Oligosaccharides play very crucial biological roles in the human body. They are structurally diverse and very challenging to analyze. In an attempt to contribute towards the analysis of oligosaccharides in the growing filed of 'Glycomics', we explored different ways to make novel efficient oligosaccharide tags to label N -linked oligosaccharides from glycoproteins. We synthesized and characterized various oligosaccharide tags which are useful to analyze the oligosaccharide by mass spectrometry, HPLC, and bioaffinity. In these tags we incorporated ar UV/fluorescent core, a biotin moiety and an amino/azido/alkyne terminus. We varied the structures of the tags for improved solubility in common organic solvents. These tags were used to label standard oligosaccharides, and the labeling efficiency was evaluated.

In the post-genomic era, recognition of the importance of sugars is increasing in biological research. For the precise analysis of their functions, homogeneous materials are required. Chemical synthesis is a powerful tool for preparation of homogeneous oligosaccharides and glycoconjugates. Glycosidases are potent catalysts for this purpose because they realize high stereo- and regio- selectivities under conditions benign to biomolecules without repetitive protection/deprotection procedures. A glycosynthase is an aritificial enzyme which is derived from a glycosidase and is devised for glycosylation reaction. To suppress the mechanistically inherent oligomerization side reaction of this class of biocatalysts, a glycosidase with plastic substrate recognition was engineered to afford the first α-mannosynthase. This novel biocatalyst showed low occurrence of oligomerized products as designed and was applied to prepare a wide range of oligosaccharides. Glycosidases are also valuable tools for glycan engineering of glycoconjugates, which is a pivotal issue in the development of pharmaceutical agents, including immunoglobulin G (IgG)-based drugs. EndoS, an endo-β-N-acetylglucosaminidase from Streptococcus pyogenes, natively cleaves N-glycans on IgG specifically. When the latent glycosylation activity of this enzyme was applied, the N-glycan remodelling of full-length IgG was successfully achieved for the first time and a highly pure glycoform was obtained using the chemically synthesized oxazoline tetrasaccharide as glycosyl donor. This biocatalytic reaction allows development of a novel type of antibody-drug conjugates (ADCs) in which drug molecules are linked to N-glycans site-specifically. For this purpose, glycans with bioorthogonal reaction handles were synthesized and conjugated to IgG. A model reaction using a dye compound as reaction partner worked successfully and the synthetic method for this newly designed ADC was validated. Glycan trimming of glycoproteins expressed from Pichia pastoris was performed using exoglycosidases to derive homogeneous glycoform. Jack Bean α-mannosidase (JBM) trimmed native N-glycans down to the core trisaccharide structure but some of the glycoforms were discovered to be resistant to the JBM activity. Enzymatic analyses using exoglycosidases suggested that the JBM-resistant factor was likely to be β-mannoside. In summary, this work advanced application of modified glycosidases for preparation of oligosaccharides and also demonstrated biocatalytic utility of glycosidases to produce biologically relevant glycoconjugates with homogeneous glycoforms.

La glycosylation des protéines est une modification co/post-traductionnelle, localiséeprincipalement dans l’appareil de golgi, impliquée dans divers processus physiologiques. Àl’inverse de la synthèse des protéines et des nucléotides, celle des sucres est plus complexe,en partie, à cause des nombreux branchements structuraux et de la diversité stéréochimiquedes glycannes. Les glycosyltransférases sont les enzymes responsables de la biosynthèse desoligo- et polysaccharides. Cependant, il existe différents procédés permettant de réaliser lasynthèse in vitro d’oligosaccharides tels que des procédés chimiques, enzymatiques ouchimio-enzymatiques. La Core 2 β(1,6)-N-acétylglucosaminyltransférase I (C2GnT-I) est uneglycosyltransférase (GT) transmembranaire de type II qui crée une liaison β1,6 entre une Nacétylglucosamine(GlcNAc) et la N-acétylgalactosamine (GalNAc) d’un noyau Core 1,formant ainsi une structure branchée de type Core 2. Une fois le branchement Core 2 initié,au moins trois réactions successives de transfert peuvent avoir lieu, impliquant les β(1,4)-galactosyltransférases, les α(2,3)-sialyltransférases et les α(1,3)-fucosyltransférases. Il estadmis que les GTs sont réparties séquentiellement dans les compartiments cis, médian ettrans de l’appareil de Golgi selon leur ordre d’intervention et le type cellulaire. Nous