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Identificação de um gene de Leishmania major relacionado à resistência a ciclosporina A / -Marco, Rogério Milton De 20 August 2004 (has links)
A Ciclosporina A (CsA) faz parte de um grupo de oligopeptidios cíclicos e hidrofóbicos, produzida naturalmente por fungos. Este composto além de ser um potente imunossupressor pode também apresentar uma série de outros efeitos fisiológicos como atividade antiinflamatória e antialérgica, ou mesmo efeitos anti fúngicos e antiparasitários. Partimos de uma genoteca genômica de L. (L.) major cepa Friedlin A1 (LmFA1) construída no cosmídio cLHYG, que teve o seu DNA transfectado em promastigotas para em seguida as células serem submetidas aos experimentos de superexpressão gênica em presença de concentrações crescentes de CsA. Foram selecionados dois loci capazes de conferir resistência a CsA. Um desses loci (contendo cerca de 30 - 40 kb) foi mapeado e caracterizado após análises do perfil de digestão com diferentes enzimas de restrição, e da transfecção de algumas deleções em células LmFA1, que após amplificação gênica, foram submetidas a testes funcionais em presença de CsA. Apesar de valores baixos dos índices de resistência obtidos com os testes funcionais, foi possível identificar nesse locus um gene que após seqüenciamento parcial de nucleotídeos e análises comparativas no banco genômico de leishmânia, revelou a presença de uma fase aberta de leitura contendo 1 844 aminoácidos que codifica para uma proteína de membrana pertencente a família das transportadoras ABC e que parece estar relacionada com a resistência a CsA. Essa proteína, denominada LmABC-CR1, possui alta identidade com uma transportadora ABC de L. (L.) tropica (95,5%), e baixa identidade (27,2%) com uma outra transportadora ABC de LmFA1 isolada por nosso grupo e relacionada com a resistência a Pentamidiana (PRP1). A análise molecular dos DNAs das espécies, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis, L. (L.), chagasi e L. (L.) major demonstrou um relativo polimorfismo do gene LmABC-CR1 nestas espécies. O papel dessa nova proteína na resistência a CsA frente a diferentes espécies de leishmânia deverá ser melhor estudado / Cyclosporin A (CsA) is a cyclic hydrophobic oligopeptide naturally produced by fungus. Besides this drug is usually known as a potent immunosupressor, it also presents a couple of other physiologic activities as anti-inflammatory, anti-allergic, or even acting as fungicidal and anti-parasitic. Starting from an L. (L.) major Friedlin A1 (LmFA1) genomic library constructed into the cLHYG shuttle vector, DNA was transfected on promastigotes, and cells submitted to over expression in the presence of increasing concentrations of CsA. Two loci were selected capable to render cells CsA resistance after transfection.One of those loci (containing about 30 - 40 kb) was mapped after analyses of the restriction enzymes pattern, and characterized by transfection of its deletions in LmFA1 cells, which after gene amplification, were submitted to functional tests in the presence of CsA. In spite of low of resistance indexes values after functional tests, it was possible to identify a gene that after partial nucleotides sequencing and comparison with leishmania genomic bank data indicated the presence of an open reading containing 1 844 amino acids codifying a membrane protein from the ABC transporter family that seems to be related with CsA resistance (LmABC-CR1). LmABC-CR1 presents high identity (95,5%) with a L. (L.) tropica ABC transporter protein, and low identity (27,2%) with another LmFA1 ABC transporter (PRP1) isolated by us, and related with Pentamidine resistance. Southern blot analysis with L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis, L. (L.), chagasi and L. (L.) major genomic DNA shown a relative polymorphism of LmABC-CR1 gene in this species. The role of this new protein on the CsA resistance in leishmania species should be further studied
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Identificação de um gene de Leishmania major relacionado à resistência a ciclosporina A / -Rogério Milton De Marco 20 August 2004 (has links)
A Ciclosporina A (CsA) faz parte de um grupo de oligopeptidios cíclicos e hidrofóbicos, produzida naturalmente por fungos. Este composto além de ser um potente imunossupressor pode também apresentar uma série de outros efeitos fisiológicos como atividade antiinflamatória e antialérgica, ou mesmo efeitos anti fúngicos e antiparasitários. Partimos de uma genoteca genômica de L. (L.) major cepa Friedlin A1 (LmFA1) construída no cosmídio cLHYG, que teve o seu DNA transfectado em promastigotas para em seguida as células serem submetidas aos experimentos de superexpressão gênica em presença de concentrações crescentes de CsA. Foram selecionados dois loci capazes de conferir resistência a CsA. Um desses loci (contendo cerca de 30 - 40 kb) foi mapeado e caracterizado após análises do perfil de digestão com diferentes enzimas de restrição, e da transfecção de algumas deleções em células LmFA1, que após amplificação gênica, foram submetidas a testes funcionais em presença de CsA. Apesar de valores baixos dos índices de resistência obtidos com os testes funcionais, foi possível identificar nesse locus um gene que após seqüenciamento parcial de nucleotídeos e análises comparativas no banco genômico de leishmânia, revelou a presença de uma fase aberta de leitura contendo 1 844 aminoácidos que codifica para uma proteína de membrana pertencente a família das transportadoras ABC e que parece estar relacionada com a resistência a CsA. Essa proteína, denominada LmABC-CR1, possui alta identidade com uma transportadora ABC de L. (L.) tropica (95,5%), e baixa identidade (27,2%) com uma outra transportadora ABC de LmFA1 isolada por nosso grupo e relacionada com a resistência a Pentamidiana (PRP1). A análise molecular dos DNAs das espécies, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis, L. (L.), chagasi e L. (L.) major demonstrou um relativo polimorfismo do gene LmABC-CR1 nestas espécies. O papel dessa nova proteína na resistência a CsA frente a diferentes espécies de leishmânia deverá ser melhor estudado / Cyclosporin A (CsA) is a cyclic hydrophobic oligopeptide naturally produced by fungus. Besides this drug is usually known as a potent immunosupressor, it also presents a couple of other physiologic activities as anti-inflammatory, anti-allergic, or even acting as fungicidal and anti-parasitic. Starting from an L. (L.) major Friedlin A1 (LmFA1) genomic library constructed into the cLHYG shuttle vector, DNA was transfected on promastigotes, and cells submitted to over expression in the presence of increasing concentrations of CsA. Two loci were selected capable to render cells CsA resistance after transfection.One of those loci (containing about 30 - 40 kb) was mapped after analyses of the restriction enzymes pattern, and characterized by transfection of its deletions in LmFA1 cells, which after gene amplification, were submitted to functional tests in the presence of CsA. In spite of low of resistance indexes values after functional tests, it was possible to identify a gene that after partial nucleotides sequencing and comparison with leishmania genomic bank data indicated the presence of an open reading containing 1 844 amino acids codifying a membrane protein from the ABC transporter family that seems to be related with CsA resistance (LmABC-CR1). LmABC-CR1 presents high identity (95,5%) with a L. (L.) tropica ABC transporter protein, and low identity (27,2%) with another LmFA1 ABC transporter (PRP1) isolated by us, and related with Pentamidine resistance. Southern blot analysis with L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis, L. (L.), chagasi and L. (L.) major genomic DNA shown a relative polymorphism of LmABC-CR1 gene in this species. The role of this new protein on the CsA resistance in leishmania species should be further studied
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