The outcome of leishmaniasis has been shown to be both host genotype and parasite strain dependent. Understanding the role of host and parasite molecules in disease outcome will provide important information for the development of new drugs, new therapies and new vaccines against this disease. In this study, we investigated the role of a host molecule, Phosphatidylinositol 3-kinases (PI3Ks) and a parasite molecule, phosphoglycans in primary and secondary immune response against Leishmania major. We hypothesized that these host and pathogen factors coordinately influence the quality and magnitude of primary and secondary (memory) immune responses (and immunity) against Leishmania major. In the first part of my study, my results show that in the absence of phosphoglycan, antigen-presenting cells (APCs) are able to present parasite antigens to T cells more efficiently and promote a Th1 type of immune responses. However, as phosphoglycan containing molecules are important for parasite survival and virulence, the initial T cell clonal burst is impaired in lpg2-infected mice. This in turn leads to significantly impaired antigen-specific recall responses (measured by proliferation, IFN-g production and delayed-type hypersensitivity response) both in vitro and in vivo. Interestingly, despite this impairment, lpg2- L. major-infected mice were protected against secondary virulent L. major challenge similar to those that healed from WT L. major infections. In the second part of my study, I demonstrate that PI3K deficient mice are highly resistant to primary L. major infection despite impaired T cells response (proliferation and effector cytokines production). Interestingly, this enhanced resistance was not due to enhanced innate immunity or humoral immunity, but was related to reduced regulatory T cell expansion and differentiation. Surprisingly, results from healed PI3Ks deficient mice suggest that an excellent primary resistance to L. major infection does not automatically translate to secondary protective responses because healed p110 KI mice failed to efficiently control secondary L. major challenge infection. We showed that the impaired memory response was due to defective proliferation of Leishmania-specific memory T cells and the inability of central memory T cells to convert to effector memory T cells, which negatively impact on the ability of memory T cells to exit peripheral lymphoid organs and home to the cutaneous site of infection to mediate effector functions. These findings have significant impacts on our knowledge in understanding of host/pathogen interaction and will shed light on future developments of vaccine, vaccination strategy and new drugs.

Parasites of the genus Leishmania are able to secure their survival and propagation within their host by altering key signalling pathways involved in the ability of macrophages (MØs) to directly kill pathogens or to activate cells of the adaptive immune system. One important step in this immune evasion process is the Leishmania-induced activation of host protein tyrosine phosphatase SHP-1. SHP-1 has been shown to directly inactivate JAK2 and Erk1/2, and to play a role in the negative regulation of several transcription factors involved in MØ activation such as: NF-B, STAT-1α, and AP-1. These signalling alterations contribute to the inactivation of critical MØ functions such as the production of IFN-γ-induced nitric oxide (NO), a free radical associated with parasite killing and clearance. In addition to interfering with IFN-γ receptor signalling, Leishmania is able to alter several LPS-mediated responses (e.g. IL-12, TNF-α, NO production) through mechanisms not yet fully understood. A main goal of this study was to better understand the mechanisms used by the parasite to block Toll-like receptor (TLR)-mediated functions. Experiments performed revealed a pivotal role for SHP-1 in the inhibition of TLR-induced MØ activation through binding to and inactivating IL-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK-1). We identified the binding site as an evolutionarily conserved ITIM-like motif, which we named kinase tyrosine-based inhibitory motif (KTIM). Further experiments and sequence analysis revealed that several cytosolic kinases other than IRAK-1 possess potential KTIMs, suggesting it could represent a regulatory mechanism widely used by kinases. The final experimental section aimed to explore the differential ability of the two different stages of Leishmania, promastigotes and amastigotes, to alter MØ signalling and function. In conclusion, this work uncovers a new mechanism whereby Leishmania is able / Les parasites du genre Leishmania assurent leur survie et leur propagation par l'altération de voies de signalisation impliquées dans la capacité des macrophages (MØs) à détruire directement les pathogènes ou à activer les cellules du système immunitaire acquis. Une étape critique de ce mécanisme d'inactivation est l'activation par Leishmania de la protéine phosphatase SHP-1 de la cellule hôte. Il a été démontré que la protéine SHP-1 peut inactiver directement JAK2 ainsi que Erk1/2 et joue un rôle dans la régulation négative de plusieurs facteurs de transcription, tels que NF-κB, STAT-1α et AP-1, impliqués dans l'activation des MØs. L'altération de ces voies de signalisation contribue à l'inactivation de fonctions