Fischerella é um gênero cianobacteriano de ocorrência em diversos ambientes subaerofíticos que apresenta importância ecológica, evolutiva, biogeoquímica, biotecnológica e ecotoxicológica. O estudo de seu genoma pode levar a uma melhor compreensão de seu metabolismo secundário e de sua capacidade de produção de cianotoxinas e outras moléculas bioativas. A linhagem Fischerella CENA161, isolada de uma nascente de água na região de Piracicaba, foi identificada como produtora do peptídeo hepatotóxico microcistina. Este foi o primeiro relato da produção dessa toxina por esse gênero de cianobactéria. Dessa maneira, este trabalho teve como objetivo sequenciar o genoma da cianobactéria Fischerella CENA161 e realizar sua montagem e a anotação de genes envolvidos com seu metabolismo secundário. Para isso, a linhagem foi tratada com hipoclorito de sódio para remover as bactérias heterotróficas, com posterior esgotamento de pequenos fragmentos em placa de cultura sólida, de forma a isolar a linhagem. Foi realizada a extração de ácido desoxirribonucleico das células tratadas da CENA161 cultivadas em Erlenmeyers contendo meio de cultura líquido BG-110. Uma biblioteca genômica foi construída para o sequenciamento MiSeq e, então, foi realizada a montagem ab initio do genoma com as leituras obtidas. A anotação de genes foi realizada utilizando a ferramenta antiSMASH, para a predição de metabólitos secundários, e também foi realizado o alinhamento de sequências nucleotídicas já conhecidas de outras linhagens contra o genoma da CENA161, utilizando a ferramenta BLASTN. As moléculas bioativas produzidas pela linhagem foram investigadas através de bioensaios contra bactérias e fungo, e utilizando cromatografia líquida de alta pressão e espectrometria de massas. Os resultados mostraram que a linhagem CENA161 possui, em seu genoma, o agrupamento gênico de biossíntese da microcistina, apresentando os 10 genes descritos primeiramente (mcyA-mcyJ), e alta identidade de suas sequências com as sequências da linhagem Fischerella sp. PCC 9339, embora sua sintenia gênica esteja mais próxima à da linhagem Nostoc sp. 152. Ainda, foram anotados os agrupamentos gênicos de biossíntese de ambiguina (amb), apresentando 25 genes do total de 32 genes descritos para a linhagem Fischerella sp. UTEX 1903, com identidade mínima de 98 % entre as sequências nucleotídicas. Foram encontrados, também, seis genes do total de oito que formam o agrupamento de biossíntese de nostopeptolida (nos), descrito para Nostoc sp. GSV224, e com sintenia diferenciada para a linhagem CENA161. As análises químicas de espectrometria de massas mostraram a produção de sete variantes de microcistina (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MC-LAba e [D-Asp3]Mc-LL), essas duas últimas raramente descritas pela literatura. Os bioensaios mostraram bioatividade dos extratos intracelular polar e apolar contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris e Candida albicans. A coleta das frações do extrato apolar por cromatografia líquida revelou bioatividade em três diferentes tempos de aquisição. As frações coletadas do extrato polar evidenciaram o pico de microcistina, constatada a partir da linhagem CENA161 axênica, inclusive. Nossos resultados revelaram a presença de agrupamentos gênicos de síntese de moléculas bioativas e a habilidade da linhagem Fischerella sp. CENA161 em produzir diferentes substâncias bioativas, sintetizadas pela via ribossomal e não ribossomal, em condições axênicas. / Fischerella is a cyanobacterial genus that occurs in several subaerophytic environments and presents ecological, evolutive, biogeochemical, biotechnologic and ecotoxicologic importance. The study of the genome can leads to the better compreension about its metabolism and its ability to produce cyanotoxins and other bioactive molecules. The Fischerella sp. strain CENA161 was isolated from a spring water in Piracicaba, and it was identified microcystin peptide hepatotoxic producer. That was the first report about the production of the toxin by this cyanobacterial genus. The aim of this study was to sequence the genome of the cyanobacteria Fischerella sp. strain CENA161 and perform the assembly and annotation of the genes involved in its secondary metabolism. For this, the strain was previously treated with 0,5 % sodium hypochlorite to remove the heterothrophic bacteria, followed with exhaustion from the short filaments in Petri plates, searching isolate the strain. The deoxirribonucleic acid was extracted from the CENA161 cells cultivated in Erlenmeyers with BG-110 liquid media. The genomic