The trafficking of insulin secretory granules(SGs) of pancreatic b-cells is a tightly controlled complex network. Increasing evidence indicates that the cortical actin cytoskeleton modulates the mobility and exocytosis of SGs,yet the mechanisms anchoring SGs to the cytoskeleton is not completely understood.It has been shown by Ort et al.(2000,2001) that the cytoplasmic tail of an intrinsic membrane protein of the SGs named ICA512/IA-2 binds the PDZ domain of b2-syntrophin,which in turn binds to the F-actin-binding protein utrophin. These data also indicate that stimulation of SG exocytosis affects the phosphorylation of b2-syntrophin,hence altering its binding to ICA512.Therefore a model was proposed whereby SGs are anchored to the actin cytoskeleton through the ICA512/b2-syntrophin complex, whose dynamics are regulated by phosphorylation.To test this model GFP-b2-syntrophin stable INS-1 cell clones were generated.GFP-b2-syntrophin expression and localization pattern were similar to those of the endogenous protein. Electron microscopy showed that in GFP-b2-syntrophin INS-1 cells the number of SGs with a pear-like shape was increased relative to control cells. Insulin content and stimulated secretion were increased in three GFP-â2-syntrophin INS-1 cell clones,compared to non-transfected INS-1 cells and INS-1 cells expressing GFP. These increments correlated with the different expression levels of GFP-b2-syntrophin in the three GFP-b2-syntrophin INS-1 cell clones. These findings support the hypothesis that b2-syntrophin regulates the trafficking and exocytosis of SGs by modulating their tethering to the actin cytoskeleton.In order to confirm the proposed model, the phosphorylation of b2-syntrophin was investigated in more detail. Similar to endogenous b2-syntrophin,GFP-b2-syntrophin underwent Ca2+-dependent and okadaic acid-sensitive dephosphorylation upon stimulation of insulin secretion. Stimulation-dependent dephosphorylation was confirmed by immunoprecipitation of 32P-labeled GFP-b2-syntrophin.Mass spectrometry of immunoprecipitated GFP-b2-syntrophin allowed the identification of four serine-phosphorylation sites (S75,S90,S213,S373) that could affect the binding to ICA512.Mutants,in which all four phosphoserines, were replaced by either asp or ala to mimic(S/D) or prevent(S/A) phosphorylation were expressed in INS-1 cells. All S/D mutants retained a cortical localization,but by immunoblotting the pattern of the S75D allele differed from wild type and all other S/D alleles.Conversely, all S/A alleles were diffused cytosolically, except S213A,which was still restricted to the cortex. Finally, pull down assays showed increased binding of ICA512 to the S75A and S90D alleles compared to wild type b2-syntrophin,while the opposite was observed with the S75D and S90A mutants.Additionally,both the S75 and the S213 allele conform a consensus for phosphorylation by Cdk5,which is known to modulate insulin secretion. The phosphorylation of GFP-b2-syntrophin and particularly the S75 allele by Cdk5 was exhibited with pharmacological inhibitors,by in vitro phosphorylation and by RNAi. Taken together, these findings are consistent with the model by which phosphorylation of b2-syntrophin modulates the tethering of SGs to the cytoskeleton, and thereby their mobility and exocytosis. Specifically, the data of this thesis suggest that Cdk5-dependent phosphorylation of the S75 site of GFP-b2-syntrophin facilitates insulin secretion by reducing the interaction of b2-syntrophin with ICA512,thereby decreasing the actin cytoskeleton constrain on SG mobility. This process could occur in combination with the phosphatase-dependent dephosphorylation of b2-syntrophin at phosphosites other than S75. / Der Transport Insulin-gefüllter sekretorische Granula(SG) ist ein streng kontrollierter komplexer Prozess.Es gibt vermehrt Beweise,dass das kortikale Actinzytoskelett die Ausschüttung der SGs beeinflusst.Bisher ist der Mechanismus der Verankerung von SGs am Zytoskelett noch nicht vollständig aufgeklärt.Ort et al.