This thesis describes the use of phage display for the isolation of autoantigens in rheumatoid arthritis. The potential of the technology is demonstrated by the isolation of an autoantigen, eukaryotic translation elongation factor 1a1 (eEF 1 (x 1)) from a fibroblast cDNA library using rounds of selective enrichment with IgG from RA patients. Subsequently in order to isolate joint-specific antigens a phage-displayed cDNA library from rheumatoid pannus was generated and screened with analogous procedures. From the clones isolated, putative candidate autoantigens were identified. The presence of anti- eEF 1a1 autoantibodies in approximately 20% of patients with RA was confirmed and extended in larger panels of sera, and the finding of anti-eEF la1 shown to be relatively specific for RA. In contrast autoantibodies to the activation-induced negative regulator of T cells, CTLA-4 were not found in contrast to a previous report. The relevance of these findings for the use of antibodies in the diagnosis and prediction of disease characteristics in RA are discussed.

The primary goal of this research is to engineer solutions facilitating the utilization of bacteriophages as naturally occurring bactericidal agents for combatting multidrug-resistant (MDR) bacterial infections. Bacteriophages, which are bacterial viruses, represent self-replicating antibacterial agents known for their remarkable specificity in targeting bacterial cells. This specificity stands in sharp contrast to the indiscriminate and broad-spectrum actions of many currently employed antimicrobials across various sectors. Specificity of bacteriophages is a double-sided sword, often requiring large-scale phage hunting and phage biobank screening. This, combined with the lack of a global phage biobank can significantly limit access to phage therapeutics. I have developed a rapid, high-throughput platform focused on the detection of phage-mediated adenosine triphosphate (ATP) release via enzymatic ATP bioluminescence assay to identify highly lytic phages targeting MDR bacterial pathogens. I also used pullulan-trehalose sugar mixture to stabilize the ATP bioluminescence assay components at physiological temperatures. The sugar mixture also enhanced the desiccation tolerance of the ATP assay components along with phage, enabling the creation of all-inclusive shelf-stable tablets. The resulting tablets proved effectiveness and reliability in tracking phage-mediated bacterial cell lysis, and the pullulan-trehalose encapsulation significantly enhanced both the signal and desiccation tolerance of the phage and assay components. Next, I developed a bi-functional phage delivering nanoclay-based injectable hydrogel that can serve as both antibacterial and osteoinductive therapeutic hydrogel for treating bone and implant associated infections. The in vitro results for phage-loaded injectable hydrogels confirmed strong antimicrobial action against bacterial biofilms, in both biofilm prevention and biofilm dispersion challenges. Continuing the phage biomaterials research, I also co-developed a combination of phage-collagen conjugated liquid infused coating on titanium implant that enhanced osteointegration and was remarkably effective against implant-associated infections as a prophylactic measure in vivo. Lastly, and as a proof of the utility of phage biocontrol beyond biomedical applications, I demonstrated biofilm removal and full signal regeneration for dissolved oxygen (DO) sensors using a phage cocktail. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / Antibiotic resistance is rapidly spreading worldwide, leading to a substantial loss of lives each year and imposing a significant economic burden. Bacteriophages, natural bactericidal viruses, are emerging as a promising solution due to their unique properties. This thesis focuses on the practical implementation of bacteriophages to address real-world challenges linked to antibiotic resistance. I worked on facilitating the process of selecting phages for personalized phage therapy through detecting phage-mediated release of bacteria encoded biomolecules. I also developed phage-loaded injectable hydrogels and phage-conjugated liquid infused coatings to combat bone and implant-related infections. Moreover, I have shown the promise of phage biocontrol beyond biomedical application by demonstrating its effectiveness in restoring a heavily biofouled sensor used for measuring dissolved oxygen, a critical water quality indicator.

