Univ., Diss., 2009--Marburg.

Berlin, Freie University, Diss., 2003. / Dateiformat. zip, Dateien im PDF-Format.

Regensburg, Univ., Diss., 2007

Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Optogenetics is a method to control the cell activity with light by expression of a natural or engineered photoreceptor via genetic modification technology. Optogenetics early success came with the light-gated cation channel "Channelrhodopsin-2" in neurons and expanded from neuroscience to other research fields such as cardiac research and cell signaling, also due to the enrichment by new photoreceptors. In this study, I focus on searching and characterizing new photoreceptors to expand the optogenetic tool box. In this work I characterize three newly discovered microbial rhodopsins and some engineered mutants of them. The first rhodopsin is a proton pump from the diatom Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis Rhodopsin or abbreviated: FR. I cloned the full-length FR and proved it to be a light-activated proton pump with high efficacy in comparison to Bacteriorhodopsin (BR). During this study, I also developed a new method to improve the plasma membrane targeting of several microbial rhodopsins. I also obtained a FR mutant (channel-like FR or chFR) which behaves like a light-gated proton channel. FR can be used for optogenetic hyperpolarization or alkalization of a cell while the chFR could be used for depolarization or lowering of the cellular pH. The induction of FR expression under iron-limited conditions in the diatom indicated an alternative energy generation mechanism of F. cylindrus when iron-containing enzymes are scarce. I then characterized a new microbial rhodopsin with novel light-regulated Guanylyl Cyclase (GC) activity. This rhodopsin guanylyl cyclase from the fungus Blastocladiella emersonii (B.e. CyclaseOpsin or BeCyclOp) has been proven by me to be an efficient light-gated GC with high specificity and fast kinetics. BeCyclOp also has a novel structure with eight transmembrane helices, containing a long cytosolic N-terminus which participates in the tight regulation of the GC activity. In collaboration with Prof. Alexander Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.), BeCyclOp has been tested in muscle cells and sensory neurons of Caenorhabditis elegans and proven to be a powerful optogenetic tool in a living animal. I also generated a BeCyclOp mutant with enhanced light sensitivity. Already more than ten years ago, guanylyl cyclase rhodopsins were suggested to exist in Chlamydomonas reinhardtii by analyzing genomic sequence data. But until now no functional proof existed. By further cloning and sequencing I discovered such a rhodopsin with light-regulated guanylyl cyclase activity. This functional Cyclaseopsin (COP6c) is quite different to BeCyclOp, as it was proven to be a light-inhibited GC. Cop6c is much larger than BeCyclOp with a His-Kinase and a response regulator domain between the rhodopsin and the cyclase domain. I also introduced a new strategy for generating optogenetic tools by fusing the photoactivated adenylyl cyclase bPAC to two different CNG channels. These new tools function via light-gated cAMP production and subsequent CNG channel activation. These tools combined the properties of bPAC (highly sensitive to blue light) and CNG channels (high single-channel conductance and high Ca2+ permeability), as demonstrated by expression in Xenopus oocytes. As a further benefit the fusing of bPAC to CNG channels leads to a bPAC with a more than tenfold reduced dark activity which is a valuable improvement for bPAC itself as an optogenetic tool. / Als Optogenetik wird die Technik bezeichnet, durch genetische Veränderung Photorezeptoren