Ce travail a pour objectif de mettre au point un procédé d’oligomérisation de rutine et d’esculine par la laccase de Trametes versicolor. Un procédé de synthèse en parallèle et d’analyse en ligne par SEC-UV et par MALDI-TOF a été mis au point. L’analyse par MALDI-TOF a révélé la formation d’un simple pontage, allant jusqu’au degré d’oligomérisation 6 pour la rutine et 9 pour l’esculine. Un pontage par liaison éther a été observé par FTIR dans le cas des oligorutines. L’analyse par RMN a démontré la mise en place de liaisons tant C-C que C-O localisées sur la partie phénolique et la partie sucre des monomères. De faibles pH et températures favorisent l’allongement de la chaîne, alors que l’augmentation de la constante diélectrique du solvant ou de la température augmente la production des oligomères de rutine. La limitation de la masse de ces oligomères serait due à une inhibition de l’enzyme, provoquée par les capacités chélatantes des oligomères. Une diminution du pouvoir antioxydant et une augmentation du pouvoir inhibiteur de la xanthine oxydase ont pu être observées lors de l’accroissement de la masse des oligomères de rutine. Ces deux activités sont améliorées lors de l’accroissement de la masse des oligomères d’esculine. Pour ces deux types d’oligomères, la solubilité dans l’eau est fortement accrue. Dans le cas des oligorutines, cette forte augmentation a été corrélée à la mise en place d’un réseau dense de liaisons hydrogène observé par modélisation moléculaire. Globalement, l’approche par modélisation moléculaire dans le vide et dans le solvant a permis de dégager des relations structure-activité, reliant notamment le nombre de liaisons hydrogène à la solubilité / The aim of this work is the elaboration of rutin and esculin oligomerization process by the laccase from Trametes versicolor. A parallel synthesis process and on-line analysis of reaction media by SEC-UV and MALDI-TOF have been elaborated. The MALDI-TOF analysis has revealed the formation of simple bridges between rutin and esculin units, up to degree of oligomerization of 6 and 9 respectively. An ether bond has been observed by FTIR spectrometry for the rutin oligomers. Finally, the NMR analysis has revealed the formation of C-C and C-O bridges both on phenolic and the sugar parts of the flavonoids. At low pH and temperature, the elongation of the chain is favored, whereas increasing the dielectric constant of the solvent or the temperature favors the production of rutin oligomers. The limitation of oligomers mass is explained by the inhibition of the enzyme, probably due to the highest chelation properties of oligomers. In the case of oligorutin, a decrease of antiradical activity and an increase of xanthine oxidase inhibitory activity have been observed when the oligomers molecular mass increases. In the case of esculin oligomers, these two activities increase with the increase of the oligomers mass. For these two types of oligomers, the water solubility is considerably increased. For the oligorutins, this augmentation has been correlated to a dense network of H-bonds, which has been demonstrated by molecular modeling. Globally, the molecular modeling approach in vacuum and in solvent has allowed to establish structure-activity relationship

No description available.

