior emissão induzida pelo frio para as folhas tanto na presença da luz (após 1 e 3 horas) como em sua ausência (1 e 9 horas) e em raízes apenas no escuro (9 horas), sugerindo o envolvimento do NO na sinalização da baixa temperatura. Para verificar a influência do frio em diferentes fases do dia, 4 horários foram selecionados (início da fase clara, meio da fase clara, início da fase escura, meio da fase escura) para início de cada experimento. A NR foi medida logo após a exposição ao frio (6 horas a 10ºC), pelo método in vitro e durante 24 horas em reaquecimento (25ºC), quantificada a cada 3 horas pelo método in vivo. As raízes apresentaram aumento da atividade da NR apenas quando o estímulo da baixa temperatura foi aplicado na fase escura, enquanto as folhas sofreram incremento da atividade da NR independente da condição luminosa. Em reaquecimento, a NR das folhas teve seu ritmo atrasado em todas as situações, com exceção quando o frio foi aplicado no início da fase escura, na qual houve perda quase completa de variação ao longo do dia. As raízes não mostraram grandes alterações no ritmo diário da NR. Este trabalho mostrou que a temperatura de 10ºC tem efeitos diferentes sobre folhas e raízes, sendo que as modificações na atividade da NR, em curto prazo, parecem ocorrer por alterações na NRc. O NO parece estar envolvido na sinalização do frio, mas não se determinou sua origem biossintética. As raízes tiveram um aumento da atividade da NR pela baixa temperatura, que foi dependente do escuro, enquanto as respostas das folhas dependeram da fase do ciclo na qual foram submetidas a 10ºC / Nitrate is the main nitrogen source available to plants, and nitrate reductase (NR) is the enzyme responsible for its reduction to nitrite. Because of its toxicity in high concentrations, nitrite production by NR has a complex regulation, especially at transcriptional and post-translational level. A previous work from our group, using pineapple plants cultivated in vitro, showed that, under thermoperiod of 28ºC day/15ºC night, NR activity increased in roots during absence of light compared to activity in plants grown under constant temperature of 28ºC. Based on these results it was questioned what would be the effect of cold stimulus application with or without light on NR activity in leaves and roots of pineapple plants. This study aimed to investigate the effects of low temperature on NR activity in leaves and roots of pineapple plants at different exposure times in the presence or absence of light and at different phases of a 24 hour cycle (light/darkness). We also investigated which NR was involved in these responses: cytosolic (cNR) or plasma membrane NR (PMNR), as well as verifying the role of nitric oxide (NO) signaling at low temperature. Furthermore, the NR daily rhythm activity was measured after cold exposure, in different phases of the light/dark cycle. Plants were exposed to 10ºC or 25ºC (control group) during 1, 3, 6 or 9 hours. NR was quantified by in vitro method. In the leaves, the increase of NR activity by low temperature (10ºC) occurred mainly after 6 hours in the presence of light, while in the roots the highest NR activity occurred after 6 hours at 10ºC in darkness. Based on these results, other groups of plants were subjected to the same conditions for cell partitioning, showing that in both leaves and roots the increase of NR activity by cold was associated with cytosolic NR (NRc). In both cases, the positive stimulation occurred with NADPH as the electron donor, suggesting the possible involvement of a NAD(P)H bispecific isoform. NO quantification, measured by spectrofluorimetry, indicated a greater emission induced by cold in the leaves both in the presence (after 1 and 3 hours) and absence (1 and 9 hours) of light and in roots only in darkness (9 hours), suggesting an involvement of NO in low temperature signaling. To evaluate the influence of cold at different day phases, we performed 4 experiments beginning at different times of the 24-hour cycle (beginning of light phase, middle of light phase, beginning of dark phase, middle of dark phase). NR activity was measured immediately after cold exposure (6 hours at 10°C) by in vitro method and after rewarming at 25°C during 24 hours, quantified by in vivo method every 3 hours. In roots, NR activity showed an increase only when the cold stimulus was applied at dark phase, while in leaves, NR was independent of the light condition. Upon rewarming, leaves presented a delay in NR daily behavior in all situations, except when low temperature was applied at the beginning of dark phase, showing almost no variation throughout the day. This study demonstrated that the temperature of 10ºC affected leaves and roots differently, and the changes in NR activity after short exposure time could be associated with NRc. NO seemed to be involved in cold signaling, but its biosynthetic origin has not been determined yet. Roots showed an increment of NR activity by low temperature dependent of the dark condition, while the responses of leaves depended on the phase of the 24-hour cycle in which they were subjected to 10ºC