library was performed by MiSeq sequencing, and the ab initio assembly was performed with the reads obtained from the sequencing. The gene annotation and prediction were performed with the antiSMASH tool, for the secondary metabolites screening, and the nucleotides sequences alignment was performed using known genes present in other cyanobacteria producers and the CENA161 genome, using the BLASTN tool. The bioactive compounds produced by the strain were investigated with bioassays against bacteria and fungi, and also using high performance liquid chromatography with mass spectrometry. The results revealed the Fischerella sp. strain CENA161 presents the microcystins gene cluster in its genome, with the ten genes that were described in the first time (mcyA-mcyJ), and showed high identity in your sequences with the Fischerella sp. PCC 9339 sequences, although the synteny is very close to Nostoc sp. strain 152 microcystin gene cluster. We also found the ambiguine gene cluster (amb), that showed 25 genes out of 32 genes of total from the Fischerella sp. strain UTEX 1903, with high identity (98 %) among the nucleotide sequences. We found six genes out of eight that compose the nostopeptolide gene cluster (nos) described for Nostoc sp. strain GSV224, but presenting differentiated synteny for the CENA161. The chemical analyses by mass spectrometry showed the production of seven microcystin variants (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MCLAba and [D-Asp3]Mc-LL), the last two ones being rarely described by literature. The bioassays showed bioactivity from the polar and nonpolar intracellular extracts against Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris and Candida albicans. The collect of the peaks from the nonpolar extract in HPLC revealed bioactivity in three different acquisition times. The peaks collected from the polar extract did not show bioactivity, but the running in HPLC showed the peak corresponding to microcystin, produced by axenic CENA161 strain. Our results revealed the presence of some gene clusters involved in the bioactive molecules synthesis and the ability for the Fischerella sp. strain CENA161 to produce different bioactive compounds, synthesized by ribosomal and nonribosomal pathway, in non-axenic and axenic condictions.

Fischerella é um gênero cianobacteriano de ocorrência em diversos ambientes subaerofíticos que apresenta importância ecológica, evolutiva, biogeoquímica, biotecnológica e ecotoxicológica. O estudo de seu genoma pode levar a uma melhor compreensão de seu metabolismo secundário e de sua capacidade de produção de cianotoxinas e outras moléculas bioativas. A linhagem Fischerella CENA161, isolada de uma nascente de água na região de Piracicaba, foi identificada como produtora do peptídeo hepatotóxico microcistina. Este foi o primeiro relato da produção dessa toxina por esse gênero de cianobactéria. Dessa maneira, este trabalho teve como objetivo sequenciar o genoma da cianobactéria Fischerella CENA161 e realizar sua montagem e a anotação de genes envolvidos com seu metabolismo secundário. Para isso, a linhagem foi tratada com hipoclorito de sódio para remover as bactérias heterotróficas, com posterior esgotamento de pequenos fragmentos em placa de cultura sólida, de forma a isolar a linhagem. Foi realizada a extração de ácido desoxirribonucleico das células tratadas da CENA161 cultivadas em Erlenmeyers contendo meio de cultura líquido BG-110. Uma biblioteca genômica foi construída para o sequenciamento MiSeq e, então, foi realizada a montagem ab initio do genoma com as leituras obtidas. A anotação de genes foi realizada utilizando a ferramenta antiSMASH, para a predição de metabólitos secundários, e também foi realizado o alinhamento de sequências nucleotídicas já conhecidas de outras linhagens contra o genoma da CENA161, utilizando a ferramenta BLASTN. As moléculas bioativas produzidas pela linhagem foram investigadas através de bioensaios contra bactérias e fungo, e utilizando cromatografia líquida de alta pressão e espectrometria de massas. Os resultados mostraram que a linhagem CENA161 possui, em seu genoma, o agrupamento gênico de biossíntese da microcistina, apresentando os 10 genes descritos primeiramente (mcyA-mcyJ), e alta identidade de suas sequências com as sequências da linhagem Fischerella sp. PCC 9339, embora sua sintenia gênica esteja mais próxima à da linhagem Nostoc sp. 152. Ainda, foram anotados os agrupamentos gênicos de biossíntese de ambiguina (amb), apresentando 25 genes do total de 32 genes descritos para a linhagem Fischerella sp. UTEX 1903, com