critiques des MØs telle que la production d'oxyde nitrique (NO) induite par l'IFN-γ, un radical-libre impliqué dans l'anéantissement du parasite. En plus d'inhiber les fonctions engendrées par l'IFN-γ, Leishmania est capable d'inhiber de nombreuses fonctions induites par le LPS, incluant la production d'IL-12, de TNF-α et de NO, et cela par des mécanismes encore peu compris. Le but principal de cette étude était de mieux comprendre les stratégies employées par le parasite afin d'inhiber les fonctions induites par les Toll-like receptors (TLRs). Nos résultats révèlent le rôle critique de SHP-1 dans l'inhibition de l'activation des MØs induite par les TLRs, par l'interaction et l'inactivation de la kinase 1 associée au récepteur IL-1 (IRAK-1). Nous avons également identifié le site de liaison qui semble être un motif conservé lors de l'évolution ressemblant à un ITIM, que nous avons nommé motif de kinase à base de tyrosine inhibiteur (KTIM). Des expériences supplémentaires et l'analyse de séquences ont révélées que plusieurs autres kinases cytosoliques autres qu'IRAK-1 possèdent un motif potentiel KTIMs, suggérant que le KTIM pourrait$

The trypanosomatid parasite Leishmania infects 12 million people in tropical countries. This neglected tropical disease causes debilitating and often fatal consequences in the absence of chemotherapeutic intervention. Consequently, there is a need to identify new drug targets to combat the increasing incidence of resistance to current treatments. An attractive drug target in these parasites is the glycosome, a unique microbody organelle that compartmentalizes several essential enzymatic pathways behind an impermeable membrane. The Leishmania major Peroxin 7 (LPEX7) is a receptor protein that recognizes glycosomal matrix proteins containing an N-terminal peroxisomal targeting signal 2 (PTS2) and facilitates the trafficking of these proteins across the glycosomal membrane. Genetic studies in the related trypanosomatid parasite, Trypanosoma brucei, have demonstrated that PEX7 is essential for parasite viability. LPEX7 is predicted to have a hydrophobic outer surface which has made production of this recombinant protein in the E. coli heterologous system challenging. LPEX7 was successfully purified in the presence of non-ionic detergents, however, this limited the usefulness of this protein in regards to downstream in vitro studies with glycosomal membranes. To investigate the biophysical role of LPEX7 in the trafficking and import of proteins into the glycosome, we have developed a strategy to reliably express and purify recombinant Leishmania PEX7 in the absence of detergents. Subsequent biochemical studies confirmed that the recombinant LPEX7 was functionally active and, like the native protein or detergent purified protein, binds LdPEX5 and PTS2 cargo proteins with nanomolar affinities. Initial investigations of the quaternary structure demonstrated that LPEX7 is in equilibrium between a dimer and tetramer in solution. Preliminary protein-protein interaction domain mapping studies have demonstrated that the C-terminal half LPEX7 was sufficient to bind both LdPEX14 and LdPEX5. / Le parasite trypanosomatide Leishmania affecte plus de 12 millions d'individus dans les pays tropicaux. Cette maladie tropicale négligée a de graves conséquences, parfois fatales, en absence d'interventions thérapeutiques. Il y a, par conséquent, urgence d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour combattre ce fléau et restreindre l'incidence de résistance envers les médicaments présentement employés. Une cible thérapeutique de choix s'est révélée récemment dans cette famille de parasite. Il s'agit du glycosome, un organelle qui compartimente plusieurs voies métaboliques derrière une membrane imperméable. La Péroxine 7 de Leishmania major (LPEX7) est un récepteur cytosolique qui reconnaît certaines protéines destinées pour le glycosome contenant un signal peptidique de type 2 (PTS-2) à leur terminal N et qui facilite le transport vers la membrane du glycosome. Récemment, des études génétiques sur le parasite trypanosomatide Trypanosoma brucei ont démontré que PEX7 est essentiel pour la survie du parasite. Des prédictions bio-informatiques révèlent que LPEX7 contient une surface extérieure hydrophobe, ce qui explique le défi que représente la production de cette protéine de façon recombinante dans le système E. coli. LPEX7 fut purifiée avec succès en présence de détergents ioniques, ce qui a toutefois limité les possibilités d'études d'interactions avec des membranes. Dans le but d'étudier le rôle biophysique de LPEX7 dans le transport et l'importation de protéines vers le glycosome, nous avons développé une stratégie pour exprimer et purifier LPEX7 de façon recombinante en l'absence de détergents. Ensuite, nos études biochimiques ont confirmé que LPEX7 recombinante est active et, tout comme LPEX7 précédemment purifiée avec l'aide de détergents, est capable de lier les protéines contenant un signal PTS-2 et LdPEX5 à des concentrations nano-molaires. Une investigation de la structure quaternaire de LPEX7 a révélé que le récepteur s'assemble en dimères et tétramères en solution. Finalement, des études préliminaires d'interaction protéine-protéine ont illustré que LPEX7 contient un site d'attachement pour LdPEX5 et LdPEX14 sur la demie portion terminale C.

