Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2019-02-01T09:56:12Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thaís Forest Giacomello - 2019.pdf: 3222145 bytes, checksum: 30b7cb27105455314142954d1f75610f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2019-02-01T10:05:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thaís Forest Giacomello - 2019.pdf: 3222145 bytes, checksum: 30b7cb27105455314142954d1f75610f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2019-02-01T10:05:20Z (GMT). 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Thus, it is extremely important to develop protocols that can assist in determining the correct structures of these molecules. In this work aimed to develop a parameterized protocol for NMR 13C chemical shift calculations with the purpose of assisting in the correct determination of polyphenol type molecules. Thus, a group of polyphenols, specifically a subclass of these, chalcones, having varied substituents and experimental structural elucidation were selected in the literature. This base of chalcones was submitted to randomized conformational searches using Monte Carlo method and MMFF force field. In addition, the configurators with energy of up to 3 kcal/mol of each chalcone were calculations optimization of geometry and frequency. The chemical shift of 13C was calculated after assuming Boltzmann statics. All of these calculations were performed using the mPW1PW91 / 6-31G (d) level. After that, the scaled chemical shifts (δesc) was defined. This was obtained using the expression δ𝑒𝑠𝑐 = 𝑎 𝑥 δ𝑐𝑎𝑙𝑐 + 𝑏, where a and b are the coefficients of linear regressions obtained between calculated (δcalc) versus experimental chemical shift. In order to validate the protocol, the scaling factor were used to obtain δesc values for chalcones different from those used in the base. The result shows that the level of theory applied reproduced excellently the experimental data. Calculations performed with a scaling factor lead to a better result than when there is no use of this factor. In addition, the applicability of the scaling factor allows the cancellation of systematic errors, which make δesc are closer to the experimental ones. Thus, the parameterized protocol was shown to be an important tool for the structural elucidation of polyphenols through theorotical calculations of ¹³C NMR chemical shifts. / Chalcona é uma classe de produtos naturais que tem muito interesse, principalmente farmacêutico, devido as suas ações biológicas. São moléculas não rígidas e complexas fazendo com que suas caracterizações estruturais se tornem tarefa difícil em técnicas experimentais. As técnicas espectroscópicas, nos últimos anos, tiveram um desenvolvimento muito rápido auxiliando bastante a elucidação de produtos naturais. No entanto, vários casos de revisão de estruturas de produtos naturais foram encontrados na literatura devido a ter elucidações errôneas em técnicas analíticas de rotinas experimentais. Com isso, é de extrema importância desenvolver protocolos que podem auxiliar na determinação de estruturas corretas dessas moléculas. Este trabalho buscou desenvolver um protocolo parametrizado para cálculo de deslocamento químico de RMN 13C com o intuíto de auxilar a determinação correta de moléculas tipo polifenóis. Assim, selecionou-se um grupo de polifenóis, especificamente uma subclasse desses, as chalconas, que possuissem substituintes variados e elucidação estrutural experimental na literatura. Essa base de chalconas foi submetida a buscas conformacionais estocásticas, onde usa-se o método Monte Carlo e campo de forças merck. Então, os confôrmeros com energia de até 3 kcal/mol de cada chalcona foram selecionados e assim feito cálculos de otimização de geometria e frequência. O deslocamento químico de 13C foi calculado após, considerando a distribuição populacional de Boltzmann. Todos esses cálculos foram realizados utilizando o nível mPW1PW91/6-31G(d). Após, com esses dados foi definido o deslocamento químico escalonado (δesc). Esse, foi obtido utilizando a expressão 𝛿𝑒𝑠𝑐=𝑎 𝑥 𝛿𝑐𝑎𝑙𝑐+𝑏, onde a e b são os coeficientes de regressões lineares obtidas entre os deslocamentos químicos calculados (δcalc) e experimentais. Para validação do método, o fator de escalonamento foi utilizado para obter os valores de δesc em outras chalconas diferentes das utilizadas na base. O resultado mostra que o nível de teoria aplicado permite uma boa reprodução dos dados experimentais. Os cálculos realizados com fator de escalonamento levam a um melhor resultado do que quando não há o uso deste fator. Além disso a aplicabilidade do fator de escalonamento permite o cancelamento de erros sistemáticos, o que faz com que os valores de δesc sejam mais próximos aos experimentais. Assim, o protocolo parametrizado mostrou-se uma importante ferramenta para a elucidação estrutural de polifenois através de cálculos de deslocamentos químicos de RMN ¹³C.

