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Etude de la réponse de Saccharomyces cerevisiae à une perturbation NADPH par une approche de biologie des systèmes / Study of the response to NADPH perturbation by a systems biology approach in Saccharomyces cerevisiaeCelton, Magalie 21 October 2011 (has links)
L'élucidation des propriétés du réseau métabolique est fondamentale pour la compréhension du fonctionnement cellulaire et pour l'élaboration de stratégies d'ingénierie métabolique. L'objectif de cette thèse était de mieux comprendre la régulation du métabolisme du NADPH, un métabolite "hub" qui joue un rôle central dans de nombreux processus cellulaires, chez Saccharomyces cerevisiae en fermentation. Nous avons utilisé une démarche systématique couplant modélisation et approches multi-“omics” pour étudier de façon quantitative la réponse à une perturbation de la demande en NADPH. Un système expérimental original, basé sur l'expression d'une butanediol déshydrogénase modifiée NADPH-dépendante a été utilisé pour augmenter de façon contrôlée la demande en NADPH. L'utilisation de ce dispositif, le développement et l'utilisation d'un modèle stœchiométrique de la levure dédié à la fermentation ont permis de prédire la répartition des flux pour différents niveaux de perturbation. Ces analyses ont montré, en premier lieu, la très grande capacité de la levure à faire face à des demandes très importantes de NADPH représentant jusqu'à 40 fois la demande anabolique. Pour des demandes modérées (allant jusqu'à 20 fois la demande anabolique), la perturbation est principalement compensée par une augmentation du flux à travers la voie des pentoses phosphate (VPP) et à moindre titre à travers la voie acétate (Ald6p). Pour une forte demande en NADPH, correspondant à 40 fois la demande anabolique, le modèle prédit la saturation de la VPP ainsi que la mise en place du cycle glycérol-DHA, qui permet l'échange du NADH en NADPH. Des analyses fluxomique (13C), métabolomique et transcriptomique, ont permis de valider ces hypothèses et de les compléter. Nous avons mis en évidence différents niveaux de régulation selon l'intensité de la perturbation : pour les demandes modérées, les flux sont réajustés par un contrôle au niveau enzymatique ; pour de fortes demandes, un contrôle transcriptionnel de plusieurs gènes de la VPP ainsi que de certains gènes des voies de biosynthèse des acides aminés est observé, cet effet résultant probablement de la moindre disponibilité en NADPH. Dans l'ensemble, ce travail a apporté un nouvel éclairage sur les mécanismes impliqués dans l'homéostasie du NADPH et plus généralement dans l'équilibre redox intracellulaire. / The elucidation of the properties of metabolic network is essential to increase our understanding of cellular function and to design metabolic engineering strategies. The objective of this thesis was to better understand the regulation of the metabolism of NADPH, a “hub” metabolite which plays a central role in many cellular processes in Saccharomyces cerevisiae during fermentation. We used a systematic approach combining modeling and multi-“omics” analyses to study quantitatively the response to a perturbation of the NADPH demand. An original experimental system, based on the expression of a modified NADPH-dependent butanediol dehydrogenase was used to increase the demand for NADPH in a controlled manner. Through the use of this device and the development and use of a stoichiometric model of yeast dedicated to the fermentation, we predicted the flux distribution for different levels of perturbation. These experiments showed, first, the overwhelming ability of yeast to cope with very high NADPH demand, up to 40 times the anabolic demand. For a moderate level (up to 20 times the anabolic demand), the perturbation is mainly compensated by increased flux through the pentose phosphate pathway (PPP) and to a lesser extent through the acetate pathway (Ald6p). For a high NADPH demand, corresponding to 40 times the anabolic demand, the model predicts the saturation of the PPP as well as the operation of the glycerol-DHA cycle, which allows the exchange of NADH to NADPH. Fluxomics (13C), metabolomics and transcriptomics data were used to validate and to complement these hypotheses. We showed different levels of control depending on the intensity of the perturbation: for moderate demands, flux remodeling is mainly achieved by enzymatic control; for a high demand, a transcriptional control is observed for several genes of the PPP as well as some genes of the amino acids biosynthetic pathways, this latter effect being likely due to the low NADPH availability. Overall, this work has shed new light on the mechanisms governing NADPH homeostasis and more generally the intracellular redox balance.
