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C?lulas-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de indiv?duos com displasia cortical focal do tipo Taylor : buscando a compreens?o da patog?nese durante o processo de neurodiferencia??oMajolo, Fernanda 11 January 2018 (has links)
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Previous issue date: 2018-01-11 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Malformations of cortical development (MDC) include a wide spectrum of Central Nervous System (CNS) disorders related to a complex process of cortex formation. Focal Cortical Dysplasia (FCD), a common type of MDC, is reported as the most frequent structural brain lesion found in children with refractory epilepsy to drug treatment undergoing surgery. Surgical treatment, with complete resection of the dysplastic lesion, is able to stop the seizure resistant to antiepileptic drugs, improving the individual's quality of life and reducing morbidity. FCD is characterized by multiple types of alterations both in cortical architecture and in cytologic abnormalities and it?s pathogenesis is still unknown. In 2004, Palmini et al. classified DCF according to white matter and cortical layer architecture. Taylor-type FCD is characterized by cortical laminar disorganization and dysplastic neurons, compromising the organization of the cortex into six-layered traditionally known. Understanding the mechanisms of action of neurological diseases has involved the use of animal models. However, in the case of brain development of epileptic syndromes, many decades of study have failed to provide a conclusive insight of their mechanisms. Modeling neurological diseases is especially attractive for the application of induced pluripotent stem cells (iPSCs), making possible to derive specific neurons for in vitro studies, contributing to the investigation of the disease. The aim of the present study was to investigate the possible differences in neurogenesis and neurodifferentiation of iPSCs from fibroblasts of individuals affected by Taylor-type FCD and normal individuals. iPSCs were generated from skin fibroblasts of two FCD individuals and two healthy individuals, to form the control group. The reprogramming was done through the fibroblasts exposure to viral vectors containing the OCT4, KLF4, SOX2, and c-MYC genes and the clones were characterized by immunohistochemistry. iPSCs were neurodifferentiated and analyzed at the 14th, 22nd and 35th days. We also analyzed the brain tissue, fibroblasts and iPSCs cells from the individuals. Through qRT-PCR, the expression of 14 genes involved in the neurodifferentiation process were quantified. These genes are associated to neural migration and differentiation, synaptic aspects and Notch signaling. Both individuals were diagnosed with Taylor-type FCD, more specifically, type IIb. In general, individuals with dysplasia presented alterations in the relative quantification in the most genes analyzed compared to control individuals in all processes and study groups (fibroblasts, brain tissue, iPSCs
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and neurodifferentiated cells). The genes involved in the neural migration and differentiation processes, as well as synaptic aspects and Notch signaling presented quite altered expressions in dysplastic individuals, with the beginning of the majority processes early, before the physiologically typical period. From the found results, we can infer that during the embryonic period, in the neurogenesis and neurodifferentiation process, individuals affected by the disease, possibly presents neuroblasts more sensitive to stimulus, presenting differences in the development of the Nervous System. These changes may be directly related to dysplastic brain development. This work extends the understanding of embryonic neurodevelopment, open up opportunities to further investigations of the involvement and influence of each genes analyzed in the pathogenesis of FCD, as well as in each mechanism of action involved in the brain development. / As Malforma??es do Desenvolvimento Cortical (MDC) re?nem uma ampla gama de patologias do Sistema Nervoso Central (SNC) relacionadas a um complexo processo de forma??o do c?rtex. A Displasia Cortical Focal (DCF), tipo comum de MDC, ? relatada como a les?o cerebral estrutural mais frequente encontrada em crian?as com epilepsia refrat?ria ao tratamento medicamentoso submetidas ? cirurgia. O tratamento cir?rgico, com a ressec??o completa da les?o displ?sica, ? capaz de cessar a convuls?o resistente a drogas antiepil?ticas, melhorando a qualidade de vida do indiv?duo e diminuindo a morbidade. A DCF ? caracterizada por m?ltiplos tipos de altera??es tanto na arquitetura cortical quanto em anormalidades citol?gicas e sua patog?nese ainda ? desconhecida. Em 2004, Palmini e colaboradores classificaram as DCF de acordo com observa??es na subst?ncia branca e na arquitetura da camada cortical. A DCF do tipo Taylor ? caracterizada por uma desorganiza??o laminar e neur?nios displ?sicos, comprometendo a organiza??o do c?rtex em seis camadas histol?gicas tradicionalmente conhecidas. A compreens?o dos mecanismos de a??o das doen?as neurol?gicas tem envolvido o uso de modelos animais. Por?m, no caso do desenvolvimento cerebral das s?ndromes epil?pticas muitas d?cadas de estudo n?o conseguiram fornecer uma vis?o conclusiva sobre seus mecanismos. Modelar doen?as neurol?gicas ? especialmente atraente para aplica??o das c?lulas pluripotentes induzidas (iPSCs), possibilitando derivar neur?nios espec?ficos do pr?prio paciente para estudos in vitro, contribuindo para a investiga??o da doen?a. O objetivo do presente estudo foi investigar as poss?veis diferen?as na neurog?nese e neurodiferencia??o de iPSCs a partir de fibroblastos de indiv?duos acometidos pela DCF do tipo Taylor e indiv?duos normais. As iPSCs foram geradas a partir de fibroblastos de pele de dois indiv?duos displ?sicos e dois indiv?duos saud?veis, para compor o grupo controle. A reprograma??o se deu atrav?s da exposi??o dos fibroblastos a vetores virais contendo os genes OCT4, KLF4, SOX2, e c-MYC e os clones gerados foram caracterizados por imunohistoqu?mica. As c?lulas iPSCs foram neurodiferenciadas e analisadas nos per?odos de 14, 22 e 35 dias. Tamb?m foram analisados o tecido cerebral, fibroblastos e c?lulas iPSCs dos indiv?duos. Atrav?s de qRT-PCR, a express?o de 14 genes envolvidos no processo de neurodiferencia??o foram quantificados. Estes genes est?o associados a migra??o e diferencia??o neural,
