Fatores de transcrição WRKY de soja têm sido identificados e relacionados em resposta a estresses bióticos e abióticos. No entanto, em estudos anteriores, a família WRKY estava subestimada. Recentemente, o envolvimento dos genes WRKY em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador de uma importante doença da soja, a Ferrugem Asiática, foi sugerido a partir de análise de dados de expressão gênica global. No presente estudo, a anotação completa da família WRKY de soja e a análise funcional de genes envolvidos na resposta à infecção por P. pachyrhizi foram realizada. A partir de buscas em bancos de dados do genoma da soja, genes WRKY foram anotados e aqueles envolvidos na resposta a P. pachyrhizi foram identificados usando quatro experimentos de expressão gênica global: superSAGE, RNA-Seq de lesões microdissecadas e dois microarranjos. O padrão de expressão gênica foi confirmado por RT-qPCR para oito genes. Embriões somáticos de soja foram transformados, visando a superexpressão ou silenciamento gênico, e plantas transgênicas foram desafiadas com P. pachyrhizi. Cento e setenta e oito genes WRKY foram anotados e 74 identificados como diferencialmente expressos durante a infecção pelo fungo. Em resposta a P. pachyrhizi, oito genes apresentaram expressão mais inicial e⁄ou mais forte no genótipo resistente quando comparado com o suscetível. Todos os oito genes analisados mostraram o pico de expressão nas primeiras 24 horas após a inoculação. Comparando a mineração de dados em resposta à infecção por P. pachyrhizi com o resultado do cladograma, um padrão de expressão similar pode ser observado em genes relacionados. Plantas superexpressando Glyma15g00570 não foram recuperadas. Provavelmente a expressão constitutiva deste gene afeta a regeneração das plantas. A participação de quatro genes homólogos em resposta ao patógeno foi demonstrada usando a técnica de RNAi. Quando infectada por P. pachyrhizi, folhas da linhagem silenciada mostraram maior número de lesões do que plantas não-transformadas. Em conclusão, neste trabalho a família WRKY de soja completa foi anotada e a participação de alguns membros em resposta a P. pachyrhizi foi demonstrada. / Soybean WRKY transcription factors have been identified and related with the response to biotic and abiotic stresses. However the soybean WRKY family was underrepresented in previous studies. Recently, the involvement of WRKY genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of an important soybean disease - Asian Soybean Rust (ASR)- has been suggested by the analyses of global geneexpression data. In the present study a genome-wide annotation of soybean WRKY family and the functional analyzes of genes involved in response to P. pachyrhizi were performed. Following a search in the soybean genomic databases, WRKY-encoding genes were annotated and those involved in response to P. pachyrhizi were identified using global gene-expression experiments: superSAGE, RNA-Seq of microdissected lesions and two microarrays. Gene expression pattern was validated by RT-qPCR. Soybean somatic embryos were transformed aiming WRKY overexpression or silencing, and transgenic plants were challenged with P. pachyrhizi. One hundred-seventy-eight WRKY genes were annotated and 74 identified as differentially expressed during fungus infection. In response to P. pachyrhizi, eight genes were expressed earlier and⁄or stronger in a resistant genotype when compared to a susceptible one. All the eight analyzed genes showed the expression peak at the first 24 hours after inoculation. By comparing data mining in response to P. pachyrhizi infection with the clustering result, similar expression pattern could be observed in closely related genes. Plants overexpressing Glyma15g00570 were not recovered. Probably the constitutive overexpression of the gene may affect the regeneration of plants. The participation of four homologous genes in response to pathogen was demonstrated using RNAi approach. When infected by P. pachyrhizi, leaves of silenced transgenic line showed higher number of lesions than wild-type plants. In conclusion, the complete soybean WRKY family was annotated and the participation of some members in response to P. pachyrhizi was demonstrated.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

Fatores de transcrição WRKY de soja têm sido identificados e relacionados em resposta a estresses bióticos e abióticos. No entanto, em estudos anteriores, a família WRKY estava subestimada. Recentemente, o envolvimento dos genes WRKY em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador de uma importante doença da soja, a Ferrugem Asiática, foi sugerido a partir de análise de dados de expressão gênica global. No presente estudo, a anotação completa da família WRKY de soja e a análise funcional de genes envolvidos na resposta à infecção por P. pachyrhizi foram realizada. A partir de buscas em bancos de dados do genoma da soja, genes WRKY foram anotados e aqueles envolvidos na resposta a P. pachyrhizi foram identificados usando quatro experimentos de expressão gênica global: superSAGE, RNA-Seq de lesões microdissecadas e dois microarranjos. O padrão de expressão gênica foi confirmado por RT-qPCR para oito genes. Embriões somáticos de soja foram transformados, visando a superexpressão ou silenciamento gênico, e plantas transgênicas foram desafiadas com P. pachyrhizi. Cento e setenta e oito genes WRKY foram anotados e 74 identificados como diferencialmente expressos durante a infecção pelo fungo. Em resposta a P. pachyrhizi, oito genes apresentaram expressão mais inicial e⁄ou mais forte no genótipo resistente quando comparado com o suscetível. Todos os oito genes analisados mostraram o pico de expressão nas primeiras 24 horas após a inoculação. Comparando a mineração de dados em resposta à infecção por P. pachyrhizi com o resultado do cladograma, um padrão de expressão similar pode ser observado em genes relacionados. Plantas superexpressando Glyma15g00570 não foram recuperadas. Provavelmente a expressão constitutiva deste gene afeta a regeneração das plantas. A participação de quatro genes homólogos em resposta ao patógeno foi demonstrada usando a técnica de RNAi. Quando infectada por P. pachyrhizi, folhas da linhagem silenciada mostraram maior número de lesões do que plantas não-transformadas. Em conclusão, neste trabalho a família WRKY de soja completa foi anotada e a participação de alguns membros em resposta