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Etude fonctionnelle du génome de Bacillus subtilis : de nouvelles régulations transcriptionnelles du métabolisme central du carbone.Doan, Thierry 04 1900 (has links) (PDF)
Chez Bacillus subtilis, la transcription de l'opéron gapA, comprenant les gènes de la partie centrale de la glycolyse, est stimulée en présence de sources de carbone glycolytiques. Nos études in vivo et in vitro de CggR, le répresseur qui contrôle cette stimulation, ont démontré d'une part que celui-ci a la capacité de se lier à une séquence d'ADN inhabituellement longue, consistant en une répétition directe de deux motifs (CGGGACN6TGTCN4CGGGACN6TGTC) et située entre le promoteur et le codon d'initiation de l'opéron cggR-gapA, et d'autre part que son activité est inhibée par le fructose-1,6-biphosphate. Des analyses de séquence et des expériences de transcriptome ont indiqué que CggR, qui est très conservé chez les bactéries à Gram positif et qui définit une sous-famille de la famille de régulateurs transcriptionnels SorC/DeoR, est spécialisé dans le contrôle des gènes de la glycolyse. Ainsi, une collaboration a été engagée avec des structuralistes (CBS, Montpellier) pour aller plus loin dans la connaissance de ce prototype d'une famille encore peu connue de régulateurs. Deux paires de gènes paralogues ont été détectés dans le génome (ywkA et malS, ytsJ et mleA) dont les produits sont homologues à des enzymes maliques. L'analyse transcriptomique globale d'une souche sauvage cultivée en présence de glucose ou de malate comme seule source de carbone montre que l'expression d'ywkA est induite en présence de malate. En collaboration avec l'équipe de Y. Fujita, nous avons montré qu'ywkA codait bien une enzyme malique NADdépendante dont l'expression est spécifiquement induite par le malate extracellulaire et insensible à la répression catabolique. De plus, nous avons montré que le système à deux composants YufL-YufM active directement la transcription d'ywkA en présence de malate. Cependant, YwkA n'est pas requis pour la croissance en présence de malate comme seule source de carbone. La technique d'analyse du transcriptome au moyen de membranes à haute densité est maintenant acquise au laboratoire. Nous avons commencé à mettre à profit cet outil pour une étude globale de l'expression génique en fonction de différentes sources de carbone.
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Carbon metabolism in transgenic roots with altered levels of hexokinase and triosephosphate isomerase and growing under different nitrogen statusSedaghatkish, Afsaneh 01 1900 (has links)
Ce projet a pour but d’évaluer la capacité de la voie des pentoses phosphates (VPP) dans les racines transgéniques de pomme de terre (Solanum tuberosum) modifiées pour exprimer différents niveaux de l'hexokinase (HK) et de la triosephosphate isomérase cytosolique (cTPI). Dans les racines, la VPP alimente la voie de l’assimilation de l’azote en equivalents réducteurs et permet donc la biosynthèse des acides aminés. Le glucose-6-phosphate produit par l’HK est consommé par la partie oxydative de la VPP catalysée par la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) et la 6-phosphogluconate déshydrogénase (6PGDH). Les changements dans l'expression de HK et cTPI peuvent affecter le fonctionnement de la VPP et les mécanismes qui sont liés à l’utilisation des équivalents réducteurs produits par la VPP, comme l'assimilation de l’azote et la synthèse des acides aminés. Afin d’évaluer l’effet des manipulations génétiques de l’HK et de la cTPI sur l’assimilation de l’azote, nous avons cultivé les racines transgéniques sur des milieux contenant des concentrations élevées (7 mM) ou basses (0,7 mM) de nitrate d’ammonium comme source d’azote. Les résultats montrent que la culture sur un milieu riche en azote induit les activités G6PDH et 6PGDH. Les données montrent que la capacité de la VPP est plus grande avec des niveaux élevés en HK ou en cTPI. Nous avons aussi pu démontrer une plus grande activité spécifique de l’HK dans les conditions pauvres en azote. Ces données ont été complémentées par des mesures des pools d’acides aminés dans les racines transgéniques cultivées sur différents niveaux d’azote. Aucune tendance notable des pools d’acides aminés n’a été remarquée dans les racines modifiées pour leur contenu en HK suggèrant que la manipulation de HK n’affecte pas l'assimilation de l’azote. Dans les racines transgéniques modifiées pour la cTPI, les ratios Gln/Glu et Asn/Asp sont plus élevés chez les clones antisens, indiquant une assimilation de l’azote plus élevée. Ces résultats ont démontré l'activation de l'assimilation de l’azote chez les clones antisens cTPI dans les conditions élevées et basses d’azote alors que la manipulation de l’HK n’affecte pas l’assimilation de l’azote. / This study investigates the capacity of the oxidative pentose phosphate pathway (oxPPP) and nitrogen metabolism in transgenic potato (Solanum tuberosum) roots modified to express different levels of hexokinase (HK) or cytosolic triosephosphate isomerase (cTPI) growing under different nitrogen regimes. The flux of carbon through the oxPPP in cTPI antisense roots is higher than control roots growing under high supply of N. On the other hand, the conversion of Glucose (Glc) to Glucose-6-phosphate (G6P) is higher in roots overexpressing HK than in antisense HK roots growing at a high level of N. Therefore, overexpression