in Zellen einzubringen, um die Zellaktivität mit Licht zu steuern. Frühe Erfolge der Optogenetik wurden mit dem Licht-gesteuerten Kationenkanal "Channelrhodopsin-2" in Neuronen von lebenden Tieren erzielt. Die Anwendung erweiterte sich von den Neurowissenschaften zu anderen Forschungsfeldern, wie Herzforschung und Zellbiologie, auch durch die Bereicherung mit neuen Photorezeptoren. Hier konzentriere ich mich auf die Suche und Charakterisierung neuer Photorezeptoren. In dieser Arbeit werden drei neu entdeckte, natürliche mikrobielle Rhodopsine, sowie ausgewählte Mutanten, charakterisiert. Das erste Rhodopsin ist eine Protonenpumpe aus der Kieselalge (Diatomee) Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis-Rhodopsin, abgekürzt FR. Ich klonierte FR und bewies, dass FR eine Licht-aktivierte Protonenpumpe mit hoher Wirksamkeit ist. In dieser Studie zeige ich auch eine Methode, um die Plasmamembran-Lokalisation von FR und mehreren anderen Rhodopsinen zu verbessern. Ich identifizierte eine FR-Mutante (chFR), die sich wie ein Licht-gesteuerter Protonenkanal verhält. FR kann für die Licht-gesteuerte Hyperpolarisation oder Alkalisierung der Zelle verwendet werden, während chFR möglicherweise verwendet werden könnte, um den zellulären pH Licht-gesteuert abzusenken. Die Induktion der FR-Expression unter Eisenmangel-Bedingungen legt einen neuen Energieerzeugungsmechanismus von F. cylindrus nahe, wenn Eisen-haltige Enzyme in den Chloroplasten fehlen. Ich habe dann ein neues mikrobielles Rhodopsin mit Licht-geregelter Guanylylcyclase (GC) Aktivität untersucht. Für dieses Cyclaseopsin aus dem Pilz Blastocladiella emersonii (BeCyclOp) konnte ich zeigen, dass es sich um eine effiziente lichtgesteuerte GC mit hoher Spezifität und schneller Kinetik handelt. BeCyclOp hat eine für ein Opsin neuartige Struktur mit acht Transmembranhelices. Für den langen cytosolischen N-Terminus zeigte ich eine Beteiligung an der Regulierung der GC-Aktivität. BeCyclOp wurde im Labor von Prof. A. Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.) in den Muskelzellen und sensorischen Neuronen von Caenorhabditis elegans getestet und erwies sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in optogenetisch veränderten, lebenden Tieren. Ich habe dann auch eine BeCyclOp Mutante mit verbesserter Lichtempfindlichkeit hergestellt. Bereits vor über zehn Jahren wurden anhand genomischer Daten Guanylylcyclase-Rhodopsine in Chlamydomonas reinhardtii postuliert, konnten aber funktionell bisher nicht nachgewiesen werden. Durch Klonieren von verschiedenen Chlamydomonas reinhardtii Stämmen gelang es mir, solch ein Opsin (Cop6c) zu entdecken, dessen Guanylylcyclase-Aktivität eindeutig Licht-reguliert ist. COP6c ist ganz anders als BeCyclOp, nicht nur weil die GC-Aktivität durch Licht inhibiert wird. Außerdem ist Cop6c ein viel größeres Protein mit einer zusätzlichen His-Kinase-, sowie einer Transducer-Domäne zwischen der Rhodopsin- und der Cyclase-Domäne. Schlussendlich zeige ich auch eine neue Strategie zur Erzeugung von optogenetischen Werkzeugen durch Fusion der Licht-aktivierten Adenylyl-Cyclase (AC) bPAC mit CNG-Kanälen. Diese neuen "Werkzeuge" funktionieren über Licht-gesteuerte cAMP-Produktion und die anschließende Aktivierung eines cAMP-sensitiven Kationen-(CNG-) Kanals. Hierbei werden die positiven Eigenschaften von bPAC (sehr empfindlich auf blaues Licht) und CNG-Kanälen (hohe Leitfähigkeit bei hoher Ca2+-Durchlässigkeit) kombiniert. Darüber hinaus konnte ich demonstrieren, dass die Fusion der bPAC an den CNG-Kanal zu einer bPAC mit stark reduzierter AC-Aktivität im Dunkeln führte, was allein schon eine gute Verbesserung der bPAC als optogenetische Werkzeug ist.

Regensburg, Univ., Diss., 2008.