identidade mínima de 98 % entre as sequências nucleotídicas. Foram encontrados, também, seis genes do total de oito que formam o agrupamento de biossíntese de nostopeptolida (nos), descrito para Nostoc sp. GSV224, e com sintenia diferenciada para a linhagem CENA161. As análises químicas de espectrometria de massas mostraram a produção de sete variantes de microcistina (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MC-LAba e [D-Asp3]Mc-LL), essas duas últimas raramente descritas pela literatura. Os bioensaios mostraram bioatividade dos extratos intracelular polar e apolar contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris e Candida albicans. A coleta das frações do extrato apolar por cromatografia líquida revelou bioatividade em três diferentes tempos de aquisição. As frações coletadas do extrato polar evidenciaram o pico de microcistina, constatada a partir da linhagem CENA161 axênica, inclusive. Nossos resultados revelaram a presença de agrupamentos gênicos de síntese de moléculas bioativas e a habilidade da linhagem Fischerella sp. CENA161 em produzir diferentes substâncias bioativas, sintetizadas pela via ribossomal e não ribossomal, em condições axênicas. / Fischerella is a cyanobacterial genus that occurs in several subaerophytic environments and presents ecological, evolutive, biogeochemical, biotechnologic and ecotoxicologic importance. The study of the genome can leads to the better compreension about its metabolism and its ability to produce cyanotoxins and other bioactive molecules. The Fischerella sp. strain CENA161 was isolated from a spring water in Piracicaba, and it was identified microcystin peptide hepatotoxic producer. That was the first report about the production of the toxin by this cyanobacterial genus. The aim of this study was to sequence the genome of the cyanobacteria Fischerella sp. strain CENA161 and perform the assembly and annotation of the genes involved in its secondary metabolism. For this, the strain was previously treated with 0,5 % sodium hypochlorite to remove the heterothrophic bacteria, followed with exhaustion from the short filaments in Petri plates, searching isolate the strain. The deoxirribonucleic acid was extracted from the CENA161 cells cultivated in Erlenmeyers with BG-110 liquid media. The genomic library was performed by MiSeq sequencing, and the ab initio assembly was performed with the reads obtained from the sequencing. The gene annotation and prediction were performed with the antiSMASH tool, for the secondary metabolites screening, and the nucleotides sequences alignment was performed using known genes present in other cyanobacteria producers and the CENA161 genome, using the BLASTN tool. The bioactive compounds produced by the strain were investigated with bioassays against bacteria and fungi, and also using high performance liquid chromatography with mass spectrometry. The results revealed the Fischerella sp. strain CENA161 presents the microcystins gene cluster in its genome, with the ten genes that were described in the first time (mcyA-mcyJ), and showed high identity in your sequences with the Fischerella sp. PCC 9339 sequences, although the synteny is very close to Nostoc sp. strain 152 microcystin gene cluster. We also found the ambiguine gene cluster (amb), that showed 25 genes out of 32 genes of total from the Fischerella sp. strain UTEX 1903, with high identity (98 %) among the nucleotide sequences. We found six genes out of eight that compose the nostopeptolide gene cluster (nos) described for Nostoc sp. strain GSV224, but presenting differentiated synteny for the CENA161. The chemical analyses by mass spectrometry showed the production of seven microcystin variants (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MCLAba and [D-Asp3]Mc-LL), the last two ones being rarely described by literature. The bioassays showed bioactivity from the polar and nonpolar intracellular extracts against Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris and Candida albicans. The collect of the peaks from the nonpolar extract in HPLC revealed bioactivity in three different acquisition times. The peaks collected from the polar extract did not show bioactivity, but the running in HPLC showed the peak corresponding to microcystin, produced by axenic CENA161 strain. Our results revealed the presence of some gene clusters involved in the bioactive molecules synthesis and the ability for the Fischerella sp. strain CENA161 to produce different bioactive compounds, synthesized by ribosomal and nonribosomal pathway, in non-axenic and axenic condictions.