No ambiente aquático a maior fonte de nitrogênio encontra-se na forma de nitrato que necessita sofrer uma redução para formação de compostos biologicamente aproveitáveis, tais como aminoácidos, bases nitrogenadas e compostos nitrogenados. A assimilação de nitrogênio é um processo que ocorre em duas etapas catalisadas seqüencialmente pelas enzimas nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR). A NR catalisa a redução do nitrato a nitrito (etapa considerada limitante na assimilação de nitrogênio), sendo este posteriormente reduzido a amônio pela NiR. NR está amplamente distribuída e encontrada em diferentes organismos, incluíndo bactérias, fungos, cianobactérias, plantas terrestres e algas. Neste trabalho estudamos a NR de Microcystis aeruginosa que é uma cianobactéria tóxica de água doce encontrada principalmente em reservatórios de água. A toxina microcistina quando liberada por esta microalga está associada com problemas de saúde em humanos e animais. Foi mostrado que a NR de M. aeruginosa pertence a classe das NRs biespecíficas para NADH e NADPH. Apresenta constante de Michaelis-Menten aparente (Km) de 1,5 e 1,6 mM para NADPH e NADH, respectivamente. Ainda, Km aparente para nitrato foi estimado em 0,6 mM. As condições ótimas de ensaio encontradas foram em pH 10,0 e temperatura em 40ºC. A exposição da M. aeruginosa ao herbicida oxifluorfeno (10 µg/L) promoveu a inibição de NiR, possibilitando a quantificação de •NO formado via NR, enzima que teve sua atividade 6 vezes maior durante a exposição a este agente. O estudo da enzima NR é de fundamental importância para a compreensão da regulação da expressão de enzimas assimiladoras de nitrogênio bem como dos mecanismos de nutrição e crescimento desta microalga. / Nitrate is the major source of nitrogen in the aquatic environment, which must be reduced before incorporation into biological compounds, such as amino acids, nitrogen bases and nitrogen compounds. The nitrogen assimilation process occurs in a two-step reaction catalyzed by 2 enzymes working sequentially, nitrate reductase (NR) and nitrite reductase (NiR). The NR catalyzes the reduction of nitrate to nitrite (is considered the limiting step in the nitrogen assimilation) being this later reduced to ammonium by NiR. NR is widely distributed and found in different organisms, including bacterium, fungus, cyanobacterium, plants and algae. In this work we study the NR of Microcystis aeruginosa, a toxic microalga, mainly found in water reservoirs. The microcystin toxin released by M. aeruginosa is associated with problems of health in humans and animals. We report that NR of M. aeruginosa belongs to a biespecific group of NRs for NADH and NADPH. It presents Michaelis-Menten\'s constant (Km) as 1.5 and 1.6 mM for NADPH and NADH, respectively. The apparent Km for nitrate was estimated as 0.6 mM. The optimum conditions of assay found were at pH 10.0 and temperature of 40ºC. The exposition of M. aeruginosa to the herbicide oxyfluorfen (10 µg/L) promotes the inhibition of NiR, and it makes possible to quantify the •NO produced by NR, whose has it activity 6 hold higher during the agent exposition. In order to understand the regulation of nitrogen assimilation enzymes, as well as, the mechanisms of nutrition and growth of this algae, the study of the NR enzyme is of crucial importance.

No ambiente aquático a maior fonte de nitrogênio encontra-se na forma de nitrato que necessita sofrer uma redução para formação de compostos biologicamente aproveitáveis, tais como aminoácidos, bases nitrogenadas e compostos nitrogenados. A assimilação de nitrogênio é um processo que ocorre em duas etapas catalisadas seqüencialmente pelas enzimas nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR). A NR catalisa a redução do nitrato a nitrito (etapa considerada limitante na assimilação de nitrogênio), sendo este posteriormente reduzido a amônio pela NiR. NR está amplamente distribuída e encontrada em diferentes organismos, incluíndo bactérias, fungos, cianobactérias, plantas terrestres e algas. Neste trabalho estudamos a NR de Microcystis aeruginosa que é uma cianobactéria tóxica de água doce encontrada principalmente em reservatórios de água. A toxina microcistina quando liberada por esta microalga está associada com problemas de saúde em humanos e animais. Foi mostrado que a NR de M. aeruginosa pertence a classe das NRs biespecíficas para NADH e NADPH. Apresenta constante de Michaelis-Menten aparente (Km) de 1,5 e 1,6 mM para NADPH e NADH, respectivamente. Ainda, Km aparente para nitrato foi estimado em 0,6 mM. As condições ótimas de ensaio encontradas foram em pH 10,0 e temperatura em 40ºC. A exposição da M. aeruginosa ao herbicida oxifluorfeno (10 µg/L) promoveu a inibição de NiR, possibilitando a quantificação de •NO formado via NR, enzima que teve sua atividade 6 vezes maior durante a exposição a este agente. O estudo da enzima NR é de fundamental importância para a compreensão da regulação da expressão de enzimas assimiladoras de nitrogênio bem como dos mecanismos de nutrição e crescimento desta microalga. / Nitrate is the major source of nitrogen in the aquatic environment, which must be reduced before incorporation into biological compounds, such as amino acids, nitrogen bases and nitrogen compounds. The nitrogen assimilation process occurs in a two-step reaction catalyzed by 2 enzymes working sequentially, nitrate reductase (NR) and nitrite reductase (NiR). The NR catalyzes the reduction of nitrate to nitrite (is considered the limiting step in the nitrogen assimilation) being this later reduced to ammonium by NiR. NR is widely distributed and found in different organisms, including bacterium, fungus, cyanobacterium, plants and algae. In this work we study the NR of Microcystis aeruginosa, a toxic microalga, mainly found in water reservoirs. The microcystin toxin released by M. aeruginosa is associated with problems of health in humans and animals. We report that NR of M. aeruginosa belongs to a biespecific group of NRs for NADH and NADPH. It presents Michaelis-Menten\'s constant (Km) as 1.5 and 1.6 mM for NADPH and NADH, respectively. The apparent Km for nitrate was estimated as 0.6 mM. The optimum conditions of assay found were at pH 10.0 and temperature of 40ºC. The exposition of M. aeruginosa to the herbicide oxyfluorfen (10 µg/L) promotes the inhibition of NiR, and it makes possible to quantify the •NO produced by NR, whose has it activity 6 hold higher during the agent exposition. In order to understand the regulation of nitrogen assimilation enzymes, as well as, the mechanisms of nutrition and growth of this algae, the study of the NR enzyme is of crucial importance.