Tropomiosina (Tm) é uma das proteínas que compõe o filamento fino (actina, Tm, Troponina) do sistema muscular esquelético e desempenha um importante papel na regulação da contração muscular. Tm é um coiled-coil de 284 resíduos que forma longos homopolímeros lineares através da sobreposição de onze resíduos entre os terminais de Tms adjacentes (Interação cabeça-cauda) em condições de baixa força iônica. A presença de vários resíduos carregados (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) nas extremidades da Tm sugere que contatos intermoleculares eletrostáticos entre estes aminoácidos podem ter um importante papel na estabilidade dos polímeros. Entretanto, a estrutura do complexo cabeça-cauda demonstra que a maioria dos contatos intermoleculares na interface é de natureza hidrofóbica. A fim de analisarmos a contribuição dos grupos carregados para a estabilidade do complexo cabeça-cauda, construímos fragmentos recombinantes correspondentes à metade amino (ASTm1-142 ) e carboxi (Tm143-284(5OHW269)) terminais da proteína contendo mutações pontuais daqueles resíduos para alanina, e adicionalmente H276 para Glu. Medimos a afinidade entre todas as possíveis combinações destes fragmentos na ausência e presença de íons Mg2+, visto que este cátion está sempre presente em condições fisiológicas e é importante para estabilizar a interação entre Tm e actina. Os efeitos das mutações foram analisados por simulações de docking, desnaturações térmicas e ciclos de duplos mutantes. Os resultados demonstram que os aminoácidos K5, K7 e D280 presentes na interface formam contatos intermoleculares essenciais para a estabilidade do complexo. Enquanto, D2, K6, D275 e H276 não participam na formação de contatos intermoleculares, no entanto, contribuem para a estabilidade da interação cabeça- cauda através de suas interações intramoleculares que atuam na estabilidade das hélices individuais. Os aumentos na estabilidade da metade C-terminal da Tm (Tm143-284(5OHW)) induzidos por Mg2+ foram dependentes das mutações neste trecho da proteína sugerindo a presença de um sítio de ligação para este íon na extremidade carboxi terminal da molécula no trecho que forma a interação cabeça- cauda. Construímos um fragmento menor do C-terminal (Tm259-284(W269)) para acompanharmos mudanças no deslocamento químico induzidas pela ligação do íon usando ressonância magnética nuclear. Os resultados obtidos comprovaram nossa hipótese e nos permitiram definir pela primeira vez que a estrutura da Tm tem um ou mais sítios de ligação Mg2+ em uma região próxima ao resíduo H276 que está localizado entre vários resíduos carregados negativamente que participam da interação cabeça-cauda. Por último, estudamos os efeitos de solventes cosmótropicos (TFE e glicerol) nas estabilidades dos fragmentos da Tm, uma vez que a instabilidade (flexibilidade) da extremidade C-terminal é importante para a formação do complexo cabeça-cauda. Observamos que TFE, porém não glicerol, reduziu a afinidade entre os terminais. Ambos os co-solventes induziram aumentos na estabilidade dos fragmentos, no entanto, apenas TFE induziu um aumento no conteúdo de α-hélice e causou uma redução significativa na cooperatividade de desenovelamento das proteínas. Estes resultados indicam que estes compostos orgânicos estabilizam as estruturas dos fragmentos individuais da Tm de maneiras diferentes e que estas diferenças podem estar relacionadas aos diferentes efeitos observados na formação da interação cabeça-cauda. / Tropomyosin (Tm) is a protein component of the skeletal muscle thin filament (actin, Tm, Troponin) which has an important role in the regulation of muscle contraction. Tm is a dimeric coiled-coil (284 aminoacids) which forms long linear homopolymers through the overlap of eleven residues of adjacent Tm termini (Head- to-tail interaction) in low ionic strength conditions. The presence of several charged amino acids (D2, K5, K6, K7, D275, H276 e D280) in Tm extremities suggests that electrostatic contacts among those residues may have an important role in the stability of the polymers. Nevertheless, the solution structure of the head-to-tail complex demonstrated that most of the contacts in the interface are hydrophobic. In order to study the contribution of these charged residues to the stability of the head- to-tail complex, we built recombinant fragments corresponding to the amino (ASTm1-142) and carboxy (Tm143-284(5OHW269)) termini containing single mutations of those amino acids to alanine, and additionally a substitution of H276 for Glu. We measured the binding affinities among all possible combinations of wild-type and mutant fragments in the absence or presence of Mg2+ ions. This cation is always physiologically present in the muscle and it is known to strengthen the binding of Tm to actin. The effects of the mutations were analyzed by protein-protein docking, thermodynamic cycles and thermal denaturations. The results show that residues K5, K7 and D280 are essential to the stability of the complex. Though D2, K6, D275 and H276 are exposed to the solvent and do not participate in intermolecular contacts in the NMR structure, they may contribute to the complex stability by modulating the stability of the helices at the Tm termini. Mg2+-induced increases in stability of the C- terminal were sensitive to mutations in residues located in the head-to-tail overlap region, suggesting that Mg2+ ions may bind specifically to the carboxy extremity of the protein. We produced a small peptide (Tm259-284(W269)) to follow amide chemical shift perturbations upon Mg2+ binding by nuclear magnetic resonance measurements. The results obtained with this peptide allowed us to define for the first time that the Tm structure has one or more Mg2+ binding sites in a region centered in the vicinity of H276 in which are located several negatively charged residues that participate in the head-to-tail interaction. We also studied the effects of kosmotropic co-solvents (TFE and glycerol) in the stability of Tm fragments, as the instability (flexibility) of the C- terminal region has been pointed as important for the formation of the head-to-tail complex. We observed that TFE, but not glycerol, reduces the affinity between the termini. Both TFE and glycerol increased the stability of the isolated N- and C- terminal fragments; however, only TFE caused an increase in the helical content and a significant reduction in the cooperativity of unfolding of the proteins. Our results show that these two co-solvents stabilize the structures of individual Tm fragments in different manners and that these differences may be related to their different effects on head-to-tail complex formation.

