O nematoide de vida livre Panagrolaimus superbus é uma espécie anidrobiótica, ou seja, possui a capacidade de sobreviver ao estresse hídrico extremo adentrando no estado de anidrobiose. Durante tal estado adquiri tolerância a extremos de temperatura (~0 K a +151 °C), pressões hidrostáticas (1,2 GPa) e radiação ionizante. Entretanto, não se sabe qual a tolerância a água deuterada, molécula que possui dois átomos de deutério (isótopo estável e natural do hidrogênio) ao invés do hidrogênio, que em altas concentrações afeta negativamente sistemas biológicos. Além disso, uma vez que o processo de anidrobiose depende do movimento de moléculas de água pela membrana plasmática da célula, não se sabe se os canais responsáveis por este transporte, as aquaporinas, de espécies anidrobióticas possuem alguma particularidade na sua estrutura. Em vista disso, o objetivo deste trabalho visa investigar se em concentrações de 10%, 40% e 99,9% D2O, tanto de modo crônico quanto agudo, P. superbus tem sua viabilidade, crescimento populacional e desenvolvimento alterados. Além disso, a comparação in silico da sequência de aminoácidos (estrutura primária) entre aquaporinas de espécies anidrobióticas e não anidrobióticas, com ênfase nas sequências genéticas de P. superbus foi feita. Os resultados encontrados demonstram a alta tolerância de P. superbus a concentrações relativamente elevadas de D2O, não tendo sua viabilidade e desenvolvimento alterados em nenhum cenário, mesmo com uma troca total, homogênea e instantânea de sua matriz aquosa. Efeitos negativos foram encontrados apenas no crescimento populacional após exposição 10%, 40% e 99,9% D2O, contudo não o inviabilizaram. Ademais, não foram encontradas grandes diferenças entre as sequências primárias de aquaporinas de anidrobiotos e não anidrobiotos, sugerindo que estes canais de água não divergem em estrutura terciária entre tais grupos. Dos dois ESTs encontrados em P. superbus (números de acesso no NCBI: GW411914.1 e GW408200.1) o primeiro deles é o provável representante do gene da aquaporina na espécie, enquanto que o segundo aparenta ser um transcrito não codificante de proteínas. / The free-living nematode Panagrolaimus superbus is an anhydrobiotic species, it means that this species has the capacity to survive extreme water stress entering into the state of anhydrobiosis. During such a state, it acquires tolerance to extremes of temperature (~ 0 K to +151 °C), hydrostatic pressures (1.2 GPa) and ionizing radiation. However, the tolerance to deuterium oxide is poorly investigated. This molecule has two atoms of deuterium (natural and stable isotope of hydrogen) rather than hydrogen and in high concentrations negatively affects biological systems. Furthermore, since the process of anhydrobiosis depends on the movement of water molecules across the cell membrane, it is unclear whether the channels responsible for this transport, aquaporins, of anhydrobiotic species have some particularity in their structures. In view of this, the work aims to investigate whether P. superbus has its viability, population growth and development altered at concentrations of 10%, 40% and 99.9% D2O in chronic and acute expositions. In addition, the in silico analyses of amino acid sequence (primary structure) of aquaporins between anhydrobiotic and non-anhydrobiotic species, with emphasis at the P. superbus genetic sequences, were performed. The results demonstrated the high tolerance of P. superbus at high concentrations of D2O, their viability and development did not change in any scenario, even with a total, homogeneous and instantaneous exchange of their aqueous milieu. Negative effects were found only on population growth after exposure to 10%, 40% and 99.9% D2O, although not hindering the procedure. Furthermore, no significant differences were found between the primary aquaporin sequences of anhydrobiotic and non-anhydrobiotic species, suggesting that these water channels do not differ in tertiary structure between such groups. Two ESTs found in P. superbus, (NCBI access numbers: GW411914.1 and GW408200.1): the first likely corresponds to the aquaporin gene in the species, while the second appears to be a noncoding transcript.