O nitrato é uma das principais fontes de nitrogênio disponível para as plantas, sendo a nitrato redutase (NR) a enzima responsável pela sua redução a nitrito. O nitrito é considerado tóxico em altas concentrações e, por esse motivo, a atividade da NR possui uma regulação complexa, principalmente em nível transcricional e pós-traducional. Trabalhos anteriores do nosso grupo, utilizando plantas de abacaxizeiro cultivadas in vitro, demonstraram que, em condições de termoperíodo de 28ºC dia/15ºC noite, as raízes apresentaram um estímulo positivo de atividade da NR na ausência de luz quando comparado às plantas crescidas em temperatura constante de 28ºC, associado posteriormente à atividade da NR de membrana plasmática (NRPM). Baseado nesses resultados questionou-se qual seria a influência da aplicação do estímulo de frio associado ou não à presença de luz na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro. Este trabalho teve como objetivos investigar os efeitos do frio na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro em diferentes tempos de exposição, na presença ou ausência da luz e em diferentes fases do ciclo de 24 horas (claro/escuro). Buscou-se averiguar qual NR estaria envolvida nessas respostas: a NR citossólica (NRc) ou de membrana plasmática (NRPM), assim como verificar o envolvimento do NO na sinalização pela baixa temperatura. O ritmo diário de atividade da NR também foi avaliado, logo após a exposição ao frio, em diferentes fases do ciclo de claro/escuro. As plantas foram expostas a 1, 3, 6 ou 9 horas a 10ºC ou 25ºC (controle) na luz ou no escuro. A NR foi avaliada pelo método in vitro. O estímulo positivo na atividade da NR pelo frio ocorreu principalmente após 6 horas no claro, para as folhas, e após 6 horas no escuro, para as raízes. Novas plantas foram submetidas às mesmas condições para o fracionamento celular, mostrando que, tanto em folhas como em raízes, o incremento de atividade da NR observado a 10ºC foi associado à NR citossólica (NRc). Em ambos os casos, o estímulo ocorreu utilizando-se o NADPH como doador de elétrons, sugerindo o possível envolvimento de uma isoforma NAD(P)H biespecífica. A quantificação do NO foi realizada por leitura em espectrofluorímetro, apontando uma maior emissão induzida pelo frio para as folhas tanto na presença da luz (após 1 e 3 horas) como em sua ausência (1 e 9 horas) e em raízes apenas no escuro (9 horas), sugerindo o envolvimento do NO na sinalização da baixa temperatura. Para verificar a influência do frio em diferentes fases do dia, 4 horários foram selecionados (início da fase clara, meio da fase clara, início da fase escura, meio da fase escura) para início de cada experimento. A NR foi medida logo após a exposição ao frio (6 horas a 10ºC), pelo método in vitro e durante 24 horas em reaquecimento (25ºC), quantificada a cada 3 horas pelo método in vivo. As raízes apresentaram aumento da atividade da NR apenas quando o estímulo da baixa temperatura foi aplicado na fase escura, enquanto as folhas sofreram incremento da atividade da NR independente da condição luminosa. Em reaquecimento, a NR das folhas teve seu ritmo atrasado em todas as situações, com exceção quando o frio foi aplicado no início da fase escura, na qual houve perda quase completa de variação ao longo do dia. As raízes não mostraram grandes alterações no ritmo diário da NR. Este trabalho mostrou que a temperatura de 10ºC tem efeitos diferentes sobre folhas e raízes, sendo que as modificações na atividade da NR, em curto prazo, parecem ocorrer por alterações na NRc. O NO parece estar envolvido na sinalização do frio, mas não se determinou sua origem biossintética. As raízes tiveram um aumento da atividade da NR pela baixa temperatura, que foi dependente do escuro, enquanto as respostas das folhas dependeram da fase do ciclo na qual foram submetidas a 10ºC / Nitrate is the main nitrogen source available to plants, and nitrate reductase (NR) is the enzyme responsible for its reduction to nitrite. Because of its toxicity in high concentrations, nitrite production by NR has a complex regulation, especially at transcriptional and post-translational level. A previous work from our group, using pineapple plants cultivated in vitro, showed that, under thermoperiod of 28ºC day/15ºC night, NR activity increased in roots during absence of light compared to activity in plants grown under constant temperature of 28ºC. Based on these results it was questioned what would be the effect of cold stimulus application with or without light on NR activity in leaves and roots of pineapple plants. This study aimed to investigate the effects of low temperature on NR activity in leaves and roots of pineapple plants at different exposure times in the presence or absence of light and at different phases of a 24 hour cycle (light/darkness). We also investigated which NR was involved in these responses: cytosolic (cNR) or plasma membrane NR (PMNR), as well as verifying the role of nitric oxide (NO) signaling at low temperature. Furthermore, the NR daily rhythm activity was measured after cold exposure, in different phases of the light/dark cycle. Plants were exposed to 10ºC or 25ºC (control group) during 1, 3, 6 or 9 hours. NR was quantified by in vitro method. In the leaves, the increase of NR activity by low temperature (10ºC) occurred mainly after 6 hours in the presence of light, while in the roots