avonsmis au point un procédé de reconstitution membranaire, comportant des glycoprotéinesgolgiennes, dont les GTs, par l’intermédiaire d’une lectine, la wheat germ agglutinin (WGA).Il est admis que la WGA interagit avec les composants de la membrane plasmique et ceux del’appareil de Golgi. L’étude de notre système membranaire reconstitué a mis en évidence uneactivité élevée de la C2GnT-1 in vitro, et son efficacité à synthétiser des oligosaccharidesbranchés Core 2, par glycosylation séquentielle. / Protein glycosylation is a co/posttranslational modification, localized in the Golgi apparatus,involved in various physiological processes. Sugar synthesis is more complex than that ofproteins and nucleic acids, in part because of the glycosidic bond and glycan stereochemistrydiversity. Glycosyltransferases are enzymes responsible of oligo- and polysaccharidesbiosynthesis. Various methods are used for the synthesis of oligosaccharides, in vitro, suchas chemical, enzymatic or chemo-enzymatic. Core 2 β(1,6)-N-acetylglucosaminyltransferase I(C2GnT-I) is a type-II transmembrane glycosyltransferase (GT). This enzyme create a β1,6bond between N-acetylglucosamine (GlcNAc) and Core 1 N-acetylgalactosamine (GalNAc),forming a Core 2 branched structure. Once the Core 2 branch is initiated, at least threesuccessive transfer reactions can take place, involving β(1,4)-galactosyltransferases, α(2,3)-sialyltransferases and α(1,3)-fucosyltransferases. It is known that GT are distributedsequentially in the cis, medial and trans Golgi apparatus in order of intervention andaccording to cell type. We have developed a membrane reconstitution process comprisinggolgi glycoproteins, including GT, by the use of a lectin, the wheat germ agglutinin (WGA). Itis known that WGA interacts with plasma membrane and Golgi apparatus components. Ourreconstituted membrane system showed a high C2GnT-1 activity in vitro and its effectivenessin synthesizing Core2 branched oligosaccharides by sequential glycosylation.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-05-09T17:18:58Z No. of bitstreams: 1 2016 - Ana Paula Miguel Landim.pdf: 1756748 bytes, checksum: edb655700eacaf99a7fa2c3d482f3283 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-09T17:18:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Ana Paula Miguel Landim.pdf: 1756748 bytes, checksum: edb655700eacaf99a7fa2c3d482f3283 (MD5) Previous issue date: 2016-06-02 / CAPES / Banana is a perishable fruit, as it ripens fast and cannot be adequately preserved by the cold, resulting in large post-harvest losses. The application of preservation techniques, such as osmotic dehydration, reduces losses of the commodity in post-harvest stage, extend its shelf-life, while not severely affecting its nutritional values, and functional and sensorial properties, which makes it at processing alternative for the fruit. The aim of this study is to evaluate the kinetics of osmotic dehydration, as well as the quality of the osmotically dehydrated samples in terms of color, texture, and antioxidant capacity, using fructo-oligosaccharide, corn syrup and the mixture of both, under different temperatures. To determine the kinetics, the fruit, cut in cubes, was dehydrated in different solutions, under temperatures of 40, 50 and 60 ? C. The kinetics of water loss (WL) and solid gain (SG) were evalueted at 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 720 to 1440 minutes. The analysis of variance was used to verify the effect of each solution and temperature on kinetics. The kinetic parameters were modeled based on the equations of Peleg, Page modified and Barbosa Junior et al. using non-linear regression. The time to reduce the dehydration rate or penetration to one third of its initial values (t(1/3)) and the process average time (t(average)) were obtained on the Barbosa Junior et al. model The quality of the samples was accessed at these two times, in different solutions under different temperatures. For such, the variation of the instrumental parameters of color, antioxidant capacity (FRAP, DPPH and total phenolic content), and texture (axial compression tests) of samples, in nature as well as processed, were verified. The WL was not affected significantly by the type of solute used, however, the temperature presented significant influence over these parameters (p < 0.05). The experimental data for the WL was adequately adjusted to the Peleg and Page modified models with coefficients of determination (R?) superior than 0.98, mean relative error (E) inferior than 6.5% in all treatments. The water loss content values varied from 15.75 to 28.79% at time t(1/3), while for the time t(averege) 15.75 to 30.27% between treatments. The process of osmotic dehydration had affect on the