Base teórica: Artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune que afeta as articulações e progride de maneira simétrica e erosiva. Além dos achados articulares, pode ocorrer de perda muscular e síndrome da caquexia. Atualmente, não existe um marcador que sirva de preditor da síndrome de caquexia reumatoide. Estudos metabolômicos em pacientes com AR demonstram uma complexidade em encontrar um biomarcador para caquexia. Ademais, não há modelo experimental de caquexia descrito na literatura, mas o modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) possui potencial de ser modelo de caquexia reumatoide. A partir deste modelo, pode-se fazer a busca por biomarcadores de caquexia reumatoide via metabolômica. Objetivo: Avaliar o modelo de CIA como modelo experimental de caquexia reumatoide. Avaliar o perfil metabólico da urina no modelo de CIA e correlacionar com parâmetros clínicos de caquexia reumatoide em busca de possíveis biomarcadores. Métodos: Camundongos machos DBA/1J foram induzidos (CIA; n=13) no dia zero e receberam reforço 18 dias após, e grupo mantidos saudáveis sem indução (CO; n=11). Nos dias 0, 18, 25, 35, 45, 55 e 65 após a indução, foram realizados: coleta de urinas; teste de desempenho físico; teste de locomoção espontânea; teste de força; medida do volume do edema da pata traseira; avaliação do escore clínico; pesagem; e avaliação da ingestão alimentar. Após os 65 dias, os animais foram eutanasiados e tecidos musculares (gastrocnêmio – GA; e tibial anterior – TA) foram dissecados para pesagem e realização da razão sarcoplasmática. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias, seguido de Bonferroni, ou teste t de Pearson, com significância a partir de um p<0,05. A urina coletada foi submetida à ressonância nuclear magnética (1D e 2D J-res). Os metabolitos foram identificados via Chenomx (1D) e pelo Birmingham Metabolite Library (BML; 2D J-res). Utilizou-se a o modelo estatístico de PCA, PLSDA e PLSR para criar ranqueamento de metabolitos (significância a partir de um p<0,05). Analizou-se as rotas metabólicas via Metaboanalyst a partir do ranqueamento de metabólitos obtidos. Os metabólitos obtidos foram filtrados para rotas metabólicas que ocorrem no músculo para identificação de potenciais biomarcadores de perda muscular. Resultados: O grupo CIA apresentou redução de até 24% na locomoção espontânea, de até 66% na força e de até 24% no teste de desempenho físico após 35 dias da indução, bem como redução no peso do GA (24%) e TA (25%), e relação sarcoplasmática (22 e 23%, respectivamente) em relação ao grupo CO. Os modelos estatísticos de PCA, PLSDA e PLSR, e o filtro pelas rotas metabólicas relacionadas com o músculo geraram uma lista de 28 metabólitos e relacionados com o desenvolvimento da doença, sendo eles: 3-metilhistidina, 4-aminobutirato, acetilcolina, arginina, aspartato, carnosina, creatina, creatinina, glutamina, histamina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, lisina, mio-inositol, dimetilglicina, acetilalanina, acetilmetionina, pantotenato, fenilalanina, fosfocolina, fosfocreatina, piridoxina, sarcosina, succinilacetona, tiamina, e urocanato. Conclusão: Em concordância com os resultados de redução nos parâmetros de: massa muscular, locomoção espontânea, força e desempenho físico, somando-se a ausência de anorexia bem como mudança no peso, o modelo animal de CIA representa um modelo experimental próprio para caquexia reumatoide. A análise do perfil metabólico deste modelo permite sugerir 28 metabólitos relacionados ao processo de perda muscular, que podem vir a ser biomarcadores de caquexia reumatoide, objetivando prognóstico, diagnóstico e acompanhamento da síndrome. Destes metabólitos, os principais são pertencentes ao metabolismo de: histidina; arginina e prolina; glicina, serina e treonina; fosfocreatina, bem como outros aminoácidos e vitaminas do complexo B. / Background: Rheumatoid Arthritis (RA) is an autoimmune disease that affects the joints and has a symmetric development and it is erosive. Besides joint damage, it can develop muscle loss progress into cachexia syndrome. Currently, there is no marker that can predict it development in rheumatoid patients. Metabolomics in RA have shown to be complex to find out a biomarker for this syndrome. Also, there is no experimental model of cachexia described in literature yet; however the collageninduced arthritis (CIA) animal model seems to be a feasible model for rheumatoid cachexia. With this model, the research for a biomarker of rheumatoid cachexia can be done by metabolomics. Objectives: It will be evaluated if the CIA animal model can be also an animal model of rheumatoid cachexia. Afterwards, it will be evaluated a metabolic profile from urine of this animal model and correlate with clinical signs of rheumatoid cachexia to find out plausible biomarkers of it. Methods: Male DBA/1J mice were submitted to CIA (n=13), immunization occurred at day zero and a booster was performed 18 days after, and a healthy group with no induction (CO; n=11). At the 0,18, 25, 35, 45, 55 and 65 days after the first injection, it was done: urine collection; physical performance test; free exploratory locomotion test; strength test; hindpaw edema volume measurement; follow up disease development; weighted; and food intake. After the 65 days, animals were euthanized and muscle (gastrocnemious – GA; and tibial anterior – TA) were dissected, and weighted for sarcoplasmic ratio. Data were analyzed by two-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc, and t-test of Pearson, and statistical critical limit was set for p<0.05. The collected urine was used for nuclear magnetic resonance (1D and 2D J-res). Metabolites were identified by Chenomx (1D) and by the Birmingham Metabolite Library (BML; 2D J-res). Statistical model were performed using PCA, PLSDA and PLSR to create a ranking list of the metabolites (statistical critical limit was set for p<0.05). It was analyzed the metabolic pathway by Metaboanalyst from the data of metabolite ranking list. Then, the metabolite list was filtered by the metabolic pathways that take place in muscle tissue, in order to identify plausible biomarkers of muscle loss. Results: CIA group has shown reduction in up to 24% of free locomotion fatigue, up to 66% of strength and up to 24% of endurance physical performance after 35 days of the induction, as well as a decrease in GA (24%) and TA (25%) weight, and sarcoplasmic ratio also reduced (22 and 23%, respectivamente) related to CO group. The PCA, PLSDA and PLSR statistical models, and the filter by metabolic pathways related to muscle provided a list of 28 metabolites related to disease development, as can be listed: 3-methylhistidine, 4-aminobutyrate, acetylcholine, arginine, aspartate, carnosine, creatine, creatinine, glutamine, histamine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, lysine, myo-inositol, dimethylglycine, acetylalanine, acetylmethionine, pantothenate, phenylalanine, phosphocholine, phosphocreatine, pyridoxine, sarcosine, succinylacetone, thiamine, and urocanate. Conclusions: Accordingly with the data with reduction of: muscle mass, spontaneous locomotion, strength and physical performance, added with absence of anorexia as well as weight change, CIA animal model is a feasible experimental model for rheumatoid cachexia. Concerning the metabolic profile from this model, it can be suggested 28 metabolites related to muscle loss in which can be tested for biomarker of rheumatoid cachexia, targeting prognosis, diagnosis, and syndrome follow up. From those metabolites, the main ones are engaged to metabolism of: histidine; arginine and proline; glycine, serine and threionine; phosphorcreatine, as well as other amino acids and vitamins from B complex.