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<p>      </p> <p>Full exploitation of shale resources requires new catalytic techniques to efficiently convert the methane, ethane, and propane found in shale gas to value-added fuels and chemicals. A promising process of converting ethane and propane involves catalytic light alkane dehydrogenation and the subsequent oligomerization of light alkenes. The first part of this work focuses on the examination of the mechanistic details of propane dehydrogenation on Pt-based alloy catalysts, where first principles-based free energy, microkinetic, and degrees of rate control analyses are performed to understand and rationalize the selective propane dehydrogenation using a Pt3Mn alloy. We show that only the under-coordinated, Mn-decorated Pt sites, represented by a Pt3Mn(211) surface, are selective to propylene formation, which can be attributed to several key mechanistic details: (1) facile propylene desorption and (2) hindered pathways that are inherently non-selective to propylene and lead to the formation of isomers. These kinetic details can, in turn, be interpreted using the free energy landscapes of propane dehydrogenation on the Pt3Mn(211) surface, which features a reasonably stronger binding of propylene than those of its isomers. From this study, we extract two selectivity descriptors for propane dehydrogenation: The energetics of propylene desorption versus deep-dehydrogenation, as well as the energetics of the formation of propylene versus its isomers. The properties can be used for designing further improved light alkane dehydrogenation catalysts.</p>

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation. / G protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors involved in signal transduction. Traditionally, signal transduction by GPCRs involves the activation of a hetero-trimeric G protein which will then modulate the activity of several intracellular effectors. We can now appreciate the fact that in addition to their interaction with G proteins, GPCRs also associate with several other proteins, in order to allow proper signal transduction. In particular, the discovery of a family of proteins called receptor activity-modifying proteins (RAMPs) has challenged the traditional views of signal transduction by some GPCRs. In the case of the calcitonin-like receptor (CLR), the association with RAMPs allows the proper cell surface targeting of the receptor in addition to modulate it’s pharmacological properties. Co-expression of CLR with RAMP1 leads to a calcitonin gene-related peptide (CGRP) receptor, whereas CLR association with RAMP2 or RAMP3 promotes the formation of an adrenomedullin receptor. In addition to their interaction with transmembrane accessory proteins such as RAMPs, GPCRs can also interact with other receptors to form receptors oligomers. In this thesis, we were interested in the interactions between GPCRs and RAMPs, and particularly, in the link between these GPCR/RAMP interactions and the assembly of receptor oligomers, using CGRP1 receptor as a model. We first confirmed the interaction between CLR and RAMP1 in living cells. We showed that this CLR/RAMP1 complex activates G proteins and recruits the signalling protein -arrestin upon CGRP stimulation. Next, we demonstrated that even if the CLR requires hetero-oligomeric assembly with RAMPs in order to be active, this receptor can still interact with other GPCRs. In addition to CLR homo-oligomers, we observed that RAMPs can also self-associate to form oligomeric complexes which can involve different subtypes (RAMP1/RAMP2 and RAMP1/RAMP3). This observation of the presence of CLR and RAMP1 homo-oligomers raised the question of the stoiechiometry of interaction of the CLR/RAMP1 complex. In order to establish the molecular composition of the CGRP1 receptor in vivo, we developed a novel approach allowing the detection of the interaction between three proteins in living cells. This method called BRET/BiFC is based on the bioluminescence resonance energy transfer between a luminescent energy donor, Renilla luciferase, and a fluorescent energy acceptor, the yellow fluorescent protein (YFP), reconstituted after the re-association of its two fragments. Using this approach, we showed that the CGRP1 receptor consist of a homo-oligomer of CLR interacting with a monomer of RAMP1. By demonstrating the asymmetrical organization of the CGRP1 receptor complex using a novel biophysical approach, we believe that the results presented herein have contributed to increase our knowledge of the mechanisms of function of the large family of GPCRs and will be useful for the pursuit of research on protein complexes involved in signalling pathways.