The escalating threat of antimicrobial resistance has intensified the exploration of alternative treatments, with bacteriophage (phage) therapy emerging as a potential substitute for antibiotics. While strictly lytic phages rapidly kill bacteria, temperate phages can also go dormant in their hosts. Accordingly, despite their prevalence, they are considered unsuitable for therapy. My systematic review of phage therapy in urinary tract infections (UTIs) highlighted this. This review motivated me to explore how the potential of these phages could be leveraged. Chapter 3 introduces a novel strategy to do so, exploring whether the fluoroquinolone antibiotic ciprofloxacin could synergize with temperate phages. This innovative strategy exploits the ability of the antibiotic to awaken dormant temperate phages, driving a potent synergy (≥8 log reduction) able to result in bacterial eradication. This is a potential breakthrough in the use of phages. Chapter 4 expands on this finding, establishing that a synergy exists across various drug classes with diverse mechanisms of action. Surprisingly, the synergy extends beyond antibiotics triggering the bacterial SOS-response known to wake temperate phages and also includes protein synthesis inhibitors, offering a new approach to influence the phage lysis-lysogeny decision. Chapter 5 explores the identified synergy in antibiotic-resistant models, focusing on the impact of antibiotic resistance on the effect of combining temperate phages with antibiotics. While the majority of cases demonstrated synergy comparable to the absence of antibiotic resistance, an exception was noted in the acetylation-resistant models for both gentamicin and ciprofloxacin. These resistance genes abolished synergy with the temperate phage, emphasizing the importance of the resistance mechanism within temperate phage antibiotic synergy (tPAS). In conclusion, this thesis underscores the lack of interest in temperate phages for therapy and demonstrates a scalable strategy to overcome the major barriers to their use. I uncover the mechanisms underlying the synergy and show that these concepts are applicable even in the context of resistance to the synergizing antibiotic. These findings propose a remarkable shift in how antimicrobial therapy approaches are viewed. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / In the past decade, interest in viruses that only target bacteria (called “phages”) and their capacity to treat antibiotic-resistant infections has surged. Beginning with our systematic review on UTI treatments involving phages, we observed that none of the included studies explored the therapeutic use of the dormancy-capable “temperate” phages. This finding serves as motivation for the subsequent chapters of the thesis. In Chapter 3 I discovered temperate phage-antibiotic synergy (tPAS). An inventive strategy involving antibiotics activates temperate phages, demonstrating substantial synergy in eliminating bacterial infections and offering a potential breakthrough against antimicrobial resistance. In Chapter 4 I found that this synergy extends beyond antibiotics that result in a response to DNA damage within the bacteria (SOS response) to include protein synthesis inhibitors, providing an innovative approach to combat bacterial infections. Finally, in Chapter 5 I extended the study to antibiotic-resistant models. Across a wide array of mechanisms for antibiotic resistance, all but two supported the synergy we observed with temperate phage. This highlights the importance of the resistance mechanism in temperate phage antibiotic synergy (tPAS). The finding of this thesis paves the route for potentially integrating temperate phages into mainstream medical practices alongside antibiotic interventions.