of HK or down regulation of cTPI activities in transgenic roots might be compensated by increased C catabolism through the oxPPP. In order to see the affect of HK and cTPI manipulation on N assimilation, the transgenic roots were grown on media with low or high concentration of ammonium nitrate as the N source. The specific activity of the oxPPP enzymes glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH) were both increased by an increased N supply in HK and cTPI transgenic roots. This is consistent with the provision of reducing equivalents for N assimilation. The data also show that the capacity of the oxPPP is higher in roots with high HK or cTPI activity. We were able to detect higher HK specific activity in N deficient conditions. These data were complemented with measurements of amino acid pools in transgenic roots. No trend in amino acid pools was found in roots modified for HK activity. However, down regulation of cTPI led to higher Gln, Gln/Glu and Asn/Asp ratios, indicating higher assimilation of N. These results demonstrated the activation of N assimilation in cTPI antisense clones while the manipulation of HK is unlikely to affect the N assimilation.
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Carbon metabolism in transgenic roots with altered levels of hexokinase and triosephosphate isomerase and growing under different nitrogen statusSedaghatkish, Afsaneh 01 1900 (has links)
Ce projet a pour but d’évaluer la capacité de la voie des pentoses phosphates (VPP) dans les racines transgéniques de pomme de terre (Solanum tuberosum) modifiées pour exprimer différents niveaux de l'hexokinase (HK) et de la triosephosphate isomérase cytosolique (cTPI). Dans les racines, la VPP alimente la voie de l’assimilation de l’azote en equivalents réducteurs et permet donc la biosynthèse des acides aminés. Le glucose-6-phosphate produit par l’HK est consommé par la partie oxydative de la VPP catalysée par la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) et la 6-phosphogluconate déshydrogénase (6PGDH). Les changements dans l'expression de HK et cTPI peuvent affecter le fonctionnement de la VPP et les mécanismes qui sont liés à l’utilisation des équivalents réducteurs produits par la VPP, comme l'assimilation de l’azote et la synthèse des acides aminés. Afin d’évaluer l’effet des manipulations génétiques de l’HK et de la cTPI sur l’assimilation de l’azote, nous avons cultivé les racines transgéniques sur des milieux contenant des concentrations élevées (7 mM) ou basses (0,7 mM) de nitrate d’ammonium comme source d’azote. Les résultats montrent que la culture sur un milieu riche en azote induit les activités G6PDH et 6PGDH. Les données montrent que la capacité de la VPP est plus grande avec des niveaux élevés en HK ou en cTPI. Nous avons aussi pu démontrer une plus grande activité spécifique de l’HK dans les conditions pauvres en azote. Ces données ont été complémentées par des mesures des pools d’acides aminés dans les racines transgéniques cultivées sur différents niveaux d’azote. Aucune tendance notable des pools d’acides aminés n’a été remarquée dans les racines modifiées pour leur contenu en HK suggèrant que la manipulation de HK n’affecte pas l'assimilation de l’azote. Dans les racines transgéniques modifiées pour la cTPI, les ratios Gln/Glu et Asn/Asp sont plus élevés chez les clones antisens, indiquant une assimilation de l’azote plus élevée. Ces résultats ont démontré l'activation de l'assimilation de l’azote chez les clones antisens cTPI dans les conditions élevées et basses d’azote alors que la manipulation de l’HK n’affecte pas l’assimilation de l’azote. / This study investigates the capacity of the oxidative pentose phosphate pathway (oxPPP) and nitrogen metabolism in transgenic potato (Solanum tuberosum) roots modified to express different levels of hexokinase (HK) or cytosolic triosephosphate isomerase (cTPI) growing under different nitrogen regimes. The flux of carbon through the oxPPP in cTPI antisense roots is higher than control roots growing under high supply of N. On the other hand, the conversion of Glucose (Glc) to Glucose-6-phosphate (G6P) is higher in roots overexpressing HK than in antisense HK roots growing at a high level of N. Therefore, overexpression of HK or down regulation of cTPI activities in transgenic roots might be compensated by increased C catabolism through the oxPPP. In order to see the affect of HK and cTPI manipulation on N assimilation, the transgenic roots were grown on media with low or high concentration of ammonium nitrate as the N source. The specific activity of the oxPPP enzymes glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH) were both increased by an increased N supply in HK and cTPI transgenic roots. This is consistent with the provision of reducing equivalents for N assimilation. The data also show that the capacity of the oxPPP is higher in roots with high HK or cTPI activity. We were able to detect higher HK specific activity in N deficient conditions. These data were complemented with measurements of amino acid pools in transgenic roots. No trend in amino acid pools was found in roots modified for HK activity. However, down regulation of cTPI led to higher Gln, Gln/Glu and Asn/Asp ratios, indicating higher assimilation of N. These results demonstrated the activation of N assimilation in cTPI antisense clones while the manipulation of HK is unlikely to affect the N assimilation.