Os alcaloides têm apresentado diversas atividades biológicas. Entre eles, a montanina vem demonstrando um bom desempenho nesse sentido, como, atividade antioxidante, ação inibitória do crescimento de culturas bacterianas e importante atividade de inibição do crescimento de linhagens tumorais. Atualmente, não existem muitos relatos da sua caracterização ou métodos analíticos quantitativos disponíveis na literatura para atribuir seu teor. Assim, após purificação, a caracterização da montanina foi realizada por calorimetria exploratória diferencial (DSC), espectroscopia na região do ultravioleta (UV), infravermelho (IV), espectrometria de massas (CLAE-EM), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H), de carbono (RMN13C) e em 2D homo e heteronucleares tais como COSY (nJH-H, escalar), NOESY (nJH-H, dipolar), HSQC (1JH-C, escalar) e HMBC (nJH-C, escalar). Na sequência, foram desenvolvidos métodos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplada aos detectores ultravioleta e aerossol carregado (CLAE- UV/DAC) para a quantificação da montanina. Os mesmos foram validados, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, intervalo, limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão e robustez. Os resultados obtidos foram avaliados por estatística descritiva e os métodos comparados pelo resultado da análise de variância (ANOVA). Desse modo, foram desenvolvidos procedimentos que podem ser aplicados para aprimorar o controle de qualidade, contribuindo para assegurar a eficácia terapêutica da montanina. / Alkaloids have several biological activities. Among them, montanine have shown antioxidant activity, inhibitory effect on bacterial growth and important activity inhibiting growth of some tumor cell lines. Currently, there are a few reports about its characterization as well as quantitative analytical methods to determine its purity. Thus, after a purification step, montanine will be characterized by its differential scanning calorimetry (DSC), ultraviolet spectroscopy (UV), infrared spectroscopy (IR), mass spectrometry (HPLC-MS), nuclear magnetic resonance of proton (NMR1H), carbon (NMR13C) and 2D homo and heteronuclear such as COSY (nJH-H, scalar), NOESY (nJH-H, dipolar), HSQC (1JH-C, scalar) and HMBC (nJH-C, scalar). Further, quantitation methods will be developed employing high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with ultraviolet and charged aerosol detectors (HPLC-UV/CAD). These methods will be validated regarding the parameters specificity, linearity, range, detection limit, quantitation limit, precision, accuracy and robustness. The results will then be evaluated by descriptive statistics and the developed methods will be compared using analysis of variance (ANOVA). Therefore, tests will be developed that can be used to improve quality control, helping to ensure the therapeutic efficacy of montanine.

Proteins and DNA are essential to life as we know it and understanding their function is understanding their structure and dynamics. The importance of the latter is being appreciated more in recent years and has led to the development of novel interdisciplinary techniques and approaches to studying protein function. Three techniques to study protein structure and dynamics have been used and combined in different ways in the context of this thesis and have led to a better understanding of the three systems described herein. X-ray crystallography is the oldest and still arguably most popular technique to study macromolecular structures. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a not much younger technique that is a powerful tool not only to probe molecular structure but also dynamics. The last technique described herein are molecular dynamics (MD) simulations, which are only just growing out of their infancy. MD simulations are computer simulations of macromolecules based on structures solved by X-ray crystallography or NMR spectroscopy, that can give mechanistic insight into dynamic processes of macromolecules whose amplitudes can be estimated by the former two techniques. MD simulations of the model protein GB3 (B3 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G) were conducted to identify origins of discrepancies between order parameters derived from different sets of MD simulations and NMR relaxation experiments.The results highlight the importance of time scales as well as sampling when comparing MD simulations to NMR experiments. Discrepancies are seen for unstructured regions like loops and termini and often correspond to nanosecond time scale transitions between conformational substates that are either over- or undersampled in simulation. Sampling biases can be somewhat remedied by running longer (microsecond time scale) simulations. However, some discrepancies persist over even very long trajectories. We show that these discrepancies can be due to the choice of the starting structure and more specifically even differences in protonation procedures. A test for convergence on the nanosecond time scale is shown to be able to correct for many of the observed discrepancies. Next, MD simulations were used to predict in vitro thermostability of members of the bacterial Ribonuclease HI (RNase H) family of endonucleases. Thermodynamic stability is a central requirement for protein function and a goal of protein engineering is improvement of stability, particularly for applications in biotechnology. The temperature dependence of the generalized order parameter, S, for four RNase H homologs, from psychrotrophic, mesophilic and thermophilic organisms, is highly correlated with experimentally determined melting temperatures and with calculated free energies of folding at the midpoint temperature of the simulations. This study provides an approach for in silico mutational screens to improve thermostability of biologically and industrially relevant enzymes. Lastly, we used a combination of X-ray crystallography, NMR spectroscopy and MD simulations to study specificity of the interaction between Drosophila Hox proteins and their DNA target sites. Hox proteins are transcription factors specifying segment identity during embryogenesis of bilaterian animals. The DNA binding homeodomains have been shown to confer specificity to the different Hox paralogs, while being very similar in sequence and structure. Our results underline earlier findings about the importance of the N-terminal arm and linker region of Hox homeodomains, the cofactor Exd, as well as DNA shape, for specificity. A comparison of predicted DNA shapes based on sequence alone with the shapes observed for different DNA target sequences in four crystal structures when in complex with the Drosophila Hox protein AbdB and the cofactor Exd, shows that a combined ”induced fit”/”conformational selection” mechanism is the most likely mechanism by which Hox homeodomains recognize DNA shape and achieve specificity. The minor groove widths for all sequences is close to identical for all ternary complexes found in the different crystal structures, whereas predicted shapes vary between the different DNA sequences. The sequences that have shown higher affinity to AbdB in vitro have a predicted DNA shape that matches the observed DNA shape in the ternary complexes more closely than the sequences that show low in vitro affinity to AbdB. This strongly suggests that the AbdB-Exd complex selects DNA sequences with a higher propensity to adopt the final shape in their unbound form, leading to higher affinity. An additional AbdB monomer binding site with a strongly preformed binding competent shape is observed for one of the oligomers in the reverse complement strand of one of the canonical (weak) Hox-Exd complex binding site. The shape preference seems strong enough for AbdB monomer binding to compete with AbdB-Exd dimer binding to that same oligomer, suggested by the presence of both binding modes in the same crystal. The monomer binding site is essentially able to compete with the dimer binding site, even though binding with the cofactor is not possible, because its shape is very close to the ideal shape. A comparison of different crystal structures solved herein and in the literature as well as a set of molecular dynamics simulations was performed and led to insights about the importance of residues in the Hox N-terminal arm for the preference of certain Hox paralogs to certain DNA shapes. Taken together all these insights contribute to our understanding of Hox specificity in particular as well as protein-DNA interactions in general.