(2000,2001) haben gezeigt,daß der zytosoplasmatische Teil des trans-membranen SG-Proteins ICA512 mit der PDZ-Domäne von b2-Syntrophin interagiert.Dieses Protein bindet das F-Actin-Bindeprotein Utrophin.Die Ergebnisse zeigen außerdem,daß durch Stimulation der SG-Exozytose der Phosphorilierungsstatus von b2-Syntrophin beeinflusst wird,woraus ein verändertes Bindungsvermögen zu ICA512 resultiert.Es wurde ein Funktionsmodel vorgestellt,in dem sich SGs durch die Interaktion des ICA512/b2-Syntrophin Komplexes an das Actinzytoskelett binden.Dabei wird die Bindedynamik durch Phosphorilierung reguliert.Um dieses Model zu etablieren,wurden stabile GFP-b2-Syntrophin produzierende INS-1-Zellklone erzeugt.Die zelluläre Lokalisation und das Expressionsmuster von GFP-b2-Syntrophin stimmen mit dem des endogenen Proteins überein.Elektronenmikroskopie zeigte eine größe Anzahl oval-verformter SGs in GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.Verglichen mit nicht-transfizierten INS-1 Zellen waren in drei GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellklonen der Insulingehalt der Zellen und die stimulierte Insulinsekretion erhöht.Die Werte korrelierten mit den unterschiedlichen GFP-b2-Syntrophin Expressionsmengen der Klone.Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese,daß b2-Syntrophin den Transport und die Sekretion der SGs durch Modulation ihres Bindevermögens an Actin reguliert.Um das postulierte Model genauer zu prüfen,wurde die Phosphorilierung von b2-Syntrophin detaillierter untersucht.Das GFP-Protein wurde,ähnlich dem endogenen b2-Syntrophin,durch Stimulation der Insulinausschüttung dephosphoriliert.Diese Dephosphorilierung ist Ca2+-abhängig und Okadeinsäuresensitiv.Die stimulationsabhängige Dephosphorilierung wurde durch Immunoprezipitation von 32P-markiertem GFP-b2-Syntrophin bestätigt.Massenspektrometrie des präzipitierten Proteins ermöglichte die Identifikation von vier Serin-Phosphorilierungsstellen(S75,S90,S213,S373),welche die Bindung zu ICA512 beeinflussen könnten.Mutanten,in denen die vier Phosphoserine durch Asp beziehungsweise Ala ersetzt wurden,um entweder eine Phosphorilierung(S/D) oder Dephosphorilierung(S/A) nachzuahmen,wurden in INS-1-Zellen exprimiert.Alle S/D Mutanten blieben kortikal lokalisiert.Das Expressionsmuster des S75D Allels unterschied sich jedoch von denen des Wild-Typs(wt).Im Gegensatz dazu waren alle S/A Allele zytosolisch verteilt.Eine Ausnahme bildete S213A,das an der Zellkortex lokalisiert blieb.Im Vergleich zu wt b2-Syntrophin zeigten PullDown-Assays eine erhöhte Bindung von ICA512 zu den S75A und S90D Allelen.Das Gegenteil konnte für die S75D und S90A Mutanten nachgewiesen werden.S75,S90 und S213 sind in einer Konsensussequenz für Cdk5-Phosphorilierung enthalten.Diese Kinase kann die Insulinsekretion regulieren.Die Phosphorilierung von b2-Syntrophin,insbesondere des S75 Allels durch Cdk5 wurde durch pharmakologische Inhibitoren,in vitro-Phosphorilierung und RNAi demonstriert.Zusammenfassend stimmen diese Erkenntnisse mit dem Model überein,daß die Phosphorilierung von b2-Syntrophin die Vernetzung von SGs mit Actin und dadurch deren Mobilität und Exozytose moduliert.Im Speziellen postulieren die Ergebnisse dieser Arbeit eine Cdk5-abhängige Phosphorilierung der S75 Stelle des b2-Syntrophins.Durch eine verminderte Interaktion von b2-Syntrophin und ICA512 erleichtert diese Mutante vermutlich die Insulinsekretion,da der Einfluss des Actinzytoskeletts auf die Granulamobilität vermindert ist.Dieser Prozess ereignet sich möglicherweise in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.