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Etudes de cinétiques enzymatiques par polarisation dynamique nucléaire avec dissolution (D-DNP) : application à l'étape oxydative de la voie des pentoses phosphates (PPP) / Enzymatic kinetic studies by nuclear dynamic polarization with dissolution (D-DNP) : application to the oxidative step of the pentose phosphate pathway (PPP)Sadet, Aude 09 October 2017 (has links)
L'une des voies principales du métabolisme cellulaire est la voie des Pentoses Phosphates (PPP). Cette voie métabolique est composée de deux cascades enzymatiques, une voie oxydative et une voie non oxydative. La voie oxydative de la PPP produit un cofacteur, le NADPH, qui est responsable du processus de détoxification de la cellule par son activité réductrice et un précurseur de diverses biosynthèses comme la lipogenèse. Un dysfonctionnement des trois enzymes qui composent cette étape de la PPP peut engendrer la mort cellulaire. Grâce à une nouvelle technique, la Polarisation Dynamique Nucléaire suivie par Dissolution (D-DNP), qui permet d’obtenir un gain de sensibilité par un facteur > 10 000, la quantification des paramètres cinétique dans les conditions physiologiques in cell est possible.Dans ce travail de thèse, nous utilisons un nouveau modèle de quantification des paramètres cinétiques qui offre la possibilité d’étudier une cascade enzymatique composée de 3 enzymes par D-DNP. Grâce à ces expériences, la sélectivité de la première enzyme de la voie oxydative, la G6PD, pour l’un des deux anomères de glucose-6-phosphate, ainsi que le rôle antioxydant de la deuxième enzyme de la PPP, la 6PGL, ont été observés. Pour réaliser ces études, une méthode de synthèse et de purification des différents substrats de chaque enzyme a été développée. Le tout premier inhibiteur de la 6PGL a été testé. Des études préliminaires réalisées sur des Trypanosoma brucei, parasite responsable de la maladie du sommeil, indiquent que la pénétration du glucose dans les cellules est l'étape cinétiquement limitante pour sa conversion enzymatique. / The Pentose Phosphate Pathway (PPP) is one of the main pathways of cellular metabolism. This metabolic pathway is composed of two enzymatic cascades: one is an oxidative pathway, and the other is non-oxidative. The oxidative branch of PPP produces a cofactor, NADPH, which is responsible for the detoxification process of the cell due to its reducing activity, and is also a precursor of various biosynthesis such as lipogenesis. A dysfunction of one of the three enzymes that make up this step of PPP can lead to cell death. Thanks to a new method, Dissolution Dynamic Nuclear Polarization (D-DNP), which features a sensitivity gain by a factor 10,000 compared to standard liquid-state NMR, the quantification of kinetic parameters under physiological conditions, in cell, becomes possible.In this thesis, we add to the scientific library a new model of quantification of kinetic parameters, and the possibility of studying an enzymatic cascade composed of 3 enzymes by D-DNP measurements. Based on these experiments, the selectivity of the first enzyme in the oxidative pathway, G6PD, for one of the two glucose-6-phosphate anomers, was confirmed. The antioxidant role of the second PPP enzyme, 6PGL, was equally studied. To carry out these studies, a method of synthesis and purification of the different substrates of each enzyme has been developed. The very first inhibitor of 6PGL has also been tested. Preliminary experiments on Trypanosoma brucei, a parasite responsible for sleeping sickness, indicate that glucose penetration inside cells is the limiting kinetic step for its conversion.
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