Neste trabalho estudamos a dinâmica molecular e o empacotamento em semicondutores orgânicos com diferentes tamanhos de cadeias conjugada usando uma estratégia de multi-técnicas, em particular Ressonância Magnética Nuclear (RMN), espalhamento de Raios-X de alto ângulo (WAXS), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), espectroscopia Raman e espectroscopias Ópticas de absorção UV-Vis e fluorescência. Nestes estudos utilizamos oligômeros de fluorenos, com 3, 5 e 7 unidades repetitivas e copolímeros multibloco conjugados/não-conjugados com as unidades conjugadas constituídas por unidades de fenileno de vinileno (PV) e as não-conjugadas formadas por unidades metilênicas. No estudo com oligômeros, foi mostrado que a capacidade e a forma de ordenamento das cadeias dependem do número de unidades repetitivas, com o Pentâmero possuindo uma tendência muito maior de cristalização. Essa conclusão foi suportada por cálculos teóricos ab-initio, que mostraram que a conformação de menor energia do pentâmero favorece as interações intercadeias e, portanto, o ordenamento de longo alcance. Os resultados referentes aos estudos de dinâmica molecular corroboraram essas características e mostraram que a ativação dos movimentos moleculares nas fases amorfas dos oligômeros são predominantemente dependentes dos comprimentos das cadeias oligoméricas, em concordância com o comportamento encontrado para as suas Tg´s. No estudo referente aos copolímeros multiblocos, foi encontrado que a presença dos grupos espaçadores alifáticos inibem a forte tendência de cristalização das unidades de PV, porém não impedem a agregação dessas unidades. Foi verificado que, a dispersão de tamanhos das unidades agregadas afeta fortemente as características de emissão dos copolímeros, onde a emissão nas cadeias maiores é privilegiada. No que diz respeito a dinâmica molecular, foi observado que a presença de movimentos na região alifática contribui para o aparecimento de processos de relaxação não radiativos o qual inibem a emissão dos copolímeros e provocam alargamento das bandas vibrônicas. Por fim, foi observado que movimentos isotrópicos das cadeias de PV são responsáveis pela transição vítrea dos copolímeros, sendo que as energias necessárias para ativar esses movimentos aumentam com o tamanho da cadeia. Portanto, de forma geral, nossos resultados indicam que mesmo em sistemas com comprimento de cadeias muito bem controlados, as fortes interações intermoleculares presentes em polímeros conjugados, podem tornar a morfologia em estado sólido desses sistemas bastante complexa, sendo que muitas das propriedades ópticas (e provavelmente também elétricas) são afetadas pela forma de empacotamento, desordem conformacional e térmica, além da própria constituição das cadeias. / In this dissertation we present a study of the molecular dynamics and packing in organics semiconductor with different conjugated chains lengths using a of multi-techniques approach, in particular, Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Wide Angle X-ray Scattering (WAXS), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Raman spectroscopy, UV-Vis absorption and fluorescence spectroscopy. The studies were carried-in fluorene oligomers with 3, 5 and 7 repeat units and multi-block conjugated/non-conjugated copolymers with the conjugated part formed by phenylene-vinylene units (PV) and the non-conjugated block formed by methylene units. Concerning the oligomers studies, it was shown that the ability of the chain to form ordered domains as well as the domain structure depend on the number of repeat units, with the pentamer having a higher tendency to crystallization. This conclusion was supported by theoretical ab-initio calculations, which showed that the pentamer conformation favors inter-chain interactions and therefore long-range ordering. The molecular dynamics studies support these characteristics and showed that the activation of molecular motions in oligomers amorphous phase are predominantly dependent on the oligomeric chain lengths, in agreement with the behavior observed for their glass transitions (Tg´s). In the study concerning the multi-block copolymers, it was found that presence of the aliphatic chains inhibit the strong tendency to crystallization of the PV units, but do not prevent their aggregation. It was found that the dispersion in aggregated units sizes strongly affects the copolymers emission, with the emission of larger chains being privileged. Regarding the molecular dynamics, we observed that the presence of motion on aliphatic region contributes to the appearance of non-radiative relaxation processes that inhibit the emission of the copolymers and produce broadening of the vibronic bands. Finally, we observed that isotropic motions of the PV chains are responsible for the copolymers glass transition and the energy required to activate these movements increase with length of the chain. In summary, our results indicate that even in systems with well controlled chains length, the strong intermolecular interactions present in conjugated polymers, can make the solid state morphology of these systems quite complex, which may affect many optical (and probably electric) properties are affected by the packaging structure, thermal and conformational disorder, in addition to the constitution of the chains composition.