Neste trabalho caracterizamos o nematoide Panagrolaimus sp. linhagem CEW2, originalmente isolado em Monte Negro (RO), Brasil e mantido em nosso laboratório em culturas monoxênicas contendo Escherichia coli. CEW2 se mostrou um nematoide extremófilo capaz de sobreviver ao dessecamento em 10% de umidade relativa por pelo menos 48h. Essa resistência é mais evidente em larvas de primeiro estádio (L1) do que em adultos ou larvas dauer. Quando pré-incubados por 48h em 98% de umidade relativa a sua resistência ao dessecamento aumenta e pode chegar a uma sobrevivência de 86,25% dos indivíduos no caso de L1. Os animais dessecados se tornam também resistentes ao congelamento. Os indivíduos pré-incubados em 98% de umidade relativa tornam-se resistentes ao congelamento. O retorno à atividade após secagem ou congelamento ocorre de maneira diferente dependendo da concentração de NaCl no meio, sugerindo que eles sejam, além de anidrobiontes e criobiontes, sejam também osmobiontes. Um outro aspecto da fisiologia de CEW2 que também começamos a caracterizar é a composição de polipeptídeos das vitelinas de seus ovos. SDS-PAGE das proteínas presente em ovos de CEW2 apresentam 6 bandas principais coradas por Coomassie Blue (com Mr que variam de 85 a 125 kDa), 3 a mais do que aquelas detectadas nos outros dois nematoides cujas vitelinas foram caracterizadas, Caenorhabditis elegans e Oscheius tipulae. Quando comparamos as vitelinas destas três espécies notamos que CEW2 não possui a vitelina de 180 kDa (YP170A e B de C. elegans e VT1 de O. tipulae). Essa análise comparativa das vitelinas de nematoides nos permitiu propor um esquema para a origem das três bandas extras detectadas em CEW2. Não foi possível purificar as vitelinas de CEW2 usando o mesmo protocolo que desenvolvemos para as vitelinas de O. tipulae e C. elegans. Isso se deve a uma atividade proteolítica presente nos homogeneizados de vermes que co-purifica com as vitelinas e leva a sua degradação durante a armazenagem. As atividades proteolíticas presentes nesses homogeneizados foram caracterizados por zimografia e foi possível purificar uma das bandas que cremos ser uma protease digestiva de CEW2 e a responsável pela degradação das vitelinas purificadas. / In this work we characterize some survival and reproductive strategies of the nematode Panagrolaimus sp., strain CEW2. CEW2 was originally isolated in Monte Negro (RO), Brazil. CEW2 is currently maintained in monoxenic cultures with E. coli in our laboratory and has proved to be an extremophile that survives desiccation at 10% relative humidity for at least 48 hours. First instar larvae (L1) are more resistant to desiccation than adults or dauer larvae. When pre-incubated for 48 h at 98% relative humidity their resistance to desiccation increases and can reach a survival rate of 86,25 % with L1individuals. The dried animals also become resistant to freezing. Worms that were pre-incubated at 98% relative humidity become resistant to freezing in water at -20 °C. The return to activity upon drying or freezing occurs differently depending on the NaCl concentration in the medium, suggesting that CEW2 is an osmobiont in addition to its anidrobiotic and criobiotic behavior. We also began to characterize another aspect of CEW2 physiology; the polypeptide composition of the vitellins in their eggs. SDS-PAGE of the proteins present in CEW2 eggs show 6 major Coomassie Blue stained bands (Mr ranging from 85-125 kDa), three more than those detected in the vitellins of Caenorhabditis elegans and Oscheius tipulae. When we compare the vitellins of these three species we notice that CEW2 lacks the yolk proteins of 180 kDa (YP170A and B present in C. elegans and VT1 in O. tipulae). The comparative analysis of nematode vitellins allowed us to propose a model for the origin of the three extra bands detected in CEW2. We propose that in CEW2 the polypeptides that are ortologous to the 180 kDa polypeptides of C. elegans and O. tipulae, suffer a proteolytic cleavage similar to that occurring with the precursor of YP115 and 88 in C. elegans. It was not possible to purify the vitellins of CEW2 using the same protocol developed for the vitellins of O. tipulae and C. elegans. This is due to a proteolytic activity present in homogenized worms which co-purifies with the vitellins and leads to their degradation during the procedure. Proteolytic activities present in these homogenates were characterized by zymography and it was possible to purify one of the bands that we believe to be a digestive protease from CEW2 responsible for the degradation of purified vitellins.