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aspectos sin?pticos e sinaliza??o Notch. Ambos os indiv?duos foram diagnosticados com DCF do tipo Taylor, mais especificadamente, do tipo IIb. No geral, os indiv?duos displ?sicos apresentaram altera??es na quantifica??o relativa na maioria dos genes analisados comparados aos indiv?duos controle, em todos os processos e grupos de estudo (fibroblastos, tecido cerebral, iPSCs e c?lulas neurodiferenciadas). Os genes envolvidos nos processos de migra??o e diferencia??o neural, aspectos sin?pticos e sinaliza??o Notch apresentaram express?es bastante alteradas nos indiv?duos displ?sicos, com o in?cio da maioria dos processos precoces, antes do per?odo fisiologicamente t?pico. A partir dos resultados encontrados, podemos inferir que durante o per?odo embrion?rio, no processo de neurog?nese e neurodiferencia??o, indiv?duos acometidos pela doen?a, possivelmente possuem neuroblastos mais sens?veis a est?mulos, apresentando diferen?as no desenvolvimento do Sistema Nervoso. Essas altera??es podem estar diretamente relacionadas com a forma??o do c?rebro displ?sico. Este trabalho amplia a compreens?o do neurodesenvolvimento embrion?rio, abrindo portas para futuras investiga??es de forma mais aprofundada sobre o envolvimento e influ?ncia de cada um dos genes analisados na patog?nese da DCF, bem como em cada mecanismo de a??o envolvido na forma??o do c?rebro.
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Polimorfismos nos genes ERBB2 e PARK2/PACRG e sua associa??o com a hansen?ase em popula??es do Rio Grande do Norte e Par?Ara?jo, S?rgio Ricardo Fernandes de 20 December 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013-12-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / O tropismo do M. leprae pela pele e nervos perif?ricos, confere ? hansen?ase caracter?sticas peculiares, tais como perda de sensibilidade e deformidades teciduais. Hipotetizamos que a susceptibilidade do hospedeiro ? gerida por um complexo conjunto de fatores diferentes, como aumento da express?o dos genes ERBB2, PARK2 e PACRG e/ou o ganho de atividade dos seus produtos g?nicos, em virtude de polimorfismos nesses genes. Outro fator que hipotetizamos estar contribuindo com a susceptibilidade ? hansen?ase, juntamente com os fatores gen?ticos, ? a exist?ncia de elementos de risco entre pessoas suscept?veis, tais como, co-morbidades e exposi??o prolongada ao pat?geno. Tamb?m hipotetizamos que a distribui??o desigual da doen?a em algumas ?reas populacionais, com forma??o de aglomerados, seja devido, a elevada densidade populacional de pessoas suscept?veis em ?reas de risco por tempo prolongado. Portanto, para comprovar essas hip?teses tem-se os seguintes objetivos: 1) Testar o envolvimento de polimorfismos nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG com a hansen?ase em duas ?reas end?micas, mas com popula??es distintas; 2) Testar a rela??o de fatores de risco exposicionais e co-morbidades, dentre outros, com o aumento de susceptibilidade ? hansen?ase na popula??o do Rio Grande do Norte e 3) Avaliar se fatores como densidade demogr?fica e padr?o socioecon?mico e sanit?rio est?o contribuindo com a desigual distribui??o da doen?a em ?rea end?mica para a hansen?ase no estado do Rio Grande do Norte. Este estudo foi desenvolvido em 3 etapas: Foram genotipados marcadores no gene ERBB2 na popula??o de Bel?m/PA, usando uma abordagem familiar. Num segundo momento foram genotipados marcadores nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG na popula??o do Rio Grande do Norte, usando uma abordagem caso-controle. Num terceiro momento, foi avaliada a distribui??o espacial da hansen?ase em Nova Cruz/RN. Foram feitas an?lises in silico, que apontaram para uma muta??o delet?ria no gene ERBB2 (rs1058808) e outra no gene PARK2 (rs1801334). Atrav?s de an?lise de modelagem molecular tamb?m foi encontrada uma muta??o potencialmente capaz de alterar a fun??o da prote?na ErbB2 (rs1801200). A genotipagem da popula??o de Bel?m/PA mostrou como fatores de risco dentre as fam?lias analisadas os polimorfismos rs2517956 e rs1058808 no gene ERBB2. Na genotipagem da popula??o do Rio Grande do Norte, encontramos como fatores de risco, os polimorfismos rs6915128 e rs1801334 para a hansen?ase per se e suas formas cl?nicas e rs1333955 para o ENH. Encontramos dois fatores de risco que justificaram a distribui??o desigual dos casos de hansen?ase na cidade de Nova Cruz/RN, a elevada densidade demogr?fica e o maior tempo de moradia de pessoas suscept?veis em ?reas de risco. Os genes PARK2, PACRG e ERBB2 participam da patog?nese da hansen?ase e, portanto s?o s?rios candidatos a alvos para agentes terap?uticos. Nesse estudo foi encontrado um SNP que tamb?m j? havia sido associado ao mal de Parkinson, e portanto, pode haver um compartilhamento funcional da parquina entre a hansen?ase e o Parkinsonismo. Nesse estudo tamb?m foi encontrado pela primeira vez associa??o entre variantes gen?ticas de ERBB2 e a hansen?ase
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