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Over 19 years chewing lice data from Canada geese and mallards were collected. From Canada geese (n=300) 48,669 lice were collected, including Anaticola anseris, Anatoecus dentatus, Anatoecus penicillatus, Ciconiphilus pectiniventris, Ornithobius goniopleurus, and Trinoton anserinum. The prevalence of all lice on Canada geese was 92.3% and the mean intensity was 175.6 lice per bird. From mallards (n=269) 6,986 lice were collected which included: Anaticola crassicornis, A. dentatus, Holomenopon leucoxanthum, Holomenopon maxbeieri and Trinoton querquedulae. The prevalence of lice on mallards was 55.4% and the mean intensity was 42.0 lice per bird. Based on CO1, A. dentatus and Anatoecus icterodes were synonymised as A. dentatus. Anatoecus was found exclusively on the head, Anaticola was found predominantly on the wings, Ciconiphilus, Holomenopon and Ornithobius were observed in several body regions and Trinoton was found most often on the wings of mallards.

Schistosomiasis is one of the most socioeconomically important parasitic diseases, affecting over 200 million people worldwide. Praziquantel is the only drug treatment available in most parts of the world and there is an urgent need to find a viable alternative to this drug. Acetylcholine-gated ion channels of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) family have been shown to be effective drug targets for treatment of various helminth infections. Here, we describe a first investigation of putative nAChR subunits of the model parasite, Schistosoma mansoni. Four predicted subunits, smp_031680, smp_180570, smp_139330, and smp_012000, were cloned from S. mansoni by a combination of RT-PCR and RACE (rapid amplification of cDNA ends) procedures. All four full-length proteins contain prerequisite features of cation-selective nAChRs. Subsequent functional studies by RNA interference (RNAi) in parasite larvae (schistosomulae) and adult worms showed that the four nAChR subunits play an important role in the control of motor activity. RNAi targeting smp_031680 and smp_180570 caused hypoactivity, whereas knockdown of smp_139330 and smp_012000 caused hyperactivity, suggesting these subunits form channels that either stimulate or inhibit movement. Further confocal immunofluorescence studies of smp_031680 and smp_139330 showed that nAChRs are expressed extensively in both central and peripheral nervous systems of the parasite, musculature (smp_139330 only) and female reproductive system. Importantly, we observed distinct expression patterns of smp_031680 and smp_139330, which suggests that they are not part of the same channel. Our repeated efforts to heterologously express the four putative subunits in Xenopus oocytes were unsuccessful. We were unable to obtain functional channels from subunits expressed individually or in combination, in the presence and absence of S. mansoni orthologues of Caenorhabditis elegans ancillary proteins ric-3 and unc-50, which are known to improve heterologous expression of nAChRs. As an alternative strategy, we modified the subunits by inserting a fluorescent tag, sub-cloned the modified sequences into a mammalian expression vector, and tested for protein expression in transfected HEK293 cells by fluorescence microscopy. The results show that nAChRs can be expressed in the mammalian cells but additional experiments are needed to test for channel activity. All in all, this is a small yet significant first step in elucidating the parasite's cholinergic nervous system and identifying some of the receptors involved in cholinergic motor control in S. mansoni. / La