Os microrganismos atraem considerável atenção por serem uma fonte de compostos biotecnológicos e farmacêuticos. Diversos produtos naturais peptídicos produzidos por fungos e bactérias são sintetizados por grandes enzimas, conhecidas como peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) e policetídeo sintase (PKS). A bioprospecção dos microrganismos isolados do solo de Terra Preta Antropogênica (TPA) da Amazônia Ocidental é de grande importância para o conhecimento deste bioma tropical. Este estudo correlacionou a presença de sideróforos e de compostos antimicrobianos produzidos pelos microrganismos isolados de TPA e dos solos adjacentes com a presença dos genes que codificam para NRPS e PKS. Linhagens bacterianas foram isoladas das amostras do solo coletadas de 10, 20 e 40 cm de profundidade. Os isolados foram cultivados em meio líquido específico por 2 dias a 28oC. Um total de 143 isolados foi testado para a atividade de sideróforo e para isso, as linhagens foram inoculadas em um meio com baixa concentração de ferro (MM9) contendo o complexo cromoazurol S-Fe3. Do total, 72 isolados apresentaram reação positiva para a produção de sideróforo. O DNA genômico dos isolados foi extraído e a amplificação por PCR foi realizada usando iniciadores específicos para NRPS e PKS. Os resultados mostraram que quinze isolados apresentaram o gene que codifica para NRPS, vinte isolados para PKS e somente dez isolados apresentaram ambos os genes. A presença de genes de NRPS e PKS em 31% dos isolados testados sugere que a produção dos sideróforos possa ocorrer pela via não ribossomal. Dois isolados foram selecionados para estudos de identificação e caracterização dos compostos. O isolado TP11 foi identificado como Pseudomonas putida através de seqüenciamento do 16S rRNA e apresentou resultado negativo para hidroxamato e catecol, sugerindo que o tipo de sideróforo não possui nenhum destes grupos funcionais. O isolado TP16 foi identificado como Pseudomonas putida e apresentou produção de sideróforo do tipo catecol e hidroxamato, sugerindo a produção de mais de um sideróforo. Além disso, esta linhagem produziu um composto antimicrobiano, com atividade de sideróforo identificado por espectrometria de massas como pseudomonina com massa molar de 330 Da. / Microorganisms have attracted considerable attention as a source for biotechnological and pharmaceutical agents. Several peptidic natural products synthesized by fungi and bacteria are assembled by large enzymes, referred as nonribosomal peptide synthetase (NRPS) and polyketide synthase (PKS). Bioprospection of microorganisms isolated from Anthropological Dark Earth soil of Brazilian Occidental Amazon is of great importance to the knowledge of this tropical biome. This study aimed to correlate the presence of siderophores and antimicrobial compounds produced by microorganisms isolated from Dark Earth and adjacent soils of Brazilian Amazon with the presence of genes encoding NRPS and PKS. Bacterial strains were isolated from soil samples collected at 10, 20 and 40 cm depth. The isolates were grown in specific liquid medium for 2 d at 28oC. A total of 143 isolates were screened for siderophore activity and for this, bacterial strains were inoculated on plates containing an iron-limited medium (MM9) amended with a chromeazurol S-Fe3 complex. From the total, seventy-two isolates showed positive reaction for siderophore production. Genomic DNA of the isolates was extracted and PCR amplification was carried out using specific primers for NRPS and PKS. The results showed that fifteen isolates presented NRPS, twenty isolates presented PKS and only ten isolates showed both genes. The presence of NRPS and PKS genes in 31% of the isolates tested suggests that production of siderophores may occur by a nonribosomal pathway. Two isolates were selected for further studies. Isolate TP11 was identified as Pseudomonas putida by 16S rDNA sequencing analysis and was negative for hydroxamate and catechol, suggesting that the siderophore type has no hydroxamate- or catechol-type functional groups. The isolate TP16 was identified as Pseudomonas putida and showed the production of catechol and hydroxamate siderophore-type, suggesting the production of more than one siderophore. In addition, this strain produced an antimicrobial compound, with siderophore activity identified through mass spectrometry as pseudomonine with a molar mass of 330 Da.