Netzhauterkrankungen, wie Retinitis pigmentosa, sind in der Bevölkerung weit verbreitet (1,5 Millionen weltweit). Gewöhnlich berichten die Betroffenen über Nachtblindheit und periphere Gesichtsfeldausfälle. Häufig führt diese Erkrankung, die durch eine fortschreitende Degeneration von Photorezeptoren verursacht wird, zur vollständigen Erblindung. Bisher beschrieb man den pathologischen Prozess vor allem an rd-Mäusen. Allerdings setzt bei diesen die Degeneration sehr früh ein. Somit ist die Übertragbarkeit auf den Menschen erschwert, da abgesehen von wenigen Ausnahmen, der Verlust von Photorezeptoren hier erst im zweiten Lebensabschnitt beginnt. Deshalb war es interessant, im Rahmen dieser Arbeit anhand der CNGA3-/-Rho-/- Maus ein Modell zu untersuchen, das ähnlich dem menschlichen System, zunächst eine intakte Morphologie zeigt. Dadurch war es möglich eine genaue zeitliche Abfolge der Degeneration zu dokumentieren. Dies kann medizinisch zur Entwicklung eines Therapieansatzes genutzt werden, der bereits zu Beginn der Degeneration greift, und damit den fortlaufenden Prozess zum Stillstand bringen kann. Die CNGA3-/-Rho-/- Maus repräsentiert ein System funktionsloser Photorezeptoren, bei dem der zyklische Nukleotid-Kanal (CNGA3) der Zapfenaußensegmente und das Rhodopsin (Rho) der Stäbchenaußensegmente ausgeschaltet wurde. Bestätigt wurde dies durch ein Elektroretinogramm mit einer negativen Photoantwort bezüglich Zapfen und Stäbchen. Die Degeneration führt zu einem vollständigen Verlust aller Photorezeptoren nach drei Monaten (Pm3). Zum Zeitpunkt Pw4 konnte, vergleichbar dem Wildtyp, eine intakte äußere Retina nachgewiesen werden, bei der lediglich die äußeren Stäbchensegmente fehlen. Die synaptischen Kontakte zwischen den Terminalien der Photorezeptoren, der Horizontalzellen und Bipolarzelldendriten waren normal entwickelt und Stäbchenendigungen als auch Zapfenendfüßchen bildeten funktionelle Triaden aus. Bei den Stäbchenendigungen konnte mit zunehmender Degeneration (Pw5, Pw6) eine Akkumulation synaptischer Bänder und postsynaptischer Elemente beobachtet werden. Im Zeitraum Pw4-7 zeigten sowohl die Zapfen, als auch die Horizontalzellen und Stäbchen-Bipolarzellen, eine bemerkenswerte strukturelle Plastizität. Obwohl durch die Photorezeptoren kein Lichtsignal vermittelt wurde, konnten präsynaptische Marker (bassoon) und postsynaptische Glutamatrezeptoren (GluR1, mGluR6) an den Photorezeptorterminalien nachgewiesen werden. Dies lässt die Vermutung zu, dass eine Transmitterfreisetzung theoretisch möglich wäre. Darüber hinaus konnte im Zeitraum von 12 Monaten keine nennenswerte Auswirkung auf die IPL beobachtet werden: Amakrin- und Zapfen-Bipolarzellen waren normal stratifiziert und die Expression der Transmitter-Rezeptoren zeigte ein charakteristisches Verteilungsmuster. Außerdem war die Ultrastruktur von konventionellen und Bandsynapsen der des Wildtyps vergleichbar. Darüber hinaus bildeten sowohl Amakrinzellen, als auch Bipolar- und Ganglienzellen, Fortsätze in die INL hinein. Allgemein zeigt die immunhistochemisch und ultrastrukturell untersuchte CNGA3-/-Rho-/- Maus, dass weder funktionell aktive Photorezeptoren noch Licht eine stimulierende Wirkung auf die Ausbildung synaptischer Strukturen und die Expression verschiedener Rezeptoren haben. / Retinopathies such as retinitis pigmentosa affect about 1,5 million people worldwide. Patients usually suffer from night blindness and loss of mid-peripheral visual field caused by a continual degeneration of photoreceptors often leading to a complete loss of sight. Up to now the pathology process of this desease has been described in retinal degeneration (rd) mice. However this degeneration starts at an early time point. It makes a comparison to the human system difficult, because with a few exceptions, photoreceptor degeneration starts in the second half of human life span. For this reason, the CNGA3-/-Rho-/- mouse system is chosen for this study. It shows an intact photoreceptor morphology in the first life span, comparable