Neste trabalho caracterizamos o nematoide Panagrolaimus sp. linhagem CEW2, originalmente isolado em Monte Negro (RO), Brasil e mantido em nosso laboratório em culturas monoxênicas contendo Escherichia coli. CEW2 se mostrou um nematoide extremófilo capaz de sobreviver ao dessecamento em 10% de umidade relativa por pelo menos 48h. Essa resistência é mais evidente em larvas de primeiro estádio (L1) do que em adultos ou larvas dauer. Quando pré-incubados por 48h em 98% de umidade relativa a sua resistência ao dessecamento aumenta e pode chegar a uma sobrevivência de 86,25% dos indivíduos no caso de L1. Os animais dessecados se tornam também resistentes ao congelamento. Os indivíduos pré-incubados em 98% de umidade relativa tornam-se resistentes ao congelamento. O retorno à atividade após secagem ou congelamento ocorre de maneira diferente dependendo da concentração de NaCl no meio, sugerindo que eles sejam, além de anidrobiontes e criobiontes, sejam também osmobiontes. Um outro aspecto da fisiologia de CEW2 que também começamos a caracterizar é a composição de polipeptídeos das vitelinas de seus ovos. SDS-PAGE das proteínas presente em ovos de CEW2 apresentam 6 bandas principais coradas por Coomassie Blue (com Mr que variam de 85 a 125 kDa), 3 a mais do que aquelas detectadas nos outros dois nematoides cujas vitelinas foram caracterizadas, Caenorhabditis elegans e Oscheius tipulae. Quando comparamos as vitelinas destas três espécies notamos que CEW2 não possui a vitelina de 180 kDa (YP170A e B de C. elegans e VT1 de O. tipulae). Essa análise comparativa das vitelinas de nematoides nos permitiu propor um esquema para a origem das três bandas extras detectadas em CEW2. Não foi possível purificar as vitelinas de CEW2 usando o mesmo protocolo que desenvolvemos para as vitelinas de O. tipulae e C. elegans. Isso se deve a uma atividade proteolítica presente nos homogeneizados de vermes que co-purifica com as vitelinas e leva a sua degradação durante a armazenagem. As atividades proteolíticas presentes nesses homogeneizados foram caracterizados por zimografia e foi possível purificar uma das bandas que cremos ser uma protease digestiva de CEW2 e a responsável pela degradação das vitelinas purificadas. / In this work we characterize some survival and reproductive strategies of the nematode Panagrolaimus sp., strain CEW2. CEW2 was originally isolated in Monte Negro (RO), Brazil. CEW2 is currently maintained in monoxenic cultures with E. coli in our laboratory and has proved to be an extremophile that survives desiccation at 10% relative humidity for at least 48 hours. First instar larvae (L1) are more resistant to desiccation than adults or dauer larvae. When pre-incubated for 48 h at 98% relative humidity their resistance to desiccation increases and can reach a survival rate of 86,25 % with L1individuals. The dried animals also become resistant to freezing. Worms that were pre-incubated at 98% relative humidity become resistant to freezing in water at -20 °C. The return to activity upon drying or freezing occurs differently depending on the NaCl concentration in the medium, suggesting that CEW2 is an osmobiont in addition to its anidrobiotic and criobiotic behavior. We also began to characterize another aspect of CEW2 physiology; the polypeptide composition of the vitellins in their eggs. SDS-PAGE of the proteins present in CEW2 eggs show 6 major Coomassie Blue stained bands (Mr ranging from 85-125 kDa), three more than those detected in the vitellins of Caenorhabditis elegans and Oscheius tipulae. When we compare the vitellins of these three species we notice that CEW2 lacks the yolk proteins of 180 kDa (YP170A and B present in C. elegans and VT1 in O. tipulae). The comparative analysis of nematode vitellins allowed us to propose a model for the origin of the three extra bands detected in CEW2. We propose that in CEW2 the polypeptides that are ortologous to the 180 kDa polypeptides of C. elegans and O. tipulae, suffer a proteolytic cleavage similar to that occurring with the precursor of YP115 and 88 in C. elegans. It was not possible to purify the vitellins of CEW2 using the same protocol developed for the vitellins of O. tipulae and C. elegans. This is due to a proteolytic activity present in homogenized worms which co-purifies with the vitellins and leads to their degradation during the procedure. Proteolytic activities present in these homogenates were characterized by zymography and it was possible to purify one of the bands that we believe to be a digestive protease from CEW2 responsible for the degradation of purified vitellins.