A RMN &eacute; uma das principais t&eacute;cnicas usadas no estudo de perfis metab&oacute;licos pois &eacute; uma t&eacute;cnica quantitativa, altamente reprodut&iacute;vel e n&atilde;o-seletiva. Desta forma, o objetivo desta tese foi a aplica&ccedil;&atilde;o da RMN no estudo metab&oacute;lico em diferentes processos biol&oacute;gicos. A primeira aplica&ccedil;&atilde;o foi na an&aacute;lise do perfil metabol&ocirc;mico e metabon&ocirc;mico dos agentes causadores da leishmaniose. Para tal, foram analisados extratos celulares das esp&eacute;cies Leishmania major e Leishmania donovani e extratos destas esp&eacute;cies crescidas com os f&aacute;rmacos miltefosina e paromomicina. Os espectros de RMN de 1H foram analisados pelo programa ChenoMX e os espectros de RMN 2D pelo software TopSpin e as bases de dados HMDB e BMRB. Cerca de 50 metab&oacute;litos foram identificados, como a adenina, arginina, glutamina, glutamato, manose, isoleucina, leucina e tirosina. T&eacute;cnicas quimiom&eacute;tricas como PCA, PLS-DA e heatmaps foram utilizadas para investigar os metab&oacute;litos respons&aacute;veis pela diferencia&ccedil;&atilde;o das duas esp&eacute;cies bem como entre as culturas com e sem f&aacute;rmacos. O segundo estudo foi com o composto metilglioxal. A presen&ccedil;a de metilglioxal em queijos contribui com o escurecimento e deteriora&ccedil;&atilde;o do sabor, mesmo em baixas temperaturas. Por esta raz&atilde;o, foram estudados os produtos da adi&ccedil;&atilde;o de metilglioxal em extrato de queijo parmes&atilde;o e o comportamento de diferentes esp&eacute;cies de lactobacilos na presen&ccedil;a e na aus&ecirc;ncia de metilglioxal em extrato de queijo parmes&atilde;o. Os resultados permitiram um entendimento maior das rea&ccedil;&otilde;es envolvidas entre esta mol&eacute;cula e os componentes do queijo, o que ajudar&aacute; encontrar alternativas para a resolu&ccedil;&atilde;o do problema e aumentar o tempo de prateleira do queijo. O terceiro estudo realizado foi sobre a produ&ccedil;&atilde;o de etanol a partir de biomassa lignocelul&oacute;sica. O objetivo deste estudo foi modificar geneticamente uma esp&eacute;cie de lactobacilo para a produ&ccedil;&atilde;o de etanol e analisar a vinha&ccedil;a de planta de etanol p&oacute;s-fermenta&ccedil;&atilde;o com levedura. Os espectros de RMN de 1H e 1H-13C mostraram que as bact&eacute;rias modificadas s&atilde;o eficientes na produ&ccedil;&atilde;o de etanol e que dois a&ccedil;ucares foram erroneamente identificados por cromatografia como maltose e maltotriose quando na verdade eram trealose e arabinose.&nbsp; Por meio destes destes estudos mostrou-se parte das in&uacute;meras aplica&ccedil;&otilde;es que a RMN tem na metabol&ocirc;mica e que existem diversas ferramentas estat&iacute;sticas dispon&iacute;veis para auxiliar no estudo metabol&ocirc;mico. / NMR is one of the main techniques used in metabolic profile studies because it is a quantitative, highly reproducible and non-selective technique. Thus, the aim of this thesis was the application of NMR in metabolic studies of different biological processes. The first application was the analysis of the metabolomic and metabonomic profile of the causative agents of leishmaniasis. Cell extracts of the species Leishmania major and Leishmania donovani and extracts of these species grown with miltefosine and paromomycin drugs were analyzed. 1H spectra were analyzed by ChenoMX software and 2D spectra by TopSpin software and HMDB and BMRB databases. About 50 metabolites were identified, such as adenine, arginine, glutamine, glutamate, mannose, isoleucine, leucine and tyrosine. Chemometric techniques were used to investigate the metabolites responsible for the differentiation of the two species and between cultures with and without drugs. The second study was with methylglyoxal molecule. The presence of methylglyoxal in cheese contributes to browning and deterioration of flavor, even at low temperatures. For this reason, products of the addition of methylglyoxal in Parmesan cheese extract and the behavior of different species of lactobacilli in the presence and absence of methylglyoxal in Parmesan cheese extract were studied. The results allowed a better understanding of the reactions involved between this molecule and the components of the cheese, which will help find alternatives to solve the problem and increase the shelf life of the cheese. The third study was about the production of ethanol from lignocellulosic biomass. The objective of this study was to genetically modify a lactobacillus species to produce ethanol and analyze the post-fermentation thin stillage. NMR spectra showed that the modified bacteria are efficient in production of ethanol and that two sugars were erroneously being identified by chromatography as maltose and maltotriose when they actually were trehalose and arabinose. These studies showed part of the numerous applications that NMR has in metabolomics and that there are several statistical tools available to assist in metabolomic studies.

La spectroscopie de RMN des solides est une méthode de choix pour la caractérisation de la structure et de la dynamique à l'échelle atomique des matériaux ordonnés et désordonnés. Cependant, l'utilisation de cette technique est limitée par son manque de sensibilité qui empêche l'observation de la surface des matériaux, souvent responsable de leurs propriétés chimiques. Il a été récemment montré que la Polarisation Nucléaire Dynamique (en anglais, Dynamic Nuclear Polarization, DNP) dans les conditions de rotation à l'angle magique (en anglais Magic-Angle Spinning, MAS) permet de surmonter cette limitation. Cette technique permet d'augmenter la sensibilité de la RMN de plusieurs ordres de grandeur. Elle consiste à transférer la polarisation élevée des électrons non-appariés vers les noyaux grâce une irradiation micro-onde. L'objectif de cette thèse consiste à appliquer la MAS-DNP pour sonder la structure de matériaux nanostructurés inorganiques et hybrides. Ces nouvelles informations faciliteront l'amélioration raisonnée de leurs propriétés. Deux classes de matériaux ont été étudiées : des nanoparticules (NP) de silice fonctionnalisées avec des chaînes siloxane et deux formes d'alumine. Les NP de silice fonctionnalisées permettent d'accroître la durée de vie des piles à combustible. Grâce au gain en sensibilité offert par la DNP, il a été possible de sonder les connectivités et les proximités 29Si-29Si dans ces matériaux et ainsi d'élucider le mode de condensation des chaînes siloxane à la surface des NP de silice. La seconde classe de matériaux étudiés comprend deux formes d'alumine : l'alumine- et l'alumine mésoporeuse. La première est largement utilisée dans l'industrie comme catalyseur, support de catalyseur et adsorbant, tandis que la seconde est un matériau prometteur du fait de sa porosité contrôlée et de son accessibilité élevée. Néanmoins, la structure de ces alumines est toujours largement débattue car elles ne forment pas des monocristaux. Grâce à une meilleure compréhension des performances de la