The trafficking of insulin secretory granules(SGs) of pancreatic b-cells is a tightly controlled complex network. Increasing evidence indicates that the cortical actin cytoskeleton modulates the mobility and exocytosis of SGs,yet the mechanisms anchoring SGs to the cytoskeleton is not completely understood.It has been shown by Ort et al.(2000,2001) that the cytoplasmic tail of an intrinsic membrane protein of the SGs named ICA512/IA-2 binds the PDZ domain of b2-syntrophin,which in turn binds to the F-actin-binding protein utrophin. These data also indicate that stimulation of SG exocytosis affects the phosphorylation of b2-syntrophin,hence altering its binding to ICA512.Therefore a model was proposed whereby SGs are anchored to the actin cytoskeleton through the ICA512/b2-syntrophin complex, whose dynamics are regulated by phosphorylation.To test this model GFP-b2-syntrophin stable INS-1 cell clones were generated.GFP-b2-syntrophin expression and localization pattern were similar to those of the endogenous protein. Electron microscopy showed that in GFP-b2-syntrophin INS-1 cells the number of SGs with a pear-like shape was increased relative to control cells. Insulin content and stimulated secretion were increased in three GFP-â2-syntrophin INS-1 cell clones,compared to non-transfected INS-1 cells and INS-1 cells expressing GFP. These increments correlated with the different expression levels of GFP-b2-syntrophin in the three GFP-b2-syntrophin INS-1 cell clones. These findings support the hypothesis that b2-syntrophin regulates the trafficking and exocytosis of SGs by modulating their tethering to the actin cytoskeleton.In order to confirm the proposed model, the phosphorylation of b2-syntrophin was investigated in more detail. Similar to endogenous b2-syntrophin,GFP-b2-syntrophin underwent Ca2+-dependent and okadaic acid-sensitive dephosphorylation upon stimulation of insulin secretion. Stimulation-dependent dephosphorylation was confirmed by immunoprecipitation of 32P-labeled GFP-b2-syntrophin.Mass spectrometry of immunoprecipitated GFP-b2-syntrophin allowed the identification of four serine-phosphorylation sites (S75,S90,S213,S373) that could affect the binding to ICA512.Mutants,in which all four phosphoserines, were replaced by either asp or ala to mimic(S/D) or prevent(S/A) phosphorylation were expressed in INS-1 cells. All S/D mutants retained a cortical localization,but by immunoblotting the pattern of the S75D allele differed from wild type and all other S/D alleles.Conversely, all S/A alleles were diffused cytosolically, except S213A,which was still restricted to the cortex. Finally, pull down assays showed increased binding of ICA512 to the S75A and S90D alleles compared to wild type b2-syntrophin,while the opposite was observed with the S75D and S90A mutants.Additionally,both the S75 and the S213 allele conform a consensus for phosphorylation by Cdk5,which is known to modulate insulin secretion. The phosphorylation of GFP-b2-syntrophin and particularly the S75 allele by Cdk5 was exhibited with pharmacological inhibitors,by in vitro phosphorylation and by RNAi. Taken together, these findings are consistent with the model by which phosphorylation of b2-syntrophin modulates the tethering of SGs to the cytoskeleton, and thereby their mobility and exocytosis. Specifically, the data of this thesis suggest that Cdk5-dependent phosphorylation of the S75 site of GFP-b2-syntrophin facilitates insulin secretion by reducing the interaction of b2-syntrophin with ICA512,thereby decreasing the actin cytoskeleton constrain on SG mobility. This process could occur in combination with the phosphatase-dependent dephosphorylation of b2-syntrophin at phosphosites other than S75. / Der Transport Insulin-gefüllter sekretorische Granula(SG) ist ein streng kontrollierter komplexer Prozess.Es gibt vermehrt Beweise,dass das kortikale Actinzytoskelett die Ausschüttung der SGs beeinflusst.Bisher ist der Mechanismus der Verankerung von SGs am Zytoskelett noch nicht vollständig aufgeklärt.Ort et al.