Les plaquettes jouent un rôle primordial dans le processus d'hémostase. Elles sont générées à partir des mégacaryocytes (MK) présents dans la moelle osseuse. En plus des compartiments vésiculaires classiques de la voie d'endocytose et de dégradation vers les lysosomes, les plaquettes possèdent deux compartiments sécrétoires additionnels, les granules alpha et denses. Ces granules sont générés au cours de la maturation des MK à partir des corps multivésiculaires (MVB) et contiennent des molécules essentielles aux fonctions plaquettaires. Un défaut dans la production ou le remplissage de ces granules est à l'origine de symdromes hémorragiques. Malgré des études montrant l'implication de certaines protéines du trafic vésiculaire, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la biogenèse et la maintenance des granules plaquettaires dans les MK ainsi que les mécanismes de tri des cargos qu'ils contiennent, ne sont pas complètement élucidés. Au cours de ces dernières années les phosphoinositides (PI) sont apparus comme des acteurs majeurs du trafic vésiculaire en régulant de la localisation de certaines protéines. Cependant, peu de choses sont connues à ce jour quant au rôle de ces lipides dans la biogenèse et le trafic des granules plaquettaires dans les MK. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle d'un des membres de la famille des PI, le phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), ainsi que deux enzymes responsables de sa synthèse : la 3-phosphatase MTM1 (mutée dans la myopathie centronucléaire, CNM) et la lipide kinase PIKfyve, dans le contrôle de la dynamique des granules. Mes résultats montrent que MTM1 est présente dans les MK et les plaquettes et est localisée en partie sur les granules denses. Cependant, cette phosphatase n'est pas essentielle pour la production et l'activation plaquettaire. En effet, les souris MTM1 KO ne présentent pas de défaut du nombre plaquettaire, ni d'agrégation et de sécrétion suite à une stimulation par la thrombine ou le collagène. Nous montrons la présence d'autres membres de la famille des myotubularines dans les plaquettes et les MK différenciés, ce qui pourrait expliquer une redondance de fonction. De façon intéressante, nous montrons que la détection de MTM1 à partir de faible quantité de sang (<100 ?l) pourrait déboucher sur la mise au point d'un test diagnostic rapide pour la détection de la CNM. Mes travaux ont été focalisés par la suite sur PIKfyve. En utilisant la lignée leucémique mégacaryoblastique MEG-01 différenciée, je montre pour la première fois que le PtdIns5P est localisé dans les compartiments endosomes tardifs ainsi que dans les granules alpha et denses. Dans ces cellules, PIKfyve contrôle plus de 50% du PtdIns5P. De façon remarquable, l'inhibition pharmacologique de PIKfyve ou son invalidation par siRNA entraine une perte d'identité des granules avec la formation de granules élargis qui présentent à la fois des marqueurs de granules denses et alpha et bloque totalement leur mobilité. Ces données ont été confirmées dans des MK primaires de souris. L'addition de PtdIns5P exogène sur les MEG-01 restaure le phénotype normal des granules démontrant que PIKfyve, par l'intermédiaire du PtdIns5P, contrôle l'intégrité des granules qui est donc un phénomène actif et les mécanismes de fusion/fission des vésicules affectant le tri des cargos. De plus, l'inhibition de PIKfyve dans les plaquettes isolées affecte leur agrégation et leur sécrétion, montrant que PIKfyve et le PtdIns5P peuvent agir d'une part lors de la biogénèse des plaquettes dans les MK et d'autre part sur le fonctionnement des plaquettes. Dans leur ensemble, mes travaux placent PIKfyve et son produit lipidique, le PtdIns5P, comme des acteurs majeurs de la maintenance et l'identité des granules plaquettaires. / Platelets play a major role in homeostasis processes. They are generated from megakaryocytes (MKs) in the bone marrow. In addition to the classic vesicular compartments of the endocytic and degradation pathway toward lysosomes, platelets have two additional specialized secretory compartments, the dense and alpha granules. These granules are made during MK maturation from multivesicular bodies (MVB) and contain molecules that are essential to platelet functions. Defect in the production of these granules or absence of their cargos is the cause of hemorrhagic syndromes. Despite many studies showing the implication of vesicle trafficking proteins, the molecular mechanisms controlling the biogenesis and maintenance of the granules and cargo sorting are not completely understood. In recent years, phosphoinositides (PIs) have emerged as key actors in vesicular trafficking playing a role of important spatial regulators of many proteins. However, little is known about the role of these lipids in the biogenesis and the trafficking of platelet granules in the MK.During my thesis, I have studied the role of one the member of the PI family, the phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), and of two enzymes responsible of its synthesis : the 3-phosphatase MTM1(mutated in the Centronuclear myopathy, CNM) and the lipid kinase PIKfyve, in the control of granules dynamic. My results show that MTM1 is present in MK and platelet and that platelet MTM1 localizes in part on dense granules. However, the phosphatase is not mandatory for platelet production and activation. Indeed, the knock-out of MTM1 in mice has no effect on platelet count, aggregation and secretion following thrombin or collagen stimulation. We show the presence of other members of the myotubularins family in platelet and differentiated MK, which can explain a redundancy in functions. Interestingly, we show that MTM1 detection from small amount of blood (<100 ?l) could lead to the development of a rapid diagnostic test for the detection of the CNM. My work was next focalized on PIKfyve. Using the differentiated leukemic megakaryoblastic cell line MEG-01 as a cell model, I showed for the first time that PtdIns5P is localized on late endosome and on alpha and dense granules. In these cells, PIKfyve controls more than 50% of cellular PtdIns5P. Remarkably, pharmacological inhibition of PIKfyve or its invalidation by siRNA leads to a loss of granules identity with the formation of enlarged granules containing both alpha and dense granules markers, and totally blocks their mobility. These data were also confirmed on primary mice MK. Addition of exogenous PtdIns5P on MEG-01 cells restores the normal phenotype of granules showing that PIKfyve, via PtdIns5P, controls granules integrity, an active phenomenon, and the fusion/fission mechanisms that affect cargos sorting. Furthermore, PIKfyve inhibition in isolated platelet affects their aggregation and secretion, showing that PIKfyve and the PtdIns5P may act on the biogenesis of platelets in MK and also on the function of mature platelets. In conclusion, my Ph.D. work shows that PIKfyve and its product PtdIns5P are major actors in platelet granules maintenance and integrity.