MAS-DNP, conduisant notamment à une optimisation de la préparation des échantillons, il a été possible de compenser la très faible efficacité des expériences 27Al sélectives de la surface. La structure de la surface d'alumine a été sondée par des expériences RMN avancées à deux dimensions et une nouvelle expérience a été proposée pour l'observation sélective du cœur de l'alumine. Afin d'obtenir davantage d'informations sur les proximités 27Al-27Al, nous avons cherché à mieux comprendre les séquences de recouplage dipolaire homonucléaire pour des noyaux 27Al. Pour ce faire, la dynamique de spin au cours de ces séquences a été analysée par la théorie de l'hamiltonien moyen et des simulations numériques. En résumé, au cours de cette thèse, nous avons montré comment la MAS-DNP ouvre de nouvelles perspectives pour l'étude des matériaux nanostructurés. / Solid-state NMR spectroscopy is a powerful analytical technique to characterize the atomic-level structure and dynamics of both ordered and disordered materials. However, its main limitation is the lack of sensitivity, particularly preventing studies on the surface of materials, an important region determining their chemical properties. It has been recently shown that Magic Angle Spinning Dynamic Nuclear Polarization (MAS-DNP) could overcome this difficulty. This technique can provide an enhancement of NMR sensitivity of many orders of magnitude. It is based on the partial microwave-driven transfer of the large intrinsic polarization of electron spins to nuclear spins, making impractical NMR experiments feasible. The aim of this work is to use this MAS-DNP technique to help gain new insights into the structure of inorganic and hybrid nanostructured materials. Such knowledge will facilitate the rational improvement of their properties. Two classes of materials are investigated. The first ones are siloxane-functionalized silica nanoparticles (NPs), which can be used to extend the working durability of fuel cells. Owing to the sensitivity enhancement achieved by MAS-DNP, the condensation network structure of siloxanes bound to the surface of silica NPs could be elucidated using 29Si-29Si homonuclear correlation NMR experiments. The second class of investigated systems encompasses two forms of aluminas, -alumina and mesoporous alumina. The former is widely used in industry as a catalyst, catalyst support, and adsorbent, whereas the latter is a promising material owing to its highly controlled porosity and its high surface accessibility. Nevertheless, their structures are still under heavy investigation since they do not form single crystals. Due to an improved comprehension of MAS-DNP performance, including optimized sample preparation, the obstacle of extremely low efficiency for surface-selective 27Al NMR experiments is circumvented. Sophisticated two-dimensional NMR experiments are employed to provide selective insights into structures on the surface and a new experiment is proposed to study only the bulk of these materials. For achieving further information on the spatial proximities between different 27Al sites, a thorough understanding of homonuclear dipolar recoupling pulse sequences for half-integer quadrupolar nuclei is required. In order to do this, Average Hamiltonian theory and numerical simulations are used to analyze the spin dynamics resulting from these pulse sequences, giving insights into their relative performances. Overall, it is shown that the use of MAS-DNP can be crucial for the characterization of state-of-the-art materials, highlighting the future importance of this technique.

Este trabalho consiste na análise de um método de reconstrução/tomografia de estado quântico em ressonância magnética nuclear utilizando pulsos de radiofreqüência não-seletivos, que possuem a propriedade de promover rotações globais do sistema de spins 7/2. Tal método foi aplicado para reconstruir estados relacionados à computação quântica. As operações lógicas e os estados iniciais envolvidos nas operações quânticas foram construídos através de pulsos modulados optimizados numericamente; o processo de optimização, em particular, não foi tratado nesse trabalho. Foram elaborados programas que simulam: a construção dos estados e portas lógicas utilizando os parâmetros dos pulsos modulados; a aplicação dos pulsos de tomografia e a geração dos dados necessários à reconstrução (amplitudes espectrais); construção de estados utilizando pulsos simples para testes das circunstâncias experimentais; o efeitos de possíveis problemas relacionados à amostra ou ao equipamento. Finalmente, foi elaborado um programa para reconstrução do estado a partir da leitura das amplitudes espectrais, que podem ser obtidas a partir dos programas relacionados no segundo item, ou experimentalmente. As implementações experimentais foram realizadas medindo sinais de RMN de núcleos de 133Cs, localizados em um cristal líquido, que, por possuírem spin 7/2, devido às interações Zeeman e quadrupolar elétrica, apresentam sete linhas espectrais distintas para transições entre níveis energéticos adjacentes; logo, é possível tratar esses núcleos como sistemas de 3 q-bits. Foram construídos estados pseudo-puros e aplicada uma das portas Toffoli. Além disso, uma discussão do algoritmo quântico de busca de Grover no contexto da Ressonância Magnética Nuclear é apresentada para uma futura implementação. / This work describes a quantum state tomography method in nuclear magnetic resonance using nonselective radiofrequency pulses that cause global rotations of spin 7/2 systems. This method was applied to tomograph states related to quantum computation. Numerically optimized modulated pulses allowed building the initial states and the logical operations involved in the quantum operations; particularly, the optimization process was not treated in this work. Several programs were constructed that simulate: o the construction of the quantum states and the logical operations by means of the modulated pulses parameters; o the application of the tomography pulses and the generation of the necessary data for tomography (spectral amplitudes); o the construction of the states using simple pulses for experimental condition tests; o the effects of possible problems related to the samples or equipments. Finally, a quantum state tomography program was elaborated to read the spectral amplitudes, which can be obtained from the programs related to the second item, or experimentally. The experimental implementations were performed measuring the NMR signals from spin 7/2 133Cs nuclei located in a liquid crystal under Zeeman and quadrupolar electric interactions. The NMR spectrum of these nuclei, under these interactions and located in an oriented sample, present 7 spectral lines for transitions between adjacent energetic levels; with this, it is possible to treat it like a 3 q-bits system. Pseudo-pure states were constructed and one Toffoli gate was applied. Furthermore, a discussion about the Grover\'s quantum search algorithm in the nuclear magnetic resonance context was presented for future implementation.