the highest NR activity occurred after 6 hours at 10ºC in darkness. Based on these results, other groups of plants were subjected to the same conditions for cell partitioning, showing that in both leaves and roots the increase of NR activity by cold was associated with cytosolic NR (NRc). In both cases, the positive stimulation occurred with NADPH as the electron donor, suggesting the possible involvement of a NAD(P)H bispecific isoform. NO quantification, measured by spectrofluorimetry, indicated a greater emission induced by cold in the leaves both in the presence (after 1 and 3 hours) and absence (1 and 9 hours) of light and in roots only in darkness (9 hours), suggesting an involvement of NO in low temperature signaling. To evaluate the influence of cold at different day phases, we performed 4 experiments beginning at different times of the 24-hour cycle (beginning of light phase, middle of light phase, beginning of dark phase, middle of dark phase). NR activity was measured immediately after cold exposure (6 hours at 10°C) by in vitro method and after rewarming at 25°C during 24 hours, quantified by in vivo method every 3 hours. In roots, NR activity showed an increase only when the cold stimulus was applied at dark phase, while in leaves, NR was independent of the light condition. Upon rewarming, leaves presented a delay in NR daily behavior in all situations, except when low temperature was applied at the beginning of dark phase, showing almost no variation throughout the day. This study demonstrated that the temperature of 10ºC affected leaves and roots differently, and the changes in NR activity after short exposure time could be associated with NRc. NO seemed to be involved in cold signaling, but its biosynthetic origin has not been determined yet. Roots showed an increment of NR activity by low temperature dependent of the dark condition, while the responses of leaves depended on the phase of the 24-hour cycle in which they were subjected to 10ºC

A nitrato redutase (NR) atua juntamente com a nitrito redutase (NiR) catalisando a primeira etapa da redução do nitrato. A NR, no citossol, é ativada, principalmente, pela luz e reduz o nitrato a nitrito. Em seguida, este é reduzido a amônio. Trabalhos anteriores demonstraram que a isoforma citossólica da NR está presente nas folhas e raízes do abacaxizeiro; já as associadas à membrana plasmática (NRMP) ainda não se tem registro. Sabe-se, no entanto, que a NRMP apresenta modos diferentes de ativação, como já constatados para outras espécies. Dentre os fatores que afetam sua atividade pode-se citar a temperatura. Pesquisas realizadas no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, acerca da influência do termoperíodo sobre os metabolismos nitrogenado e fotossintético de plantas de abacaxizeiro, aventaram a hipótese de que haveria uma nitrato redutase específica de membrana plasmática presente nas células radiculares, a qual seria regulada por termoperíodo, diferindo, portanto, da isoforma citossólica presente nas folhas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo principal demonstrar a existência de uma isoforma da NR associada à membrana plasmática, a qual seria responsável pelo incremento da atividade dessa enzima registrada nas raízes de Ananas comosus, quando plantas cultivadas in vitro são submetidas ao termoperíodo (28°C dia/ 15°C noite). Para tanto, determinou-se o tempo mínimo de exposição das plantas de abacaxizeiro ao termoperíodo, necessário à indução da nitrato redutase radicular. Além disso, estudou-se a influência da idade das plantas na resposta ao tratamento com baixa temperatura noturna. Plantas cultivadas in vitro com 90 dias de idade ou com idades variadas foram transferidas para câmaras de crescimento com temperatura constante (28°C dia/noite controle experimental) ou com termoperíodo (28°C dia/ 15°C noite), fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 55 moles m-2 s -1. Elas permaneceram nessas condições por 1, 3, 5, 7, 15, 30, 40, 50 ou 60 dias. Após cada período, a atividade in vivo da NR foi analisada durante a fase de ausência de luz. Para que fosse possível identificar uma possível NRMP nas células radiculares de abacaxizeiro, um método de ensaio in vitro foi padronizado e a melhor técnica de isolamento de frações de membrana plasmática foi selecionada. Após as plantas com 60 dias de idade serem submetidas por 30 dias ao tratamento termoperiódico ou à temperatura constante, as frações de membrana plasmática das células radiculares foram isoladas e o ensaio in vitro da NR foi realizado, utilizando-se NADH, NADPH ou succinato como doadores de elétrons. Os resultados indicaram que o tempo mínimo de exposição das plantas de abacaxizeiro ao termoperíodo foi de 30 dias. O método de ensaio enzimático in vitro foi padronizado para as plantas de abacaxizeiro e a técnica de isolamento de frações de membrana plasmática que se mostrou mais adequada para essa bromélia foi a de fracionamento por sistema de duas fases com Dextran T-500 e PEG 3350. O grau de pureza das frações, avaliado pela detecção da atividade da enzima citoplasmática malato desidrogenase (MDH), foi em média de 95%, evidenciando a eficácia da pradronização do método. Os resultados obtidos para as frações de membranas plasmáticas, extraídas das raízes das plantas que estiveram sob o tratamento termoperiódico, mostraram que a baixa temperatura noturna