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L'objectif de ce travail est d'introduire, par ingénierie génétique, un site allostérique dans une enzyme pour moduler son activité catalytique par la liaison d'un ligand choisi. Ces enzymes pourraient servir de senseurs moléculaires pour la détection, voire le dosage du ligand. Nous avons décidé de créer ces sites allostériques dans la beta-lactamase TEM-1 d'E. coli, une enzyme dégradant les antibiotiques de type pénicilline, en réalisant l'ingénierie de trois boucles de l'enzyme. Celles-ci sont proches l'une de l'autre dans l'espace et pourraient servir d'épitope discontinu pour la reconnaissance par un anticorps ou de paratope, à savoir le site de liaison d'un anticorps, pour la reconnaissance d'autres protéines ou de petites molécules. Notre hypothèse de travail est que ces beta-lactamases chimériques partageront certaines similitudes avec les anticorps de camélidés dont le site de reconnaissance n'est constitué que de trois boucles. Comme nous ne savions pas a priori quelles sont les séquences à introduire pour lier la molécule cible, nous avons introduit des séquences dégénérées pour créer une grande banque de mutants et sélectionner dans cette banque les clones ayant une affinité pour le ligand d'intérêt. La partie la plus difficile de ce projet fut la création de la collection d'enzymes mutantes contenant trois boucles dégénérées. La dégénérescence de la boucle 1, située à proximité du site actif, a été réalisée en remplaçant aléatoirement trois résidus. Dans la boucle 2, un peptide aléatoire de cinq, six ou sept résidus a été inséré entre deux cystéines et dans la boucle 3, une insertion de six résidus aléatoires a été réalisée. En pratique, l'ingénierie des boucles 1 et 2 a été effectuée dans la même construction pour créer trois banques (trois tailles d'insert différentes dans la boucle 2). D'autre part, nous disposions déjà de la banque contenant l'insertion dans la boucle 3. Ces banques de première génération ont ensuite subit une sélection in vivo pour ne garder que les clones possédant une certaine activité catalytique, par culture des bactéries infectées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Cette étape nous a permis d'avoir un contrôle sur la qualité des banques créées car tous les mutants d'insertions retenus ont obligatoirement une structure tertiaire. Nous avons également montré que la présence de deux résidus cystéines est nécessaire de part et d'autre de l'insert dans la boucle 2 pour maintenir une certaine activité enzymatique. D'autre part, la boucle 1 ne semble pas tolérer d'insertion peptidique et ne permet que la mutagenèse par remplacement. Les banques de première génération ont ensuite été combinées pour créer une banque de seconde génération contenant les trois boucles dégénérées. Cette construction hiérarchisée a permis, avec un bon rendement, la création d'une banque combinatoire de grande taille et de bonne qualité. Grâce à la technique d'expression en surface de phage, cette banque a ensuite été soumise à une sélection in vitro afin d'isoler les clones ayant acquis de l'affinité pour des molécules cibles. Ces ligands sont un ion métallique, le Ni(II), et deux petites molécules organiques, la kanamycine et la sulfanilamide, pour lesquelles une protéine liante serait intéressante comme outil de détection. En ce qui concerne les clones sélectionnés avec le nickel, tous les clones testés contiennent des résidus histidine et montrent une modulation de l'activité en présence du métal, que ce soit une activation ou une inhibition de celle-ci. La meilleure activation a été obtenue pour le clone Ni-5-Amp20-#11, qui voit son activité doublée lorsqu'il est complexé au nickel, tandis que la meilleure inhibition a été obtenue pour le clone Ni-5-#2 avec une diminution de 77 % de l'activité. Quant à la meilleure affinité, elle a été obtenue pour le clone Ni-5-#12 avec une constante de dissociation de 7.10-5 M. Les autres valeurs de Kd varient entre 10-4 M et 10-3 M. Parmi les clones issus de la sélection avec la kanamycine, nous avons trouvé un mutant dont l'activité catalytique est augmentée de 44 % en présence du ligand. Sa constante de dissociation est de 6,6.10-4 M. Quant à la sélection avec la sulfanilamide, elle ne nous a pas permis à ce jour d'isoler des clones ayant acquis une affinité détectable pour cette molécule. Ces résultats nous laissent espérer que la banque construite contient potentiellement des clones ayant la capacité de lier une variété de cibles différentes. Si c'est le cas, ces enzymes chimériques possèdent des avantages sur les anticorps conjugués habituellement utilisés en immuno-détection, car la fonction de reconnaissance et la fonction enzymatique sont portées par la même molécule. Ces protéines pourraient donc être produites facilement et à plus faible coût. De plus, la modulation d'activité permet en principe de détecter la présence du ligand cible en phase homogène.