Les plantes doivent assurer la protection de trois génomes localisés dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mécanismes assurant la réparation de l’ADN nucléaire sont relativement bien compris, il n’en va pas de même pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mécanismes puisque des dommages à l’ADN non ou mal réparés peuvent entraîner des réarrangements dans les génomes. Chez les plantes, de tels réarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire à une perte de vigueur ou à un ralentissement de la croissance. Récemment, notre laboratoire a identifié une famille de protéines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protéines forment des tétramères qui lient l’ADN monocaténaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associées au métabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protéines ont été associées au maintien de la stabilité du génome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protéines sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Notre étude chez Arabidopsis démontre que des cassures bicaténaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dépendant de très courtes séquences répétées (de cinq à cinquante paires de bases) d’ADN. Nous avons également montré que les protéines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus précisément, leur rôle serait de promouvoir une réparation fidèle de l’ADN en empêchant la formation de réarrangements dans les génomes de ces organites. Pour comprendre comment les protéines Whirly sont impliquées dans ce processus, nous avons élucidé la structure cristalline d’un complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protègent l’ADN monocaténaire sans spécificité de séquence. La liaison de l’ADN s’effectue entre les feuillets β de sous-unités contiguës du tétramère. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocaténaire et empêche son appariement avec des acides nucléiques de séquence complémentaire. Ainsi, les protéines Whirly peuvent empêcher la formation de réarrangements et favoriser une réparation fidèle de l’ADN. Nous avons également montré que, lors de la liaison de très longues séquences d’ADN, les protéines Whirly peuvent s’agencer en superstructures d’hexamères de tétramères, formant ainsi des particules sphériques de douze nanomètres de diamètre. En particulier, nous avons pu démontrer l’importance d’un résidu lysine conservé chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilité de ces superstructures, dans la liaison coopérative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre étude amène de nouvelles connaissances quant aux mécanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rôle des protéines Whirly dans ce processus. / Plants must protect the integrity of three genomes located respectively in the nucleus, the chloroplasts and the mitochondria. Although DNA repair mechanisms in the nucleus are the subject of multiple studies, little attention has been paid to DNA repair mechanisms in chloroplasts and mitochondria. This is unfortunate since mutations in the chloroplast or the mitochondrial genome can lead to altered plant growth and development. Our laboratory has identified a new family of proteins, the Whirlies, whose members are located in plant mitochondria and chloroplasts. These proteins form tetramers that bind single-stranded DNA and play various roles associated with DNA metabolism. In Arabidopsis, two Whirly proteins maintain chloroplast genome stability. Whether or not these proteins are involved in DNA repair has so far not been investigated. Our studies in Arabidopsis demonstrate that DNA double-strand breaks are repaired in both mitochondria and chloroplasts through a microhomology-mediated repair pathway and indicate that Whirly proteins affect this pathway. In particular, the role of Whirly proteins would be to promote accurate repair of organelle DNA by preventing the repair of DNA double-strand breaks by the microhomology-dependant pathway. To understand how Whirly proteins mediate this function, we solved the crystal structure of Whirly-DNA complexes. These structures show that Whirly proteins bind single-stranded DNA with low sequence specificity. The DNA is maintained in an extended conformation between the β-sheets of adjacent protomers, thus preventing spurious annealing with a complementary strand. In turn, this prevents formation of DNA rearrangements and favors accurate DNA repair. We also show that upon binding long ssDNA sequences, Whirly proteins assemble into higher order structures, or hexamers of tetramers, thus forming spherical particles of twelve nanometers in diameter. We also demonstrate that a lysine residue conserved among plant Whirly proteins is important for the stability of these higher order structures as well as for cooperative binding to DNA and for DNA repair. Overall, our study elucidates some of the mechanisms of DNA repair in plant organelles as well as the roles of Whirly proteins in this process.

No description available.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation. / G protein coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptors involved in signal transduction. Traditionally, signal transduction by GPCRs involves the activation of a hetero-trimeric G protein which will then modulate the activity of several intracellular effectors. We can now appreciate the fact that in addition to their interaction with G proteins, GPCRs also associate with several other proteins, in order to allow proper signal transduction. In particular, the discovery of a family of proteins called receptor activity-modifying proteins (RAMPs) has challenged the traditional views of signal transduction by some GPCRs. In the case of the calcitonin-like receptor (CLR), the association with RAMPs allows the proper cell surface targeting of the receptor in addition to modulate it’s pharmacological properties. Co-expression of CLR with RAMP1 leads to a calcitonin gene-related peptide (CGRP) receptor, whereas CLR association with RAMP2 or RAMP3 promotes the formation of an adrenomedullin receptor. In addition to their interaction with transmembrane accessory proteins such as RAMPs, GPCRs can also interact with other receptors to form receptors oligomers. In this thesis, we were interested in the interactions between GPCRs and RAMPs, and particularly, in the link between these GPCR/RAMP interactions and the assembly of receptor oligomers, using CGRP1 receptor as a model. We first confirmed the interaction between CLR and RAMP1 in living cells. We