influenciou positivamente a atividade da nitrato redutase. O aumento da atividade foi observado quando NADH, NADPH ou succinato foram utilizados como doadores de elétrons. Isso significa que, provavelmente, mais de uma isoforma da NRMP está presente nas raízes de abacaxizeiro. Além disso, há indícios de que a isoforma que está ligada externamente à membrana por uma âncora glicosídica (que utiliza succinato como doador de elétrons) está presente nas células radiculares do abacaxizeiro e respondeu positivamente ao estímulo da baixa temperatura noturna. Em contrapartida, nenhuma diferença pôde ser observada quando as atividades da NR foram medidas nas frações de citoplasma das plantas controle e daquelas que foram tratadas com termoperíodo. Não foi detectada atividade nas frações citossólicas quando succinato foi oferecido como poder redutor da NR. Concluiu-se, portanto, que o incremento na atividade da NR, verificado nas plantas que foram tratadas com termoperíodo, deveu-se à indução pela baixa temperatura noturna da NRMP. Esta pesquisa trouxe contribuições importantes acerca da existência de uma nitrato redutase associada à membrana plasmática em abacaxizeiro, nunca antes detectada em uma bromélia e muito pouco estudada nos demais vegetais. As padronizações realizadas serão essenciais para aplicação em outras pesquisas do Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, abrindo oportunidades para se aprofundar ainda mais o tema sobre o controle da ativação da NR. / The nitrate reductase (NR) acts together with the nitrite reductase (NiR) to catalyze the first step of the nitrate reduction. The NR localized in the cytosol is activated mainly by light and reduces nitrate to nitrite, followed by its reduction to ammonium. Previous work demonstrated that the cytosolic isoform of NR is present in leaves and roots of Ananas comosus, although the isoform associated with the plasma membrane (PM-NR) has not yet been registered in this species. The PM-NR has different modes of activation in comparison to the cytosolic NR, as already demonstrated in other species. Among the factors that affect its activity can be mentioned the temperature. Experiments developed in the Laboratory of Plant Physiology of IBUSP hypothesized that exists a specific plasma membrane NR in plant roots regulated by thermoperiod, differing from the cytosolic isoform present in leaves. The present work aimed to demonstrate the existence of this isoform of NR present in the plasma membrane, which would be responsible for the increase of its activity in Ananas comosus roots when plants were cultivated in vitro under thermoperiod of 28°C day/ 15°C night. Initially, it was important to determine the minimum time of exposure to thermoperiod necessary for the induction of nitrate reductase in roots of pineapple plants. Furthermore, it was analyzed the influence of age in the response of plants to low night temperature treatment. For this purpose, plants with different ages cultivated in vitro were transferred to growth chambers either with constant temperature (28°C day/night experimental control) or with thermoperiod (28°C day/ 15°C night). The plants were cultivated in these conditions during 1, 3, 5, 7, 15, 30, 40, 50 or 60 days and then the in vivo NR activity was analyzed in the shoot and root tissues during the dark period. In order to identify a probable PM-NR in the pineapple root cells, it was also necessary to develop a NR in vitro assay protocol specific for Ananas comosus and the appropriate technique for plasma membrane isolation (Dextran T-500 and PEG 3350). The purity of the fractions, determined by the activity of cytoplasmic enzyme malate dehydrogenase (MDH), was on average 95%, indicating the effectiveness of the method. The next step was to evaluate the NR activity in citoplasmic and plasma membrane fractions of root tissues of Ananas comosus. Using 60 daysold plants exposed either to 30 days under the thermoperiodic treatment or to constant temperature, the plasma membrane fractions of roots were isolated and the in vitro NR assay was performed using NADH, NADPH or succinate as electron donators. The results indicated that the minimum thermoperiod exposure time necessary to induce NR activity was 30 days. Furthermore, it was demonstrated that low temperatures during the dark period positively influenced the activity of nitrate reductase in plasma membrane fractions and that the increase in its activity was observed when NADH, NADPH or succinate were used as electron donors. On the other hand, no difference in NR activity was observed in the cytoplasmic fraction of control plants and those which were treated with thermoperiod. Moreover, no NR activity was detected in cytosolic fractions when succinate was provided as electron donor. All together, this results showed that probably diferents isoforms are presents in pineapple roots. The extracellular isoform that is attached to the plasma membrane by a lipophilic anchor (using succinate as electron donor) can be present in root cells of pineapple and responded positively to the low night temperature stimulus. This study has made important contributions to the knowledge of the metabolism and physiology of Ananas comosus. This is the first time that the existence of a nitrate reductase associated with the plasma membrane, a very little studied enzyme, is documented in Bromeliaceae.