L'objectif de ce travail est d'introduire, par ingénierie génétique, un site allostérique dans une enzyme pour moduler son activité catalytique par la liaison d'un ligand choisi. Ces enzymes pourraient servir de senseurs moléculaires pour la détection, voire le dosage du ligand. Nous avons décidé de créer ces sites allostériques dans la beta-lactamase TEM-1 d'E. coli, une enzyme dégradant les antibiotiques de type pénicilline, en réalisant l'ingénierie de trois boucles de l'enzyme. Celles-ci sont proches l'une de l'autre dans l'espace et pourraient servir d'épitope discontinu pour la reconnaissance par un anticorps ou de paratope, à savoir le site de liaison d'un anticorps, pour la reconnaissance d'autres protéines ou de petites molécules. Notre hypothèse de travail est que ces beta-lactamases chimériques partageront certaines similitudes avec les anticorps de camélidés dont le site de reconnaissance n'est constitué que de trois boucles. Comme nous ne savions pas a priori quelles sont les séquences à introduire pour lier la molécule cible, nous avons introduit des séquences dégénérées pour créer une grande banque de mutants et sélectionner dans cette banque les clones ayant une affinité pour le ligand d'intérêt. La partie la plus difficile de ce projet fut la création de la collection d'enzymes mutantes contenant trois boucles dégénérées. La dégénérescence de la boucle 1, située à proximité du site actif, a été réalisée en remplaçant aléatoirement trois résidus. Dans la boucle 2, un peptide aléatoire de cinq, six ou sept résidus a été inséré entre deux cystéines et dans la boucle 3, une insertion de six résidus aléatoires a été réalisée. En pratique, l'ingénierie des boucles 1 et 2 a été effectuée dans la même construction pour créer trois banques (trois tailles d'insert différentes dans la boucle 2). D'autre part, nous disposions déjà de la banque contenant l'insertion dans la boucle 3. Ces banques de première génération ont ensuite subit une sélection in vivo pour ne garder que les clones possédant une certaine activité catalytique, par culture des bactéries infectées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Cette étape nous a permis d'avoir un contrôle sur la qualité des banques créées car tous les mutants d'insertions retenus ont obligatoirement une structure tertiaire. Nous avons également montré que la présence de deux résidus cystéines est nécessaire de part et d'autre de l'insert dans la boucle 2 pour maintenir une certaine activité enzymatique. D'autre part, la boucle 1 ne semble pas tolérer d'insertion peptidique et ne permet que la mutagenèse par remplacement. Les banques de première génération ont ensuite été combinées pour créer une banque de seconde génération contenant les trois boucles dégénérées. Cette construction hiérarchisée a permis, avec un bon rendement, la création d'une banque combinatoire de grande taille et de bonne qualité. Grâce à la technique d'expression en surface de phage, cette banque a ensuite été soumise à une sélection in vitro afin d'isoler les clones ayant acquis de l'affinité pour des molécules cibles. Ces ligands sont un ion métallique, le Ni(II), et deux petites molécules organiques, la kanamycine et la sulfanilamide, pour lesquelles une protéine liante serait intéressante comme outil de détection. En ce qui concerne les clones sélectionnés avec le nickel, tous les clones testés contiennent des résidus histidine et montrent une modulation de l'activité en présence du métal, que ce soit une activation ou une inhibition de celle-ci. La meilleure activation a été obtenue pour le clone Ni-5-Amp20-#11, qui voit son activité doublée lorsqu'il est complexé au nickel, tandis que la meilleure inhibition a été obtenue pour le clone Ni-5-#2 avec une diminution de 77 % de l'activité. Quant à la meilleure affinité, elle a été obtenue pour le clone Ni-5-#12 avec une constante de dissociation de 7.10-5 M. Les autres valeurs de Kd varient entre 10-4 M et 10-3 M. Parmi les clones issus de la sélection avec la kanamycine, nous avons trouvé un mutant dont l'activité catalytique est augmentée de 44 % en présence du ligand. Sa constante de dissociation est de 6,6.10-4 M. Quant à la sélection avec la sulfanilamide, elle ne nous a pas permis à ce jour d'isoler des clones ayant acquis une affinité détectable pour cette molécule. Ces résultats nous laissent espérer que la banque construite contient potentiellement des clones ayant la capacité de lier une variété de cibles différentes. Si c'est le cas, ces enzymes chimériques possèdent des avantages sur les anticorps conjugués habituellement utilisés en immuno-détection, car la fonction de reconnaissance et la fonction enzymatique sont portées par la même molécule. Ces protéines pourraient donc être produites facilement et à plus faible coût. De plus, la modulation d'activité permet en principe de détecter la présence du ligand cible en phase homogène.