Os microrganismos atraem considerável atenção por serem uma fonte de compostos biotecnológicos e farmacêuticos. Diversos produtos naturais peptídicos produzidos por fungos e bactérias são sintetizados por grandes enzimas, conhecidas como peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) e policetídeo sintase (PKS). A bioprospecção dos microrganismos isolados do solo de Terra Preta Antropogênica (TPA) da Amazônia Ocidental é de grande importância para o conhecimento deste bioma tropical. Este estudo correlacionou a presença de sideróforos e de compostos antimicrobianos produzidos pelos microrganismos isolados de TPA e dos solos adjacentes com a presença dos genes que codificam para NRPS e PKS. Linhagens bacterianas foram isoladas das amostras do solo coletadas de 10, 20 e 40 cm de profundidade. Os isolados foram cultivados em meio líquido específico por 2 dias a 28oC. Um total de 143 isolados foi testado para a atividade de sideróforo e para isso, as linhagens foram inoculadas em um meio com baixa concentração de ferro (MM9) contendo o complexo cromoazurol S-Fe3. Do total, 72 isolados apresentaram reação positiva para a produção de sideróforo. O DNA genômico dos isolados foi extraído e a amplificação por PCR foi realizada usando iniciadores específicos para NRPS e PKS. Os resultados mostraram que quinze isolados apresentaram o gene que codifica para NRPS, vinte isolados para PKS e somente dez isolados apresentaram ambos os genes. A presença de genes de NRPS e PKS em 31% dos isolados testados sugere que a produção dos sideróforos possa ocorrer pela via não ribossomal. Dois isolados foram selecionados para estudos de identificação e caracterização dos compostos. O isolado TP11 foi identificado como Pseudomonas putida através de seqüenciamento do 16S rRNA e apresentou resultado negativo para hidroxamato e catecol, sugerindo que o tipo de sideróforo não possui nenhum destes grupos funcionais. O isolado TP16 foi identificado como Pseudomonas putida e apresentou produção de sideróforo do tipo catecol e hidroxamato, sugerindo a produção de mais de um sideróforo. Além disso, esta linhagem produziu um composto antimicrobiano, com atividade de sideróforo identificado por espectrometria de massas como pseudomonina com massa molar de 330 Da. / Microorganisms have attracted considerable attention as a source for biotechnological and pharmaceutical agents. Several peptidic natural products synthesized by fungi and bacteria are assembled by large enzymes, referred as nonribosomal peptide synthetase (NRPS) and polyketide synthase (PKS). Bioprospection of microorganisms isolated from Anthropological Dark Earth soil of Brazilian Occidental Amazon is of great importance to the knowledge of this tropical biome. This study aimed to correlate the presence of siderophores and antimicrobial compounds produced by microorganisms isolated from Dark Earth and adjacent soils of Brazilian Amazon with the presence of genes encoding NRPS and PKS. Bacterial strains were isolated from soil samples collected at 10, 20 and 40 cm depth. The isolates were grown in specific liquid medium for 2 d at 28oC. A total of 143 isolates were screened for siderophore activity and for this, bacterial strains were inoculated on plates containing an iron-limited medium (MM9) amended with a chromeazurol S-Fe3 complex. From the total, seventy-two isolates showed positive reaction for siderophore production. Genomic DNA of the isolates was extracted and PCR amplification was carried out using specific primers for NRPS and PKS. The results showed that fifteen isolates presented NRPS, twenty isolates presented PKS and only ten isolates showed both genes. The presence of NRPS and PKS genes in 31% of the isolates tested suggests that production of siderophores may occur by a nonribosomal pathway. Two isolates were selected for further studies. Isolate TP11 was identified as Pseudomonas putida by 16S rDNA sequencing analysis and was negative for hydroxamate and catechol, suggesting that the siderophore type has no hydroxamate- or catechol-type functional groups. The isolate TP16 was identified as Pseudomonas putida and showed the production of catechol and hydroxamate siderophore-type, suggesting the production of more than one siderophore. In addition, this strain produced an antimicrobial compound, with siderophore activity identified through mass spectrometry as pseudomonine with a molar mass of 330 Da.