to humans. Thus it was possible to document the exact time course of the photoreceptor degeneration. This result can be useful for development of a medical therapy which can be applied at an early stage of degeneration and thus may stop the ongoing process in time. The CNGA3-/-Rho-/- represents a mouse system without functional photoreceptors (cyclic nucleotide-gated channel in cones (CNGA3) and the rhodopsin (Rho) in rods are knocked out). The lack of these functions was proven by electroretinography. Photoreceptor degeneration starts at postnatal week 4 progressing to an almost complete loss after 3 months (Pm3). In the early postnatal development at Pw4 the outer retina of the CNGA3-/-Rho-/- mouse shows an intact multi-layer ONL comparable to the wildtype, with the outer rod segments missing. In the CNGA3-/-Rho-/- retina the development of the synaptic contacts between photoreceptor terminals, horizontal cell processes, and bipolar cell dendrites appears normal until Pw4. Electron microscopy demonstrates rod spherules with one triad synapse and cone pedicles with multiple triad synapses comparable to the wildtype retina. At the age of Pw5 and Pw6 some of the surviving rod spherules show an increased number of synaptic ribbons and postsynaptic elements. In addition, second-order neurons such as cones, horizontal cells and rod bipolar cells demonstrate dramatic morphological modifications by sprouting at the age of Pw4-Pw7. Although there is no light input by photoreceptors, presynaptic markers and postsynaptic glutamate receptors are well expressed in the outer plexiform layer (OPL), suggesting that neurotransmission might take place. Moreover, the inner plexiform layer (IPL) seems not significantly affected at the age of twelve months: Both cone bipolar cells and amacrine cells are stratified normal and transmitter receptors show normal distribution: only rod bipolar cell axon terminals show alterations. The ultrastructure of conventional and ribbon synapses is comparable to the wildtype. In addition, amacrine, bipolar and ganglion cells sprout into the inner nuclear layer. In general, the immunocytochemical and ultrastructural analysis of the CNGA3-/-Rho-/- mouse indicates that neither functional photoreceptors nor light input have a stimulating effect on the expression of receptors and synaptic contacts.

University, Diss., 2005--Würzburg.

Universiẗat, Diss., 2001--Mainz. / Auch als gedr. Diss.

Der Thiol-Redox-Metabolismus, der in allen lebenden Zellen zu finden ist, wirkt oxidativem Stress entgegen. Des Weiteren dient er auch der Aufrechterhaltung der intrazellulären Thiol:Disulfid-Balance, die wiederum für die Funktion vieler Proteine essentiell ist. Auch stellt er Reduktionsäquivalente für die Produktion von Desoxyribonucleotiden für die DNA-Synthese bereit und hilft oxidierte Proteine zu reparieren. Der Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus (TDRM) unterscheidet sich von anderen metabolischen Netzwerken dadurch, dass keine Kohlenstoff- oder Stickstoffbindungen verändert werden. In vielen Fällen beinhaltet er die reversible Oxidation zweier benachbarter Cysteinreste im entsprechenden Protein, was zur Ausbildung von Disulfidbrücken führt. Da ein totaler Ausfall der GSH-Synthese einen geringeren Effekt zu haben schien als ein teilweiser, wurden DNA-Microarray-Transkriptomanalysen der ΔgshF-Mutante durchgeführt. Es wurden rund 750 Gene als signifikant reguliert (p < 0,05, Fold-change <0,5 bzw. >2) identifiziert. Da die am stärksten regulierten Gene von besonderem Interesse waren, wurden die Ausschlussgrenzen auf <0,2 bzw. >5 –fach reguliert heraufgesetzt. Diese Parameter trafen auf 92 Gene zu, davon 41 durch GSH-Mangel herauf-regulierte (d.h. die mRNA-Menge war in der Mutante höher als im Wildtyp) und 51 herunter-regulierte. Auffällig war, dass die Expression vieler Gene, welche durch den Stress-Sigmafaktor SigB reguliert werden, bei Fehlen von GSH verändert war. Zu den am stärksten (sechs- bis elffach) herauf-regulierten Genen zählen