Estudos anteriores realizados no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP com Guzmania monostachia demonstraram que quando essas plantas são submetidas ao déficit hídrico ocorre a indução do CAM, com maior expressão desse metabolismo na porção foliar apical. Para outra espécie (Vriesea gigantea), foi verificada a maior atividade da enzima nitrato redutase (NR) na porção basal durante o período diurno. Em uma bromélia terrestre (Ananas comosus) foi observada a sinalização por citocininas tanto na indução da expressão gênica, quanto na ativação da NR. Outros laboratórios evidenciaram que plantas de Mesembryanthemum crystallinum induzidas ao CAM apresentaram uma provável regulação negativa da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPC) por citocininas. Em decorrência desses conhecimentos acumulados, surgiram novos questionamentos: haveria variações diuturnas da atividade das enzimas PEPC e NR nas diferentes porções das folhas de G. monostachia induzidas ao CAM? A maior disponibilidade de esqueletos carbônicos à noite (acúmulo de acidez) influenciaria positivamente a atividade da NR, deslocando seu pico de atividade para o período noturno? As variações dos teores endógenos de citocininas acompanhariam as possíveis mudanças da atividade da PEPC e da NR, indicando, assim, a participação dessa classe hormonal na regulação dessas enzimas? O presente trabalho teve por objetivo principal investigar uma possível regulação da atividade das enzimas PEPC e NR por citocininas em folhas destacadas da bromélia epífita com tanque, Guzmania monostachia (Bromeliaceae) induzidas ao CAM. Foi esperado com esta pesquisa aprofundar os estudos sobre a inter-relação entre o comportamento fotossintético, a capacidade de assimilação de nitrogênio e a possível regulação das atividades da PEPC e da NR por citocininas endógenas. Análises de acidez titulável, ácidos orgânicos, amido endógeno e da atividade da enzima malato desidrogenase (MDH) foram realizadas, confirmando a indução do CAM nas folhas isoladas de G. monostachia mantidas em polietilenoglicol (PEG) a uma concentração de 30%. O uso desse composto foi eficiente na redução do conteúdo relativo de água e na imposição da deficiência hídrica foliar. Além disso, pôde-se verificar a maior expressão do CAM na porção apical das folhas mantidas em PEG 30%, quando comparada à porção basal. Análises da atividade da PEPC e da NR permitiram verificar a separação espacial dessas enzimas. A primeira apresentou maior atividade no ápice foliar, enquanto a segunda mostrou a maior atividade na porção basal. Apesar disso, não foi observada a separação temporal dessas enzimas, uma vez que ambas apresentaram picos de atividade noturna. A maior atividade da NR durante o período escuro (01 hora) foi verificada nas folhas-controle ou sob deficiência hídrica. Esse resultado sugere que outros fatores, diferentes do metabolismo CAM, influenciaram para a ocorrência da maior atividade dessa enzima durante o período noturno. Os resultados obtidos ainda sugerem que as citocininas possivelmente atuaram como um regulador negativo para a atividade da PEPC durante o dia, uma vez que os maiores níveis endógenos desse hormônio foram observados durante esse período, enquanto a maior atividade dessa enzima foi verificada durante a noite, quando os teores de Z+iP decaíram significativamente. A aplicação de Z ou iP resultou também num decréscimo da atividade dessa enzima. Por outro lado, as citocininas atuaram como um provável regulador positivo para a atividade da NR, uma vez que a maior atividade noturna dessa enzima foi antecedida em 3 ou 6 horas pelos maiores níveis endógenos de citocininas na porção basal das folhas mantidas em água ou PEG 30%, respectivamente. A aplicação de citocininas-livres aumentou significativamente a atividade da NR na base das folhas destacadas mantidas em água ou PEG 30% / Prior studies undertaken in the Laboratory of Plant Physiology on IBUSP with Guzmania monostachia have shown that during water shortage, CAM induction occurs with greater expression in the apical portion of the leaf. In the case of another species (Vriesea gigantean), more intense nitrate reductase (NR) enzyme activity was observed in the basal portion during the daytime. In a certain terrestrial bromeliad (Ananas comosus), signaling by cytokinins, both in the induction of gene expression as well as NR activation, was observed. According to other laboratories, the cytokinins seem to play a negative regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) in CAM induced Mesembryanthemum crystallinum plants. As a result of accumulated knowledge, new questions have arisen, such as: Are there daily variations in PEPC and NR enzymes activity in the different portions of