The maturation of early endosomes into multivesicular bodies (MVBs) and subsequent trafficking to lysosomes is an important event for the control and silencing of endocytosed membrane receptors. The endosomal-sorting complex required for transport (ESCRT) proteins appear to play a key role in this event. Phosphatidylinositol lipids including PtdIns(3,5)P2 have been implicated in the MVB-lysosomal pathway and an ESCRT-III component CHMP3 binds to this lipid in vitro. The purpose of this thesis was to investigate the link between ESCRT proteins, PtdIns(3,5)P2 and endo-lysosomal trafficking. Firstly, a protein expressed by Salmonella, which is a phosphatase that acts on PtdIns(3,5)P2, was investigated as a potential tool for manipulating cellular PtdIns(3,5)P2 levels. Our results suggest that it is potentially a useful tool for this purpose and that expression of SopB perturbs endosome to lysosome trafficking. These findings provide further evidence for a role of PtdIns(3,5)P2 in endo-lysosomal trafficking.

Le remodelage cardiaque est un élément central dans le développement et la progression de l'insuffisance cardiaque, une cause majeure de morbi/mortalité dans le monde. Il est défini par les changements structurels, métaboliques et fonctionnels du ventricule gauche qui se manifestent cliniquement par des modifications de taille et de forme du cœur dans diverses situations pathologiques telles que l'hypertension, l'infarctus du myocarde ou l'obésité. Il s'agit donc d'un procédé complexe et dynamique qui implique une hypertrophie des cardiomyocytes, une production massive de radicaux libres (ROS) et une perte importante de cardiomyocytes par apoptose/nécrose. Cette perte cellulaire induit l'activation des fibroblastes cardiaques et le développement progressif d'une fibrose interstitielle conduisant à l'insuffisance cardiaque. Mon projet de thèse est centré sur l'étude du rôle de la kinase PIKfyve dans le remodelage ventriculaire et l'insuffisance cardiaque. PIKfyve est une lipide kinase conservée au cours de l'évolution qui régule de nombreuses fonctions cellulaires fondamentales. Par des approches in vitro et in vivo sur des modèles murins d'insuffisance cardiaque, mes travaux de thèse identifient PIKfyve et son produit le phosphatidylinositol 5-phosphate comme acteurs clés de l'altération du statut cardiométabolique et de l'intégrité mitochondriale en conditions pathologiques. L'inhibition pharmacologique et épigénétique de l'enzyme préserve l'intégrité mitochondriale, réduit le stress oxydant, l'apoptose cardiomyocytaire, et culmine par l'amélioration des fonctions cardiaques dans un modèle d'insuffisance cardiaque liée à l'obésité. De plus, mes travaux identifient un nouveau mécanisme de régulation de la réponse au stress cellulaires par PIKfyve qui implique une voie de la désacétylase mitochondriale SIRT3.[...] / Cardiac remodeling is a key process in the development and the progression of heart failure, one of the leading causes of morbi/mortality in modern societies. It is defined as a combination of structural, metabolic and functional modifications that clinically manifest as changes in size and shape of the heart, and under the influence of risk factors such as hypertension, myocardial infarction and obesity. Cardiac remodeling is a complex and dynamic process characterized by cardiomyocyte hypertrophy, excessive reactive oxygen species (ROS) generation leading to a massive loss of cardiomyocytes by apoptotic/necrotic cell death. Altogether, these events trigger the differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts and the progressive development of interstitial fibrosis leading to cardiac dysfunction. My thesis work focuses on the role of the lipid kinase PIKfyve in cardiac remodeling and heart failure. PIKfyve is the product of an evolutionary conserved single-copy gene and is known to regulate pleiotropic cellular functions. Combining in vitro and in vivo studies in mouse models of cardiac remodeling, my work identifies PIKfyve and its product phosphatidylinositol 5-phosphate as master regulators of the cardiometabolic status and mitochondrial integrity under pathological conditions. Pharmacological or epigenetic inhibition of the enzyme preserves mitochondrial integrity, reduces oxidative stress, myocyte apoptotic death and culminates with improved cardiac function in a mouse model of obesity induced heart failure. These effects are mediated by the mitochondrial deacetylase SIRT3. My work also demonstrates that PIKfyve is a necessary factor in the differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts during cardiac remodeling, regulating the TGF-beta/Smad pathway. Altogether, my thesis work unravels a novel role for PIKfyve in myocardial remodeling and paves the way for alternative therapies as a new molecular target for the treatment of cardiometabolic and fibrotic diseases.