Piscine nodaviruses are members of genus Betanodavirus, which infects a large number of species of fish and causes massive mortality in larvae and juveniles. The disease causes great economic losses in aquaculture and sea-ranching. Virus-like particles (VLPs) of dragon grouper nervous necrosis virus (DGNNV) were employed to screen the consensus sequences of paratopes by the phage display peptide technology. Using two biopanning methods to screen phages, their binding efficiency was examined by ELISA. The effects of treatment by different blocking buffers on the ELISA assays and the effects of the ELISA plates exposed to UV light were tested. The display phages with high binding efficiency were sequenced after the inserted fragment by PCR amplification. With NCBI BLAST, they were closely related to the claudin family and the consensus sequences were on the region of EL1 or EL2. Few non-claudin sequences demand further comparison with other kinds of receptors to ascertain the characters of these sequences.

The fate of phage-infected bacteria is determined by the holin, a small membrane protein that triggers disruption of the membrane at a programmed time, allowing a lysozyme to attack the cell wall. S2168, the holin of phage 21, has two transmembrane domains (TMDs) with a predicted N-in, C-in topology. Surprisingly, TMD1 of S2168 was found to be dispensable for function, to behave as a SAR ("signal-anchor-release") domain in exiting the membrane to the periplasm, and to engage in homotypic interactions in the soluble phase. The departure of TMD1 from the bilayer coincides with the lethal triggering of the holin and is accelerated by membrane depolarization. Basic residues added at the N-terminus of S2168 prevent the escape of TMD1 to the periplasm and block hole formation by TMD2. Lysis thus depends on dynamic topology, in that removal of the inhibitory TMD1 from the bilayer frees TMD2 for programmed formation of lethal membrane lesions. Like the holin S of λ, the holin of lambdoid phage 21 (S21) controls lysis by forming holes in the membrane. However, unlike Sλ, these holes are small, serving only to depolarize the membrane facilitating the release and activation of the SAR endolysin, R21. We were able to demonstrate that, unlike Sλ, S2168 forms a “pinhole”, thus macromolecules easily pass through Sλ but not S21 holes. This result again supports our interpretation: when S21 triggers, it only needs to collapse the membrane potential, thus causing release and activation of the membrane-tethered inactive SAR endolysin, but does not form holes in the membrane large enough to allow passage of a pre-folded, active cytoplasmic endolysin. The lysis defective S2168 mutant alleles were isolated throughout the S21 gene. Although the majority of lysis defective mutations occurred in the codons for the TMD2 domain, two mutations were found in the codons for the TMD1. This result suggests that only the TMD2 domain of S2168 is likely to participate in actual hole formation. One can assume that two mutant alleles of TMD1 are involved in two different interactions: (a) TMD1-TMD1 intermolecular interaction, (b) TMD1-TMD2 intramolecular interaction. We showed that there is a specific TMD1-TMD2 interaction. In terms of TMD1-TMD2 interaction, the mutated residues of the two TMD1 mutants might prevent a departure of TMD1 from TMD2, resulting in the lysis defective phenotype. Hopefully, these findings deliver some hints about the mechanism of S2168 hole formation and further provoke more extensive work which is required to provide a definite answer to many questions regarding this matter.