CAM induced leaves of G. monostachia? Would the more pronounced nocturnal availability of carbon skeletons (accumulation of acidity) positively influence NR activity, with consequential displacement of its peak of activity to this period? Would variations in endogenous cytokinins concentration accompany possible changes in PEPC and NR activity, thereby indicating the participation of this hormonal class in their regulation? The main aim in the present study was to investigate the possible regulation of PEPC and NR activity by cytokinins in detached CAM-induced leaves of the epiphyte tank bromeliad Guzmania monostachia (Bromeliaceae). The expectations with this research were to study more deeply the inter-relationship between photosynthetic behavior, the capacity for nitrogen assimilation and the possible regulation of PEPC and NR activity by endogenous cytokinins. Analyses of titratable acidity, organic acids, endogenous starch and malate dehydrogenase (MDH) enzyme activity confirmed CAM induction in isolated leaves of G. monostachia kept in polyethylene glycol (PEG) at a concentration of 30%. The use of this compound was efficient in reducing relative water content and imposing leaf water deficiency. Furthermore, compared to the basal portion, greater CAM expression could be observed in the apical portion of leaves kept in PEG 30%. Analyses of PEPC and NR activity allowed detecting their mutual spatial separation, seeing that, in the first greater activity was concentrated in the leaf apex, while in the second this was more pronounced in the basal portion. Even so, no temporal separation could be observed, since peak of activity for both occurred at night. The peak of nocturnal NR activity (1 hour) was observed in control leaves or those undergoing water deficiency, thereby implying that factors, other than CAM metabolism, exerted an influence on the occurrence of more intense activity of this enzyme at this time. Furthermore, there were indications that cytokinins possibly act as a negative regulator of PEPC activity during the daytime, when the highest endogenous levels of this hormone were observed, whereas it was apparent that the most intense activity of this enzyme actually occurred at night, when Z+iP rates decreased significantly. Z or iP application also induced a decrease in the activity of this enzyme. On the other hand, the cytokinins acted as a positive regulator of NR activity, since the nocturnal peak of activity of this enzyme was preceded by 3 or 6 hours by higher endogenous levels of cytokinins in the basal portion of leaves maintained in water or PEG 30%, respectively. The application of free cytokinins induced a significant increase in NR activity in the base of detached leaves kept in water or PEG 30%

Os ritmos circadianos coordenam grande parte dos mecanismos fisiológicos, principalmente no metabolismo do nitrogênio, inclusive a assimilação do nitrato, que é a forma de nitrogênio mais incorporada pelos organismos fotossintéticos marinhos. Sua assimilação é feita pela enzima nitrato redutase (NR) que é regulada de forma sistêmica e em vários níveis: transcricional, pós-transcricional e pós-traducional. Tal modulação é exercida por diversos fatores como nitrato, luz, glutamato, quinases e por fatores de transcrição centrais do ritmo circadiano. A fotossíntese fornece os esqueletos de carbono e poder redutor para a incorporação do nitrogênio na síntese de glutamato. Gracilaria birdiae é uma macroalga endêmica do litoral brasileiro e ainda precisa de mais estudos em fisiologia, apesar da sua grande importância econômica. Este estudo desenvolveu um novo protocolo para o ensaio em larga escala da atividade enzimática da NR e analisou a oscilação do desempenho fotossintético ao longo do dia em G. birdiae. A alga, proveniente do Rio Grande do Norte, foi isolada a nível unialgal e apresentou uma taxa de crescimento relativo diário de 6,5% em laboratório. O novo protocolo descrito propõe as seguintes adaptações: amostragem de 20 mg de biomassa algal em vez de 100 mg, extrato bruto com 100 µL em vez de 1 mL, ensaio enzimático de 50 µL e parada da reação com sulfanilamida em vez de EtOH/ZnSO4. Estas modificações permitem o ensaio enzimático da NR semi-purificada de 8 testes com réplicas experimentais e biológicas e controle negativo (96 ensaios no total) em 3 horas. A caracterização enzimática demonstrou os seguintes parâmetros ótimos para atividade máxima: tampão fosfato pH 8, temperatura 25°C, 60 minutos de incubação, 1,25 mMol de nitrato e 50 µMol de NADH. A atividade máxima de 5,4 ± 0,7 nMol.min-1.mg-1 de proteínas e o KM 6 ± 2,2 µMol.L-1 para NADH e de 109 ± 11 µMol.L-1 para o nitrato. A enzima não apresentou atividade na presença de NADPH e demonstrou atividade 48 