showed that this CLR/RAMP1 complex activates G proteins and recruits the signalling protein -arrestin upon CGRP stimulation. Next, we demonstrated that even if the CLR requires hetero-oligomeric assembly with RAMPs in order to be active, this receptor can still interact with other GPCRs. In addition to CLR homo-oligomers, we observed that RAMPs can also self-associate to form oligomeric complexes which can involve different subtypes (RAMP1/RAMP2 and RAMP1/RAMP3). This observation of the presence of CLR and RAMP1 homo-oligomers raised the question of the stoiechiometry of interaction of the CLR/RAMP1 complex. In order to establish the molecular composition of the CGRP1 receptor in vivo, we developed a novel approach allowing the detection of the interaction between three proteins in living cells. This method called BRET/BiFC is based on the bioluminescence resonance energy transfer between a luminescent energy donor, Renilla luciferase, and a fluorescent energy acceptor, the yellow fluorescent protein (YFP), reconstituted after the re-association of its two fragments. Using this approach, we showed that the CGRP1 receptor consist of a homo-oligomer of CLR interacting with a monomer of RAMP1. By demonstrating the asymmetrical organization of the CGRP1 receptor complex using a novel biophysical approach, we believe that the results presented herein have contributed to increase our knowledge of the mechanisms of function of the large family of GPCRs and will be useful for the pursuit of research on protein complexes involved in signalling pathways.

Les plantes doivent assurer la protection de trois génomes localisés dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mécanismes assurant la réparation de l’ADN nucléaire sont relativement bien compris, il n’en va pas de même pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mécanismes puisque des dommages à l’ADN non ou mal réparés peuvent entraîner des réarrangements dans les génomes. Chez les plantes, de tels réarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire à une perte de vigueur ou à un ralentissement de la croissance. Récemment, notre laboratoire a identifié une famille de protéines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protéines forment des tétramères qui lient l’ADN monocaténaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associées au métabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protéines ont été associées au maintien de la stabilité du génome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protéines sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Notre étude chez Arabidopsis démontre que des cassures bicaténaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dépendant de très courtes séquences répétées (de cinq à cinquante paires de bases) d’ADN. Nous avons également montré que les protéines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus précisément, leur rôle serait de promouvoir une réparation fidèle de l’ADN en empêchant la formation de réarrangements dans les génomes de ces organites. Pour comprendre comment les protéines Whirly sont impliquées dans ce processus, nous avons élucidé la structure cristalline d’un complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protègent l’ADN monocaténaire sans spécificité de séquence. La liaison de l’ADN s’effectue entre les feuillets β de sous-unités contiguës du tétramère. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocaténaire et empêche son appariement avec des acides nucléiques de séquence complémentaire. Ainsi, les protéines Whirly peuvent empêcher la formation de réarrangements et favoriser une réparation fidèle de l’ADN. Nous avons également montré que, lors de la liaison de très longues séquences d’ADN, les protéines Whirly peuvent s’agencer en superstructures d’hexamères de tétramères, formant ainsi des particules sphériques de douze nanomètres de diamètre. En particulier, nous avons pu démontrer l’importance d’un résidu lysine conservé chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilité de ces superstructures, dans la liaison coopérative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre étude amène de nouvelles connaissances quant aux mécanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rôle des protéines Whirly dans ce processus. / Plants must protect the integrity of three genomes located respectively in the nucleus, the chloroplasts and the mitochondria. Although DNA repair mechanisms in the nucleus are the subject of multiple studies, little attention has been paid to DNA repair mechanisms in chloroplasts and mitochondria. This is unfortunate since mutations in the chloroplast or the mitochondrial genome can lead to altered plant growth and development. Our laboratory has identified a new family of proteins, the Whirlies, whose members are located in plant mitochondria and chloroplasts. These proteins form tetramers that bind single-stranded DNA and play various roles associated with DNA metabolism. In Arabidopsis, two Whirly proteins maintain chloroplast genome stability. Whether or not these proteins are involved in DNA repair has so far not been investigated. Our studies in Arabidopsis demonstrate that DNA double-strand breaks are repaired in both mitochondria and chloroplasts through a microhomology-mediated repair pathway and indicate that Whirly proteins affect this pathway. In particular, the role of Whirly proteins would be to promote accurate repair of organelle DNA by preventing the repair of DNA double-strand breaks by the microhomology-dependant pathway. To understand how Whirly proteins mediate this function, we solved the crystal structure of Whirly-DNA complexes. These structures show that Whirly proteins bind single-stranded DNA with low sequence specificity. The DNA is maintained in an extended conformation between the β-sheets of adjacent protomers, thus preventing spurious annealing with a complementary strand. In turn, this prevents formation of DNA rearrangements and favors accurate DNA repair. We also show that upon binding long ssDNA sequences, Whirly proteins assemble into higher order structures, or hexamers of tetramers, thus forming spherical particles of twelve nanometers in diameter. We also demonstrate that a lysine residue conserved among plant Whirly proteins is important for the stability of these higher order structures as well as for cooperative binding to DNA and for DNA repair. Overall, our study elucidates some of the mechanisms of DNA repair in plant organelles as well as the roles of Whirly proteins in this process.