(2000,2001) haben gezeigt,daß der zytosoplasmatische Teil des trans-membranen SG-Proteins ICA512 mit der PDZ-Domäne von b2-Syntrophin interagiert.Dieses Protein bindet das F-Actin-Bindeprotein Utrophin.Die Ergebnisse zeigen außerdem,daß durch Stimulation der SG-Exozytose der Phosphorilierungsstatus von b2-Syntrophin beeinflusst wird,woraus ein verändertes Bindungsvermögen zu ICA512 resultiert.Es wurde ein Funktionsmodel vorgestellt,in dem sich SGs durch die Interaktion des ICA512/b2-Syntrophin Komplexes an das Actinzytoskelett binden.Dabei wird die Bindedynamik durch Phosphorilierung reguliert.Um dieses Model zu etablieren,wurden stabile GFP-b2-Syntrophin produzierende INS-1-Zellklone erzeugt.Die zelluläre Lokalisation und das Expressionsmuster von GFP-b2-Syntrophin stimmen mit dem des endogenen Proteins überein.Elektronenmikroskopie zeigte eine größe Anzahl oval-verformter SGs in GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.Verglichen mit nicht-transfizierten INS-1 Zellen waren in drei GFP-b2-Syntrophin INS-1-Zellklonen der Insulingehalt der Zellen und die stimulierte Insulinsekretion erhöht.Die Werte korrelierten mit den unterschiedlichen GFP-b2-Syntrophin Expressionsmengen der Klone.Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese,daß b2-Syntrophin den Transport und die Sekretion der SGs durch Modulation ihres Bindevermögens an Actin reguliert.Um das postulierte Model genauer zu prüfen,wurde die Phosphorilierung von b2-Syntrophin detaillierter untersucht.Das GFP-Protein wurde,ähnlich dem endogenen b2-Syntrophin,durch Stimulation der Insulinausschüttung dephosphoriliert.Diese Dephosphorilierung ist Ca2+-abhängig und Okadeinsäuresensitiv.Die stimulationsabhängige Dephosphorilierung wurde durch Immunoprezipitation von 32P-markiertem GFP-b2-Syntrophin bestätigt.Massenspektrometrie des präzipitierten Proteins ermöglichte die Identifikation von vier Serin-Phosphorilierungsstellen(S75,S90,S213,S373),welche die Bindung zu ICA512 beeinflussen könnten.Mutanten,in denen die vier Phosphoserine durch Asp beziehungsweise Ala ersetzt wurden,um entweder eine Phosphorilierung(S/D) oder Dephosphorilierung(S/A) nachzuahmen,wurden in INS-1-Zellen exprimiert.Alle S/D Mutanten blieben kortikal lokalisiert.Das Expressionsmuster des S75D Allels unterschied sich jedoch von denen des Wild-Typs(wt).Im Gegensatz dazu waren alle S/A Allele zytosolisch verteilt.Eine Ausnahme bildete S213A,das an der Zellkortex lokalisiert blieb.Im Vergleich zu wt b2-Syntrophin zeigten PullDown-Assays eine erhöhte Bindung von ICA512 zu den S75A und S90D Allelen.Das Gegenteil konnte für die S75D und S90A Mutanten nachgewiesen werden.S75,S90 und S213 sind in einer Konsensussequenz für Cdk5-Phosphorilierung enthalten.Diese Kinase kann die Insulinsekretion regulieren.Die Phosphorilierung von b2-Syntrophin,insbesondere des S75 Allels durch Cdk5 wurde durch pharmakologische Inhibitoren,in vitro-Phosphorilierung und RNAi demonstriert.Zusammenfassend stimmen diese Erkenntnisse mit dem Model überein,daß die Phosphorilierung von b2-Syntrophin die Vernetzung von SGs mit Actin und dadurch deren Mobilität und Exozytose moduliert.Im Speziellen postulieren die Ergebnisse dieser Arbeit eine Cdk5-abhängige Phosphorilierung der S75 Stelle des b2-Syntrophins.Durch eine verminderte Interaktion von b2-Syntrophin und ICA512 erleichtert diese Mutante vermutlich die Insulinsekretion,da der Einfluss des Actinzytoskeletts auf die Granulamobilität vermindert ist.Dieser Prozess ereignet sich möglicherweise in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.in Kombination mit einer Dephosphorilierung des b2-Syntrophins.