vezes maior que no protocolo inicial. Descrevemos um método preciso e reprodutível para análise em larga escala da atividade da NR que pode ser utilizado em estudos comparativos de cinética enzimática da NR de diferentes espécies ou em estudos de ritmos biológicos. A análise do desempenho fotossintético, feita em coletas de 15 mg de alga, foi caracterizada pela fluorescência da clorofila, demonstrando os seguintes parâmetros máximos: taxa de transporte de elétrons relativa (rETR) de 15,29 µMol elétrons.m-2.s-1, eficiência fotossintética (alfa) de 0,37 fótons/elétrons, irradiância de saturação (IK) foi de 41,32 µE.m-2.s-1 e houve fotoinibição a partir de 300 µE.m-2.s-1. Apenas o parâmetro alfa apresentou oscilação significativa em claro constante e manteve o período de 24 horas, apesar de ter diminuído sua amplitude em 50%. Isso pode ser devido a um controle pelo mecanismo central dos ritmos circadianos sobre proteínas ou pigmentos ligados ao fotossistema II, influenciando na capacidade de transformação de fótons em elétrons. Paralelamente, a aclimatação da alga à luz constante pode ter levado a uma queda na produção de pigmentos e fotoxidação, justificando a queda nos valores médios de alfa. G. birdiae é uma alga com grande importância econômica e ecológica e este estudo, ligado a outros trabalhos de fisiologia, confirma seu grande potencial para estabelecimento como organismo modelo para estudos fisiologia e fotossíntese / Circadian rhythms control most of physiological processes, including nitrate assimilation. This nutrient is the most incorporated form of nitrogen by marine plants and its assimilation is made by the nitrate reductase enzyme (NR) that is highly regulated in all levels expression, since mRNA transcription until protein degradation. Many factors coordinate this regulation, including the nitrate itself, light glutamate, kinases and by transcription factors of the central oscillator of the circadian rhythms. Photosynthesis also plays an especial role in NR regulation through carbon skeleton and NADPH synthesis that allows the last step of nitrate assimilation: glutamate synthesis. Gracilaria birdiae is an endemic marine rhodophyte from Brazil that still lacks physiological and molecular studies despite its extensively exploitation for agar-agar extraction. This study aimed the development of a large scale enzymatic assay of NR (NRA) and the analysis of daily oscillation of photosynthesis performance for G. birdiae. The algae, collected ant Rio Grande do Norte state, was isolated to a unialgal level and presented an average of relative daily growth rate of 6.5% in laboratory. The new protocol here described proposes the following adaptations for NRA: sampling of 20 mg instead of 100 mg, 100 µL of crude extract rather than 1 mL, NRA in 50 µL in place of 1 mL and reaction stop with sulphanilamide instead of an EtOH/ZnSO4 system. These changes allow the assay of the semi-purified NR of 24 samples all with its experimental and biological triplicates and negative control in 3 hours. Phosphate buffer at pH 8, 25°C, 60 minutes of incubation, 1.25 mMol of nitrate and 50 µMol of NADH. The maximum activity was 5.4 ± 0.7 nMol.min-1.mg-1 of protein and a KM of 6 ± 2.2 µMol.L-1 for NADH and of 109 ± 11 µMol.L-1 for nitrate. NR didn\'t show any activity in the presence of only NADPH as the electron donor and showed and 48 times greater activity in the new protocol, compared to the old one. We describe here an accurate and reproducible method for large scale NRA that can be used in comparative studies of NR kinetics or in biological rhythms of NR. The analysis of photosynthetic performance, made in 15 mg sampling of algal biomass, was characterized through chlorophyll fluorescence, revealing the maximum values of these parameters: relative electrons transfer rate (rETR) of 15,29 µMol elétrons.m-2.s-1, photosynthetic efficiency (the alpha parameter) of 0,37 photons/electrons, the saturating irradiance (IK) was 41.32 µE.m-2.s-1 and there was photoinhibition below the irradiance of 300 µE.m-2.s-1. The only variable that oscillated during the continuous light experiment and maintained the 24-hour period was the Alfa parameter, besides its 50% lower amplitude. This oscillation can be due to an endogenous control of the central circadian oscillator into proteins or pigments bound to the photosystem II, influencing the capacity of photon-electron transformation. At the same time, the acclimation to constant light could have driven the algae to a damping of pigment production and photoxidation, what explains the fall of alpha average values. G. birdiae is an alga with great economic and ecological relevance and this study confirms the potential for its establishment as a model organism.