A unique mechanism of protein oligomerization is domain swapping. It is a feature found in some proteins wherein a dimer or a higher oligomer is formed by the exchange of identical structural segments between protomers. Domain swapping is thought to have played a key role in the evolution of stable oligomeric proteins and in oligomerization of amyloid proteins. This thesis deals with studies to understand the significance of hinges involved in domain swapping for protein oligomerization and function. The stationary phase survival protein SurE from Salmonella typhimurium (StSurE) and Sesbania mosaic virus (SeMV) coat protein have been used as models for studies on domain swapping. This thesis has been divided into eight chapters. Chapter 1 provides a brief introduction to domain swapping, while Chapters 2 to 6 describes the studies carried out on StSurE protein, Chapter 7 deals with studies on SeMV coat protein. The final Chapter 8 provides brief descriptions of various experimental techniques employed during these investigations. Chapter 1 deals with a brief introduction to domain swapping in proteins. Examples where different domains are exchanged are cited. Then it describes physiological relevance of domain swapping in proteins and probable factors which promote swapping. Finally it also discusses the uncertainties that are inevitable in protein structure prediction and design. Chapter 2 describes the structure of Salmonella typhimurium SurE (StSurE; Pappachan et al., 2008) determined at a higher resolution. The chapter also deals with the sequence and structure based comparison of StSurE with other known SurE homolog structures. A comparative analysis of the relative conservation of N- and C-terminal halves of SurE protomer and variations observed in the quaternary structures of SurE homologs are presented. Then a brief introduction is provided on function of StSurE. The conserved active site of StSurE that might be important for its phosphatase activity is described. A plausible mechanism for the phosphatase activity as proposed by Pappachan et al. (2008) is presented. Crystal structures of StSurE bound with AMP, pNPP and pNP that was determined with the view of better understanding the mechanism of enzyme function is presented. These structures provide structural evidence for the mechanism proposed by Pappachan et al. (2008). Finally a substrate entry channel inferred from these structures is discussed. SurE from Salmonella typhimurium (StSurE) was selected for studies on domain swapping as there is at least one homologous structure (Pyrobaculum aerophilum - PaSurE) in which swapping of the C-terminal helices appears to have been avoided without leading to the loss of oligomeric structure or function. It was of interest to examine if an unswapped dimer of StSurE resembling PaSurE dimer could be constructed by mutagenesis. To achieve this objective, a crucial hydrogen bond in the hinge involved in C-terminal helix swapping was abolished by mutagenesis. These mutants were constructed with the intention of increasing the flexibility of the hinge which might bring the C-terminal helices closer to the respective protomer as in PaSurE. Chapter 3 presents a comparative analysis of the hinges involved in C-terminal helix swapping in PaSurE and StSurE. Based on the comparison of structure and sequence, crucial residues important for C-terminal helix swapping in StSurE were identified as D230 and H234. The chapter describes the construction of mutants obtained by substituting D230 and H234 by alanine and their biophysical characterization. Finally it describes structural studies carried out on these mutants. The mutation H234A and D230A/H234A resulted in highly distorted dimers, although helix swapping was not avoided. Comparative analysis of the X-ray crystal structures of native StSurE and mutants H234A and D230A/H234A reveal large structural changes in the mutants relative to the native structure. However the crystal structures do not provide information on the changes in dynamics of the protein resulting from these mutations. To gain better insights into the dynamics involved