a P. pachyrhizi foi demonstrada. / Soybean WRKY transcription factors have been identified and related with the response to biotic and abiotic stresses. However the soybean WRKY family was underrepresented in previous studies. Recently, the involvement of WRKY genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of an important soybean disease - Asian Soybean Rust (ASR)- has been suggested by the analyses of global geneexpression data. In the present study a genome-wide annotation of soybean WRKY family and the functional analyzes of genes involved in response to P. pachyrhizi were performed. Following a search in the soybean genomic databases, WRKY-encoding genes were annotated and those involved in response to P. pachyrhizi were identified using global gene-expression experiments: superSAGE, RNA-Seq of microdissected lesions and two microarrays. Gene expression pattern was validated by RT-qPCR. Soybean somatic embryos were transformed aiming WRKY overexpression or silencing, and transgenic plants were challenged with P. pachyrhizi. One hundred-seventy-eight WRKY genes were annotated and 74 identified as differentially expressed during fungus infection. In response to P. pachyrhizi, eight genes were expressed earlier and⁄or stronger in a resistant genotype when compared to a susceptible one. All the eight analyzed genes showed the expression peak at the first 24 hours after inoculation. By comparing data mining in response to P. pachyrhizi infection with the clustering result, similar expression pattern could be observed in closely related genes. Plants overexpressing Glyma15g00570 were not recovered. Probably the constitutive overexpression of the gene may affect the regeneration of plants. The participation of four homologous genes in response to pathogen was demonstrated using RNAi approach. When infected by P. pachyrhizi, leaves of silenced transgenic line showed higher number of lesions than wild-type plants. In conclusion, the complete soybean WRKY family was annotated and the participation of some members in response to P. pachyrhizi was demonstrated.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. / Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

Fatores de transcrição WRKY de soja têm sido identificados e relacionados em resposta a estresses bióticos e abióticos. No entanto, em estudos anteriores, a família WRKY estava subestimada. Recentemente, o envolvimento dos genes WRKY em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador de uma importante doença da soja, a Ferrugem Asiática, foi sugerido a partir de análise de dados de expressão gênica global. No presente estudo, a anotação completa da família WRKY de soja e a análise funcional de genes envolvidos na resposta à infecção por P. pachyrhizi foram realizada. A partir de buscas em bancos de dados do genoma da soja, genes WRKY foram anotados e aqueles envolvidos na resposta a P. pachyrhizi foram identificados usando quatro experimentos de expressão gênica global: superSAGE, RNA-Seq de lesões microdissecadas e dois microarranjos. O padrão de expressão gênica foi confirmado por RT-qPCR para oito genes. Embriões somáticos de soja foram transformados, visando a superexpressão ou silenciamento gênico, e plantas transgênicas foram desafiadas com P. pachyrhizi. Cento e setenta e oito genes WRKY foram anotados e 74 identificados como diferencialmente expressos durante a infecção pelo fungo. Em resposta a P. pachyrhizi, oito genes apresentaram expressão mais inicial e⁄ou mais forte no genótipo resistente quando comparado com o suscetível. Todos os oito genes analisados mostraram o pico de expressão nas primeiras 24 horas após a inoculação. Comparando a mineração de dados em resposta à infecção por P. pachyrhizi com o resultado do cladograma, um padrão de expressão similar pode ser observado em genes relacionados. Plantas superexpressando Glyma15g00570 não foram recuperadas. Provavelmente a expressão constitutiva deste gene afeta a regeneração das plantas. A participação de quatro genes homólogos em resposta ao patógeno foi demonstrada usando a técnica de RNAi. Quando infectada por P. pachyrhizi, folhas da linhagem silenciada mostraram maior número de lesões do que plantas não-transformadas. Em conclusão, neste trabalho a família WRKY de soja completa foi anotada e a participação de alguns membros em resposta a P. pachyrhizi foi demonstrada. / Soybean WRKY transcription factors have been identified and related with the response to biotic and abiotic stresses. However the soybean WRKY family was underrepresented in previous studies. Recently, the involvement of WRKY genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of an important soybean disease - Asian Soybean Rust (ASR)- has been suggested by the analyses of global geneexpression data. In the present study a genome-wide annotation of soybean WRKY family and the functional analyzes of genes involved in response to P. pachyrhizi were performed. Following a search in the soybean genomic databases, WRKY-encoding genes were annotated and those involved in response to P. pachyrhizi were identified using global gene-expression experiments: superSAGE, RNA-Seq of microdissected lesions and two microarrays. Gene expression pattern was validated by RT-qPCR. Soybean somatic embryos were transformed aiming WRKY overexpression or silencing, and transgenic plants were challenged with P. pachyrhizi. One hundred-seventy-eight WRKY genes were annotated and 74 identified as differentially expressed during fungus infection. In response to P. pachyrhizi, eight genes were expressed earlier and⁄or stronger in a resistant genotype when compared to a susceptible one. All the eight analyzed genes showed the expression peak at the first 24 hours after inoculation. By comparing data mining in response to P. pachyrhizi infection with the clustering result, similar expression pattern could be observed in closely related genes. Plants overexpressing Glyma15g00570 were not recovered. Probably the constitutive overexpression of the gene may affect the regeneration of plants. The participation of four homologous genes in response to pathogen was demonstrated using RNAi approach. When infected by P. pachyrhizi, leaves of silenced transgenic line showed higher number of lesions than wild-type plants. In conclusion, the complete soybean WRKY family was annotated and the participation of some members in response to P. pachyrhizi was demonstrated.