quality of the final product, showing significant differences between the fruits in natura and processed state, in terms of color, antioxidant capacity and texture of the samples. / A banana ? um fruto perec?vel, pois sofre r?pido amadurecimento, n?o pode ser devidamente conservado pelo frio, sendo acometido por grandes perdas p?s-colheita. A utiliza??o de t?cnicas de conserva??o, como a desidrata??o osm?tica, reduz as perdas p?s-colheita, estende a validade comercial, n?o acarreta em severas altera??es nas caracter?sticas nutricionais, funcionais e sensoriais e mostra-se como uma alternativa de processamento para este fruto. O objetivo desde trabalho foi avaliar a cin?tica da desidrata??o osm?tica, bem como, a qualidade das amostras desidratadas osmoticamente em termos de cor, textura e capacidade antioxidante, utilizando fruto-oligossacar?deo, xarope de milho e a mistura de ambos, em diferentes temperaturas. Para determina??o da cin?tica, a banana, cortada em cubos foi desidratada nas diferentes solu??es, sob as temperaturas de 40, 50 e 60 ?C. As Cin?ticas de Perda de ?gua (PA) e ganho de s?lidos (GS) foram avaliadas nos tempos 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 720 e 1440 minutos. A an?lise de vari?ncia foi usada, a fim de verificar o efeito do tipo de soluto e da temperatura na cin?tica. Os par?metros cin?ticos foram modelados de acordo com a equa??o Peleg, Page modificado e Barbosa J?nior et al. utilizando regress?o n?o-linear. A partir do modelo de Barbosa J?nior et al., obteve-se o tempo para reduzir a taxa de desidrata??o ou impregan??o a um ter?o de seus valores iniciais (t(1/3)) e o tempo m?dio de processo (t(m?dio)). A qualidade das amostras foi avaliada nestes dois tempos, nos diferentes solutos e temperaturas. Para tal, foram verificadas a varia??o dos par?metros instrumentais de cor, a capacidade antioxidante (FRAP, DPPH e teor de fen?licos totais) e a textura (ensaios de compress?o axial) das amostras in natura e processadas. A PA n?o foi afetada significamente pelo tipo de soluto empregado, no entanto, a temperatura apresentou influ?ncia significativa neste par?metro (p < 0,05). Os dados experimentais para a PA se ajustaram adequadamente ao modelo de Peleg e Page modificado e obtiveram-se coeficientes de determina??o (R?) maiores do que 0,98, desvio relativos m?dios (E) inferiores a 6,5% em todos os tratamentos. O modelo do tempo de n-redu??o da taxa de desidrata??o se mostrou uma boa alternativa na defini??o do tempo de processamento das amostras submetidas ? desidrata??o osm?tica. Os valores de perda de ?gua variaram de 15,70 a 28,79% no tempo t(1/3), enquanto que para o tempo de t(m?dio) de 15,75 a 30,27% entre os tratamentos. O processo de desidrata??o osm?tica influenciou na qualidade final dos produtos, apresentando diferen?as significativas entre a fruta in natura e a processada para varia??o dos par?metros de cor, a capacidade antioxidante e a textura das amostras in natura e processadas.

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Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les besoins actuels grandissants pour l'analyse des interactions biomoléculaires nécessitent le développement de systèmes automatisés à forte capacité et haut débit comme la microscopie de fluorescence qui reste une méthode de prédilection. Bien que les méthodes directes (sans marquage des molécules à analyser) présentent une sensibilité plus faible que celles utilisant des marqueurs, leurs nombreux avantages (suivi en temps réel, préparation simplifiée des échantillons) sont des atouts d'importance pour l'analyse quantitative des interactions biomoléculaires. En outre, l'imagerie en résonance des plasmons de surface permet de mesurer simultanément de nombreuses interactions comme les méthodes avec marqueurs. Pour élaborer un tel dispositif, nous avons d'abord identifié les différents paramètres critiques, susceptibles d'être améliorés, comme la nature de la couche métallique. L'utilisation du capteur ainsi développé repose en grande partie sur la chimie de surface: nous avons choisi la synthèse électrochimique de films de polypyrrole qui permet, de manière contrôlée et structurée, une fonctionnalisation simple et robuste de plots contenant diverses molécules. Parallèlement, nous avons développé un programme d'acquisition d'images dont le traitement permet de suivre en temps réel les réactions biomoléculaires sur chaque plot et d'en extraire constantes d'association, de dissociation et d'affinité entre molécules. Enfin, nous avons démontré les possibilités d'application de ce système à l'étude de maladies héréditaires ou du cancer à travers des interactions ADN/ADN (K-ras), ADN/protéines (p53), protéines/protéines (hCG) et oligosaccharides/protéines (HP6/SDF-1).