lmo0135-7, sie codieren für einen putativen Oligopeptidtransporter. Die Vermutung lag nahe, dass dieser evtl. GSH aus dem Medium in die Zellen transportieren könnte. Man kann also davon ausgehen, dass GSH von Listeria aktiv aus dem Medium aufgenommen wird und dass die Effekte, die im Versuch ohne zusätzliches GSH auftreten, direkt auf das Fehlen von GSH zurückzuführen sind. Zusammengefasst zeigte sich, dass ein Ausfall der GSH-Synthese in Listeria keinen auffälligen Phänotyp zeigt. Es wurden jedoch sehr umfangreiche Veränderungen des Transkriptionsprofils beobachtet, offenbar konnten die Bakterien dadurch eine neue zelluläre Homöostase erreichen. Physiologische Mengen von GSH im Medium komplementierten den Ausfall der GSH-Synthese fast vollständig. Im Laufe dieser Analysen fiel das Augenmerk auf ein Gen mit unbekannter Funktion, lmo0799, das in der ΔgshF-Mutante als deutlich heraufreguliert identifiziert worden war. Eine nähere in-silico-Analyse ergab deutliche Homologien des Lmo0799 Proteins zu einem Blaulicht-photorezeptor, YtvA, von Bacillus subtilis. Da ein Zusammenhang mit dem TDRM aufgrund der Microarray-Analysen mehr als wahrscheinlich schien, richtete sich das Augenmerk verstärkt auf die Charakterisierung des putativen Blaulichtrezeptors Lmo0799. Es wurde eine In-Frame-Deletionsmutante in lmo0799 hergestellt, die mit Δlmo0799-Mutante bezeichnet wurde. Darin ist das ursprünglich 253 Aminosäuren (AS) große Genprodukt von lmo0799 auf sieben AS verkürzt, ohne den Promotor- oder Terminatorbereich bzw. umliegende Gene zu verändern. Parallel wurde begonnen, Versuche zum Einfluss von Licht (blau, λ=455nm bzw. rot, λ=625nm) in vivo und in vitro auf L. monocytogenes durchzuführen. Versuche mittels qRT-PCR wurden durchgeführt um die genaue Wirkweise von Lmo0799 näher aufzuklären. Dazu wurden Testgene aus verschiedenen Regulons ausgewählt und deren Transkription in Proben von Wildtyp und Δlmo0799-Mutante mit und ohne blauem bzw. rotem Licht sowie mit und ohne Salzstress gemessen. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Transkription von Genen des SigB-Regulons, das für die allgemeine Stressantwort in Listerien zuständig ist, durch Licht moduliert wurde. Die Wirkung von Blaulicht hing in hohem Maße von der Anwesenheit von Lmo0799 ab, welches wahrscheinlich eine Komponente des „Stressosoms“ von Listeria darstellt. Die Lichtregulation betraf auch die Internaline A und B, deren Transkription durch Belichtung stark erhöht wurde. Infektionsversuche mit blau belichteten bzw. dunkel gehaltenen Wildtyp- bzw. Δlmo0799-Bakterien an humanen Caco-2 Enterozyten zeigten, dass wildtypische Listerien nach Bestrahlung mit blauem Licht ihre Invasionsrate verdoppelten, während die Δlmo0799-Listerien auf Niveau der Dunkelkontrolle blieben. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass L. monocytogenes (und wohl auch die anderen Listeria-Arten) in Lmo0799 einen funktionalen Blaulichtrezeptor besitzt, der eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Stressreizen via SigB spielt und auch die Motilität und Virulenz moduliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch rotes Licht die Transkription zahlreicher durch Blaulicht regulierter Gene beeinflusst. Der molekulare Mechanismus konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr aufgeklärt werden. / The thiol-redox metabolism, which can be found in all living cells, counteracts oxidative stress. It also serves in maintaining a proper intracellular thiol:disulfide balance which is essential for many protein functions. It also provides reducing power for the production of deoxynucleotides and thus for DNA synthesis and helps in repairing oxidized proteins. The thiol-redox metabolism and other cellular processes are partially regulated by thiol-based regulatory switches. The thiol:disulfide-redox metabolism (TDRM) differs from other metabolic pathways in that no carbon- or nitrogenbonds are altered. In many cases it involves the reversible oxidation of two neighboring cysteines in the corresponding