Nesta tese, a ressonância magnética nuclear do estado sólido (SSNMR) foi utilizada para estudar a composição química e estrutura dos componentes da parede celular de plantas. Visando contribuir no desenvolvimento de estratégias de despolimerização da biomassa, SSNMR foi inicialmente utilizada para estudar efeitos dos pré-tratamentos químicos e físicos, e da ação de enzimas sobre algumas biomassas. Os resultados mostraram que, em baixas concentrações, tratamentos ácidos são altamente efetivos na remoção das frações de hemicelulose, com pouco efeito nas frações de lignina e celulose. Já tratamentos alcalinos promovem eficiente deslignificação da biomassa, sendo que a mínima concentração da solução alcalina necessária para obter a máxima deslignificação depende do tipo de biomassa e da temperatura do tratamento. Os estudos por SSNMR foram correlacionados com estudos por outras técnicas, contribuindo para um entendimento mais profundo sobre o efeito dos pré-tratamentos e da hidrolise enzimática em diferentes biomassas. Outra parte da tese aborda a determinação da cristalinidade de celulose nativa (não extraída) de biomassa de bagaço de cana-de-açúcar. Utilizando a técnica de polarização cruzada em múltiplas etapas (Multi-CP) e um procedimento de subtração espectral, foi possível isolar os sinais de RMN da celulose nativa e a partir daí avaliar o índice de cristalinidade (CI). Esse método foi utilizado para avaliar o CI da celulose nativa de bagaço de cana-de-açúcar submetido à pré-tratamentos com H2SO4 e NaOH e os resultados não mostraram variações significativas do CI da celulose nas concentrações utilizadas, apesar do aumento da eficiência da hidrólise. Assim, ao contrário de muitos trabalhos encontrados na literatura, não parece que a cristalinidade da celulose seja um fator primordial no aumento de eficiência da hidrólise enzimática. Na parte final da tese, as interações intermoleculares entre os dois principais polissacarídeos da biomassa: celulose e xilano foram investigadas utilizando uma variedade de técnicas avançadas de RMN bidimensional. Neste trabalho, a arquitetura molecular de hastes de plantas de Arabidopsis Thaliana, sem nunca serem seca foi estudada. Utilizando a técnica refocused J-INADEQUATE (Increadible Natural Abundance Double Quantum Transfer Experiment via J coupling) observamos dois conjuntos de deslocamentos químicos distintos para o xilano, sendo um deles coincidente com aquele observado em solução. Em seguida, utilizamos experimentos SSNMR com o intuito de investigar se algum desses domínios de xilano estaria vinculado com a celulose. Experimentos CP-PDSD (Proton Driven Spin Diffusion detected via 13C through Cross-Polarization) demonstram a existência de proximidade espacial entre o novo domínio do xilano e o domínio da celulose. A comparação de resultados entre as amostras de padrão e o seu mutante deficiente em celulose (irx3) indicaram que o xilano com novo deslocamento químico é fortemente dependente da presença de celulose. A análise da mobilidade molecular pela técnica Dipolar Chemical Shift Correlation (DIPSHIFT), mostrou que as moléculas do novo domínio do xilano são altamente rígidas - uma característica partilhada com a celulose. Combinados, esses dados fornecem evidências de uma arquitetura molecular específica entre os dois polissacarídeos majoritários da parede celular. / Solid-state nuclear magnetic resonance (SSNMR) was used to study the chemical composition and structure of plant cell wall components. Aiming the development of depolymerization strategies, SSNMR was initially used to study the effects of chemical and physical pre-treatments, as well as the enzymatic action on the structure and composition of biomasses. The results showed that, at low concentrations, pre-treatments with acids are highly effective for removal of hemicellulose without significant effect on lignin and cellulose. In turn, the alkaline pre-treatment promotes efficient delignification of the biomass. The minimum concentration of the alkaline solution required to achieve the maximum delignification depends on the type of biomass and treatment temperature. SSNMR studies were correlated with studies using other techniques, contributing to an in-depth understanding of the effect of pre-treatments and enzymatic hydrolysis in different biomasses. Another part of the thesis discusses is the determination of native cellulose crystallinity (not extracted) of sugarcane bagasse biomasses. Using the cross-polarization technique in multiple blocks (Multi-CP) and a spectral subtraction approach, it was possible to isolate the NMR signals of the native cellulose and to evaluate the crystallinity index (CI). This method was used to accessof the CI of cellulose in sugarcane bagasse samples pre-treated with H2SO4 and NaOH. The results did not show significant variations of the cellulose CI, at the concentration used here, despite the increase in the hydrolysis efficiency. Thus, in contrast to some studies in the literature, it does not appear that the crystallinity of cellulose is a primary limiting factor concerning the enzymatic hydrolysis efficiency in biomasses. In the final part of this thesis, the intermolecular interactions between the two main polysaccharides of the plant cell wall, cellulose and xylan, were investigated using advanced two-dimensional NMR techniques. The molecular architecture of 13C labelled never-dried Arabidopsis Thaliana stems was studied. Using refocused J-INADEQUATE (Increadible Natural Abundance Double Quantum Transfer Experiment via J coupling) we observed two distinct chemical shifts in xylan, one of which coincides with that observed in solution. Next, we used SSNMR experiments toinvestigate the interaction between the novel xylan and cellulose domains. CP-PDSD (Proton Driven Spin Diffusion detected via 13C through Cross-Polarization) experiments demonstrated spatial proximity between the new xylan and cellulose domains. The same approach was used to study cellulose deficient (irx3) mutants and the comparison between the results indicate that the new xylan domain is cellulose-dependent. Dipolar Chemical Shift Correlation (DIPSHIFT) experiments were performed to analyse the molecular mobility of these polysaccharides showing that the novel xylan is highly rigid - a characteristic which is shared with cellulose. Combined, these data provide evidence for a specific molecular architecture between the two most common polysaccharides in plant cell walls.