Les biopuces connaissent un grand essor depuis quelques années avec des applicationspossibles pour l'ADN, les protéines et les oligosaccharides. Une puce à oligosaccharidesprésente des difficultés par rapport à une puce à ADN notamment par les contraintes entempérature et il existe moins de travaux dans ce domaine. Ce travail est donc consacré àl'étude d'une puce à oligosaccharide, par synthèse supportée et par masquage avec un film depolymère. Le procédé de fabrications est particulièrement détaillé.Nous étudions tout d'abord expérimentalement la formation d'un film de polymère obtenu parévaporation d'une goutte de solution polymérique sur une surface structurée chimiquement(zone de mouillabilité différente) en suivant son évolution transitoire. Nous montrons que cetype de surface hétérogène est particulièrement adapté pour la fabrication de biopuces.D'autre part, nous réalisons un modèle numérique de l'évaporation d'une goutte de solutionpolymérique sur une surface chauffée à partir de la méthode de la lubrification et d'un modèlede " hauteur de résine ". Les résultats expérimentaux et de simulation numérique sontcomparés et montrent un bon accord qualitatif sur la forme des films de polymères résultantde l'évaporation.Dans ce travail, la synthèse supportée de biopuces à oligosaccharide est menée à bien enutilisant des polymères et des surfaces judicieusement choisies. En particulier, la technique demasquage par film de polymère se révèle être très bien adaptée pour protéger les oligomères àla fois à hautes et à très basses températures.

Les structures sialylées sont présentes à la surface des cellules sous forme de glycoconjugués,couplés à des protéines ou des lipides. Ces structures jouent un rôle important dans divers processusbiologiques que ce soit à travers l’interaction avec des lectines, ou de par leurs propriétés physicochimiques.Ces structures sont également impliquées dans diverses pathologies et on constatenotamment une forte augmentation du taux d’acides sialiques chez les individus atteints de cancer,due à une surexpession de structures naturelles mais aussi à l’apparition de nouveaux motifs,naturellement absent chez l’individu sain. L’ensemble de ces structures sialylées présente un intérêtsoit par leur rôle biologique soit à cause de leur expression spécifique dans les cancers. Leurobtention est très difficile par voie chimique et la synthèse enzymatique in vitro est efficace mais trèscoûteuse en nucléotide-sucre et ne sont pas adaptées à une production à l'échelle préparative.Dans un premier temps, ces travaux de thèse s’intéressent à la synthèse bactérienne par ingénieriemétabolique d'acides polysialiques fonctionalisés. Ces polysaccharides présentent divers intérêts.Tout d’abord il est possible de les coupler à des protéines actives pour en augmenter le temps dedemi-vie in vivo. Mais ces polysaccharides peuvent également être utilisés dans le cadre de thérapievaccinale, soit contre des bactéries pathogènes de types Neisseria meningitidis qui le présententcomme polysaccharide capsulaire, soit contre les cellules cancéreuses surexprimant cette structure.Ensuite nous avons cherché à obtenir des oligosaccharides spécifiques des cancers, les motifssialylTn, et siallTF, toujours par ingénierie métabolique d’E. coli. Le sialylTn a été couplé à uneplateforme peptidique immunogène afin de construire un candidat vaccin qui a été testé in vitro et invivo sur la souris. / Sialylation is an important feature of glycolipids and glycoproteins of animal cell surfaces. Sialylatedmotifs are involved in many biological processes through lectin interactions or because of theirphysico-chemical properties. There is a great variety of sialylated structural motifs, and in manycases, there is a structure-relationship between the sialylated profile of and some pathologicprocesses. In cancer, there is an increase of sialylation including the apparition of newly andspecifically related sialylated structures belonging to the so-called tumor-associated carbohydrateantigens (TACA). Those structures present a particular interest, but their chemical or chemoenzymaticsynthesis is costly and quite unappropriated for preparative scale.This work addresses to the bacterial synthesis of sialylated motifs through the metabolic engineeringof Escherichia coli. The first part of the thesis deals with the biosynthesis of polysialylatedconjugatable motifs. Those motifs present various biological properties, such as an increase of thelife-time of therapeutic proteins; they also belong to the TACA family since over-expressed incancers. In addition, some of them are bacterial-specific motifs such as in pathogenic Neisseriameningitidis. Altogether, polysialylated conjugates can be useful for the synthesis of therapeuticdrugs and vaccines. The second part of the thesis describes a new way of producing sialylated Tn andTF carbohydrate antigens by metabolic engineering. The sialylTN motif was coupled to a peptidic andimmunogenic scaffold being a potential vaccine candidate, and its ability of raising specific antibodieswas assayed in mouse.