schistosomiase est une des maladies parasitaires les plus importantes sur le plan socioéconomique, affectant plus de 200 millions de personnes à travers le monde. Le praziquantel est le seul médicament disponible pour le traitement de la schistosomiase dans la plupart des régions du monde et il est urgent de trouver un traitement de rechange viable pour complémenter ce médicament. Il a été démontré que les canaux ioniques de type pentamériques sensibles à de l'acétylcholine appartenant à la famille des récepteurs nicotiniques (nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) sont la cibles de plusieurs médicaments vermifuges utilisés pour le traitement de diverses infections causées par des helminthes. Dans ce mémoire, nous décrivons pour la première fois l'existence de sous-unités nAChR putatives chez le parasite modèle Schistosoma mansoni. Les séquences codantes complètes de quatre sous-unités putatives, smp_031680, smp_180570, smp_139330, et smp_012000, ont été déterminées et clonées chez S. mansoni en utilisant une combinaison de RT-PCR (transcription inverse et réaction en chaîne par la polymérase) et de RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc). Les quatre séquences protéiques obtenues possèdent les caractéristiques typiques des nAChRs perméables aux cations. Nous démontrons également grâce à des études fonctionnelles d'interférence de l'ARN (RNAi) réalisées dans des larves de parasites (schistosomules) et des vers adultes que les quatre sous-unités nAChR jouent un rôle important dans le contrôle de l'activité motrice. En effet, nous avons observé que l'RNAi ciblant smp_031680 et smp_180570 causait l'hypoactivité motrice, tandis que la diminution de l'expression génique de smp_139330 et smp_012000 causait l'hyperactivité motrice, suggérant par conséquent que ces sous-unités forment des canaux ioniques capable de stimuler ou d'inhiber l'activité motrice. Par ailleurs, des études d'immunolocalisation et de microscopie confocale ont montré que les sous-unités nAChRs smp_031680 et smp_139330 sont abondamment exprimées dans les systèmes nerveux central et périphérique du parasite, ainsi qu'au niveau de la musculature (smp_139330 seulement) et du système reproducteur féminin. Il est important de noter nous avons observé des profils d'expression distincts entre smp_031680 et smp_139330, ce qui suggère que ces sous-unités ne font pas partie du même récepteurs. Nos tentatives répétées pour exprimer de manière hétérologue ces quatre sous-unités putatives dans des ovocytes de Xenopus ont été infructueuses. Nous n'avons pas pu obtenir de récepteurs fonctionnels à partir de sous-unités exprimées individuellement ou en combinaison, en présence et en l'absence de protéines auxiliaires de S. mansoni orthologues aux protéines ric-3 et unc-50 de Caenorhabditis elegans, lesquelles sont connus pour améliorer l'expression hétérologue des nAChRs. Alternativement, nous avons modifié les sous-unités en y insérant un marqueur fluorescent et avons sous-cloné ces séquences dans un vecteur d'expression de mammifère. Nous avons ensuite visualisé par immunofluorescence l'expression des protéines d'intérêts transfectées dans des cellules HEK293. Les résultats montrent que les nAChRs sont exprimés dans les cellules de mammifères, mais d'autres expériences sont nécessaires afin de tester l'activité de ces récepteurs. Somme toute, bien que limités, nos résultats constituent un premier pas important dans la compréhension du système nerveux cholinergique du parasite et ont permis d'identifier quelques-uns des récepteurs impliqués dans le contrôle cholinergique des fonctions motrices chez S. mansoni.