protein, leading to the formation of disulfide bonds. As a total deficiency in GSH synthesis seemed to have a lesser effect as a partial one, DNA microarray experiments were carried out with the ΔgshF mutant. As it turned out, a large number of genes was affected. Around 750 genes were identified to be differentially transcribed to a significant (p < 0.05, fold-change <0.5 or >2) extend. The focus was on the most differentially transcribed genes and therefore the threshold was set to < 0.2 or >5 – fold regulated, respectively. These parameters held true for 92 genes, of which 41 were up regulated by the lack of GSH (meaning the amount of mRNA of this gene is x-fold higher in the mutant than in the wildtype), and 51 were down regulated. First analyses showed that only few genes of the TDRM list fulfilled these parameters, among them trxB, perR and sod. Interestingly prfA-dependent virulence genes like hly, actA, plcB or inlA and inlB were among the genes down regulated most significantly. This was also confirmed by e.g. lecithinase assay. prfA itself was not differentially transcribed. Strikingly the expression of many SigB-regulated genes was altered when GSH was lacking. Among the genes up regulated the most (six- to elevenfold) were lmo0135-7, encoding a putative oligopeptide transporter. Probably it facilitates the uptake of GSH from the medium into the cell. Taken together, the results of this work show that a loss of GSH synthesis in Listeria does not result in a particular phenotype. However, extensive changes in the transcription profile were observed as a consequence of the lack of GSH, apparently the bacteria thus could establish a new cellular homeostasis. Physiological amounts of GSH in the medium can complement the loss of GSH synthesis almost completely. During these analyses a gene of unknown function, lmo0799, was noticed to be significantly up regulated in the ΔgshF mutant. A closer in silico analysis showed strong homologies of the Lmo0799 protein to a blue-light photoreceptor, YtvA from Bacillus subtilis. As there seemed to be a clear connection to the TDRM because of the microarray analysis, the focus shifted to the characterization of the putative blue light receptor Lmo0799. An in-frame deletion mutant in lmo0799 was obtained, which was designated Δlmo0799. In this mutant the 253 amino acid long gene product of lmo0799 was shortened to seven amino acids, without altering the promoter or terminator region or any surrounding gene, respectively. In parallel, experiments were started to investigate the influence of light (blue, λ=455nm or red, λ=625nm) on L. monocytogenes in vivo and in vitro. qRT-PCR experiments were carried out to give more detailed information on the mode of action of Lmo0799. Test genes from different regulons were selected and their transcription was tested in samples from wild type and the Δlmo0799 mutant, kept in the dark or irradiated with red or blue light, and plus/minus salt stress. It turned out that Lmo0799 is linked to the SigB regulon, responsible for the stress response in Listeria, suggesting that Lmo0799 is a component of the “stressosome”. It also became clear that the transcription of the Internalins A and B was stimulated by blue light. Infection assays with human Caco-2 enterocytes, using wild type and Δlmo0799 bacteria grown under NaCl-stress conditions and in the dark or with blue light, showed that the wild type doubles its invasion rate after illumination with blue light compared to the reference kept in the dark, while the Δlmo0799 mutant showed no increased invasiveness. In this work it could be demonstrated for the first time that L. monocytogenes possess a functional blue-light photoreceptor, Lmo0799, which plays a major role in relaying stress stimuli via SigB and which also modulates motility and virulence. Furthermore, it could be shown that also red light has an effect on the transcription of blue-light modulated genes. The underlying mechanism could not be elucidated in the framework of this thesis.