Thesis (PhD (Genetics))--University of Stellenbosch, 2010. / Dissertation presented for the degree of Doctor of Philosophy Stellenbosch University. / ENGLISH ABSTRACT: Phosphorus (P) is essential for the survival of all living organisms and forms part of several key biological molecules and processes. The basic biological function of all cells depends on the availability of P as structural element in phospholipids and nucleic acids. P plays a central role in the energy metabolism of the cell by activating metabolic intermediates of carbohydrate metabolism and by acting as an energy currency in the form of adenosine tri-phosphate (ATP). ATP is produced during photosynthesis from the energy derived from sunlight, probably the most important biological process on earth. The balance of P supply and demand is of critical importance here. Plants assimilate P in the form of orthophosphate (Pi) via its roots and utilises complex mechanisms to redistribute and balance the Pi concentrations throughout the plant. These processes are collectively known as phosphate homeostasis and in this study we utilised molecular techniques to study some key aspects of this complex network of mechanisms in the plant Arabidopsis thaliana. When the role of the PHT1;5 Pi transporter was investigated in photosynthesis under Pi limitation a new mechanism utilised by plants to supply Pi for the production of ATP in the chloroplast was discovered. During periods of adequate Pi supply plants make use of the triose phosphate / phosphate translocator (TPT) to exchange Pi for phosphorylated carbon intermediates. This transporter does, however, not function at the low Pi concentrations present during Pi limitation and the plant therefore express an alternative transporter i.e. PHT1;5. Together with this transporter several genes were identified that was expressed to allow the export of carbon intermediates from the chloroplast via starch turnover. Amongst these, several alternative isoforms of the enzymes responsible for starch turnover are expressed during Pi limiting conditions. It is therefore suggested that the products of starch degradation, e.g. glucose and maltose are the potential candidates for carbon export from chloroplasts under Pi limiting conditions. In an attempt to perturb the Pi concentrations in the Arabidopsis vacuole we expressed the three genes of a newly discovered polyphosphate (PolyP) polymerase from the yeast Sacharomyces cerevisiae in Arabidopsis. This enzyme complex accumulates PolyP in the yeast vacuole and since the plant vacuole is playing a key role in buffering Pi concentrations we anticipated some observable effects that could lead to the elucidation of the mechanisms involved. Production of PolyP was conclusively shown in plant callus, but it was only at very low concentrations with no detectable perturbing effect and undetectable in whole plants. With the aim to apply this technology to the PolyP and PHT1;5 lines developed in the other parts of this study, newly developed fluorescent indicator protein nanosensors (FLIPPi) were evaluated as a method for detecting and monitoring in vivo Pi concentrations in multicellular plant organs. This technique is capable of detecting changes in metabolite concentrations in real-time and it was applied to the roots of Arabidopsis seedlings subjected to Pi limitation. We specifically looked at changes in the cytosol, but our results revealed no detectable changes occurring in the Pi concentrations in this compartment. This was interpreted to indicate lower levels of Pi in this compartment as was previously expected. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Fosfaat (P) is essensieël vir die oorlewing van alle organismes en maak deel uit van etlike kern biologiese prosesse en molekules. Die basiese biologiese funksionering van alle selle hang direk af van die beskikbaarheid van P as strukturele element van fosfolipiede en nuklëinsure. Fosfaat speel 'n sentrale rol in die energie metabolisme van 'n sel deur metaboliese intermediante te aktiveer en deur op te tree as die geld eenheid van sellulere energie in die vorm van adenosien tri-fosfaat (ATP). ATP word gegenereer gedurende fotosintese vanaf die energie wat van sonlig vasgevang word, dit is waarskeinlik die belangrikste biologiese proses op aarde. Dit is van kritiese belang dat die fosfaat vraag en aanbod hier fyn gebalanseer word. Plante assimileer P in die vorm van ortofosfaat (Pi) deur hulle wortels en maak gebruik van komplekse meganismes om Pi deur die plant te versprei en konsentrasies te balanseer. Hierdie prosesse staan gesamentlik bekend as fosfaat homeostase en in die huidige studie het ons gebruik gemaak van molekulêre tegnieke om 'n paar belangrike aspekte van hierdie komplekse netwerk van prosesse in die plant Arabidopsis thaliana te bestudeer. Toe die rol van die PHT1;5 Pi transporter in fotosintese onder toestande van Pi tekort bestudeer is, is 'n nuwe meganisme ontdek waarmee plante Pi verskaf aan chloroplaste vir die proses van fotosintese onder toestande van Pi