in the native and mutants H234A and D230A/H234A, MD simulations were carried on using GROMACS 4.0.7. Chapter 4 deals with a brief description of the theory of molecular dynamics, followed by results of simulation studies carried out on monomeric and dimeric forms of StSurE and dimeric forms of its mutants H234A and D230A/H234A. The conformational changes and dynamics of different swapped segments are discussed. Crystal structures of H234A and D230A/H234A mutants reveal that they form highly distorted dimers with altered dimeric interfaces. Chapter 5 focuses on comparison of dimeric interfaces of the native StSurE and hinge mutants H234A and D230A/H234A. Based on the analysis, three sets of interactions were selected to investigate the importance of the interface formed by swapped segments in StSurE mutants H234A and D230A/H234A. One of the selected sites corresponds to a novel interaction involving tetramerization loop in the hinge mutants H234A and D230A/H234A resulting in a salt bridge between E112 – R179’ and E112’ – H180 (prime denotes residue from the other chain of the dimeric protein). This salt bridge seems to stabilize the distorted dimer. It is shown by structural studies that the loss of this salt bridge due to targeted mutation restores symmetry and dimeric organization of the mutants. Loss of a crucial hydrogen bond in the hinge region involved in C-terminal helix swapping in SurE not only leads to large structural changes but also alters the conformation of a loop near the active site. It is of interest to understand functional consequences of these structural changes. StSurE is a phosphatase, and its activity could be conveniently monitored using the synthetic substrate para nitrophenyl phosphate (pNPP) at pH 7 and 25 ºC. Chapter 6 deals with the functional studies carried out with various StSurE mutants. The studies suggest that there is a drastic loss in phosphatase activity in hinge mutants D230A, H234A and D230A/H234A, while in the salt bridge mutants the function seems to have been restored. Few of these mutants also exhibit positive cooperativity, which could probably be due to altered dynamics of domains. Sesbania mosaic virus (SeMV) is a plant virus, belonging to genus sobemovirus. SeMV is a T=3 icosahedral virus (532 symmetry) made up of 180 coat protein (CP) subunits enclosing a positive-sense RNA genome. The asymmetric unit of the icosahedral capsid is composed of chemically identical A, B and C subunits occupying quasi-equivalent environments. Residues 48 – 59 of the N-terminal arms of the C subunits interact at the nearby icosahedral three-fold axes through a network of hydrogen bonds to form a structure called the “β-annulus”. Residues 60 – 73 form the “βA-arm” that connects the N-terminal β-annulus to the rest of the protomer. Various studies on SeMV-CP suggest that different lengths of the N-terminal segments affect the assembly of virus. It might be possible to exploit this flexibility of the N-terminus in SeMV-CP to introduce swapping of this segment between two 2-fold related C subunits as is found in Rice yellow mottle virus (RYMV), another sobemovirus, with which SeMV shares significant sequence similarity. Chapter 7 focuses on attempts made to examine the mutational effects planned to introduce domain swapping. The strategy used for introducing swapping in SeMV-CP was based on the sequence of the βA-arm or the hinge involved in swapping of β-annulus in RYMV. TEM images of the mutant virus like particles obtained suggest that they are heterogeneous. These mutants could not be crystallized, probably due to the heterogeneity. However, the assembly of the expressed proteins to virus like particles was profoundly influenced by the mutations. Chapter 8 discusses various crystallographic, biophysical and biochemical techniques used during these investigations. Finally the thesis concludes with Conclusions and Future perspectives of the various studies reported in the thesis. In summary, I have addressed the importance of amino acid residues and interactions of hinges involved in domain swapping for the quaternary structure and function of proteins.