In parasitic platyhelminths, including Schistosoma mansoni the coordination of neuromuscular system is critical for continued propagation, development and successful completion of the lifecycle. Neuromuscular signaling in these parasites is mediated by a variety of neurotransmitters, both small molecules ("classical") transmitters and neuropeptides. Biogenic amines (BA) constitute the largest subset of classical neurotransmitters and play several key roles in the control of schistosome muscle function and movement. There are several putative BA receptors identified in the S. mansoni genome, the majority of which are Class A G protein coupled receptors (GPCRs). Here we report the functional role of these putative BA receptors in parasite development and motility by developmental expression analysis and RNAi screening. We performed an expression analysis of several putative BA receptors at the RNA level in different developmental stages of the parasite, using reverse-transcription coupled to quantitative PCR (RT-qPCR). One of these proteins is a previously described serotonin receptor of S. mansoni (named Sm5HTR) and the others are novel "orphan" BA-like receptors. The analysis showed that the BA receptors tested are expressed in all developmental stages, however the majority are preferentially expressed in cercaria and schistosomula, suggesting these receptors play particularly important roles in parasite larvae. Next we performed RNA interference (RNAi) targeting the same BA receptors by transfecting S.mansoni larvae with small interfering RNA (siRNA) and analyzed for effects on motor activity by comparing with the control groups. Given that BAs are known modulators of schistosome movement, we hypothesized that the RNAi would produce a motor phenotype in the larvae and this was confirmed by the data. The results identified strongly hypoactive phenotypes for three out of four receptors tested, including Sm5HTR (Smp_126730), Smp_150180 and Smp_120620), all showing significant reduction in movement compared to control larvae transfected with irrelevant (scrambled) siRNAs. The RNAi phenotype correlated with a significant and specific knockdown in transcript levels as determined by RT-qPCR. To elucidate the mode of action of Sm5HTR we also performed confocal immunolocalization analysis using a specific peptide antibody. The expression pattern suggests Sm5HTR is highly abundant in the central and peripheral nervous system of the parasite, including the peripheral innervation of the body wall muscles responsible for movement. Together the results suggest that Sm5HTR and other BA receptors play an important role in the control of schistosome motility, particularly the larvae, and could be potential targets for new drug discovery. / En plathelminthes parasites, y compris Schistosoma mansoni la coordination de système neuromusculaire est essentiel pour continuer à se propager, le développement et la réussite du cycle de vie. Signalisation neuromusculaire chez ces parasites est médiée par une variété de neurotransmetteurs, les petites molécules (classique) des émetteurs et des neuropeptides. Les amines biogènes (BA) constituent le plus grand sous-ensemble de neurotransmetteurs classiques et jouent plusieurs rôles clés dans le contrôle de la fonction musculaire schistosome et le mouvement. Il RNA ya plusieurs récepteurs BA putatifs identifiés dans le génome de S. mansoni, dont la majorité sont des récepteurs couplés aux protéines de classe AG (GPCR). Nous rapportons ici le rôle fonctionnel de ces récepteurs putatifs de BA dans le développement du parasite et de la motilité par analyse de l'expression du développement et de dépistage RNAi. Nous avons effectué une analyse de l'expression de plusieurs récepteurs de BA putatifs au niveau de l' dans les différents stades de développement du parasite, en utilisant la transcription inverse couplée à une PCR quantitative (RT- qPCR). Une de ces protéines est un récepteur de la sérotonine décrit précédemment de S. mansoni (nommé Sm5HTR) et les autres sont de nouveaux récepteurs "orphelins" BA -like . L'analyse a montré que les récepteurs de la BA testés sont exprimés dans tous les stades de développement mais la majorité sont préférentiellement exprimé dans les cercaires et schistosomule, suggérant que ces récepteurs jouent un rôle particulièrement important dans les larves de parasite. Suivant nous avons effectué l'interférence RNA (RNAi) de cibler les mêmes récepteurs de BA par transfection larves S.mansoni avec petits RNA interférents (siRNA) et analysé les effets sur l'activité motrice par comparaison avec les groupes témoins. Étant donné que le BAs sont des modulateurs du mouvement schistosome connu, nous avons supposé que l' RNAi serait de produire un phénotype de moteur dans les larves et cela a été confirmé par les données. Les résultats identifiés phénotypes fortement hypoactif pour trois des quatre récepteurs testés, y compris Sm5HTR (Smp_126730), Smp_150180 et Smp_120620), tous montrant une réduction significative de mouvement par rapport à lutter contre les larves transfectées avec non pertinentes (brouillés) siRNA. Le phénotype RNAi corrélée avec un effet de choc important et spécifique dans les niveaux de transcription tel que déterminé par RT- qPCR. Pour élucider le mode d'action de Sm5HTR nous avons également effectué une analyse de immunolocalisation confocale en utilisant un anticorps anti- peptide spécifique. Le profil d'expression suggère Sm5HTR est très abondant dans le système nerveux central et périphérique du parasite, y compris l'innervation périphérique des muscles de la paroi du corps chargés de mouvement. Ensemble, les résultats suggèrent que Sm5HTR et d'autres récepteurs de la BA jouent un rôle important dans le contrôle de la motilité schistosome, en particulier les larves, et pourraient être des cibles potentielles pour la découverte de nouveaux médicaments.