tekort. Gedurende periodes wat die plant genoegsame Pi tot sy beskikking het, word van die triose fosfaat / fosfaat uitruiler (TPT) gebruik gemaak om Pi uit te ruil vir gefosforileerde koolstof metaboliete. Hierdie transporter kan egter nie onder die lae Pi konsentrasies wat voorkom in die sitoplasma onder Pi tekort toestande funksioneer nie, en gevolglik moet die plant van 'n alternatiewe transporter naamlik PHT1;5 uitdruk. Verskeie ander gene is ook geidentifiseer wat saam met hierdie transporter onder toestande van Pi tekort uitgedruk word en die plant toelaat om koolstof tussengangers uit die chloroplaste uit te vervoer via die proses van stysel produksie en afbraak. Onderandere is verskeie alternatiewe isoforme van die gene wat verandwoordelik is vir stysel produksie en afbraak identifiseer wat uitgedruk word onder toestande van Pi tekort. In 'n poging om die Pi konsentrasies in die Arabidopsis vakuool te versteur is drie gene van die nuut ontdekte polifosfaat (PolyP) polimerase kompleks van die gis Sacharomyces cerevisiae in Arabidopsis uitgedruk. Hierdie ensiem kompleks is verandwoordelik vir die akkumulasie van PolyP in die gis vakuool en siende die plant vakuool 'n kern rol speel in die buffering van Pi konsentrasies in die plant, het ons sekere waarneembare gevolge verwag wat kon lei tot die ontrafeling van die meganismes hierby betrokke. Die produksie van PolyP in plant kallus is duidelik gedemonstreer, maar dit was slegs teen baie lae konsentrasies met geen waarneembare versteuringseffek nie, en kon glad nie in heel plante waargeneem word nie. Met die oog daarop om hierdie tegnologie toe te pas op die bestudering van die PolyP en PHT1;5 lyne wat in die ander dele van hierdie studie ontwikkel is, is 'n nuut ontwikkelde fluoresente indikator protein nanosensor (FLIPPi) tegnologie evalueer as 'n metode om Pi konsentrasies in vivo in multisellulere plant organe waar te neem en te monitor. Hierdie tegniek is in staat daartoe om veranderinge in Pi konsentrasies in selle direk te monitor en is gevolglik op die wortels van Arabidopsis saailinge onder Pi tekort toestande toegepas. Daar is spesifiek na veranderinge in die sitosol gekyk, maar ons resultate kon geen waarneembare veranderinge in Pi konsentrasies in hierdie kompartement uitwys nie. Hierdie resultaat beteken waarkeinlik dat die Pi konsentrasies in hierdie kompartement waarskeinlik baie laer is as wat voorheen verwag is.

A Mata Atlântica representa um dos Biomas mais diversos do Planeta. No entanto, ainda pouco se sabe sobre os processos que levaram à alta diversidade de plantas nesta região. A maior parte dos estudos na Mata Atlântica trata este Bioma de forma ampla, sem considerar os diversos tipos vegetacionais encontrados na região. Apesar de ser dominado pela Floresta Pluvial Montana, este Bioma ainda inclui outros tipos vegetacionais periféricos, tais como: as Florestas Pluviais Baixo Montanas, Florestas Pluviais de Altitude, Florestas Pluviais Ripária, Florestas Pluviais em Manchas e as Florestas Paludosas Litorâneas, popularmente conhecidas como \"caxetais\". O nome \"caxetal\" foi dado devido à predominância da espécie Tabebuia Cassinoides (Lam.) DC., a qual é popularmente conhecida como \"caxeta\". Esta formação vegetal tem distribuição restrita a áreas com solos permanentemente encharcados do norte de Santa Catarina até o norte do Espírito Santo, onde ocorre de forma naturalmente fragmentada, formando ilhas ao longo de sua extensão de ocorrência. Populações com distribuição fragmentada são modelos em potencial para estudos de genética de populações, visto que a delimitação geográfica de populações naturais é um dos maiores problemas para estudos dessa natureza. Diante desse cenário, a presente tese teve como objetivo: (1) verificar como a distribuição geográfica da espécie arbórea T. cassinoides, agregada, bem delimitada e fragmentada na paisagem, pode influenciar na estruturação da diversidade genética em nível local; (2) caracterizar o grau de variabilidade genética inter e intrapopulacional em populações naturais de T. cassinoides ao longo da Mata Atlântica; e, (3) determinar a estrutura filogeográfica de T. cassinoides. Para tanto foram analisados dados de oito marcadores de microssatélites nucleares, além do sequenciamento da região trnC-ycf6 do DNA plastidial (cpDNA). Os dados genéticos obtidos foram primeiramente utilizados para o conhecimento da diversidade genética e estruturação da população em nível local, na região de Iguape (SP). Nossos resultados sugerem que a fragmentação dessas populações é somente geográfica, devido a suas necessidades edáficas, bem como que o modo de distribuição agregada e naturalmente fragmentada não indica a subdivisão genética das mesmas. A caracterização da variabilidade genética inter e intra-populacional em populações naturais de T. cassinoides ao longo de toda sua área de distribuição, com base nos marcadores de microssatélites nucleares indicou que a espécie possui baixos níveis de diversidade genética, e que 61% dessa diversidade é encontrada dentro das populações e 39% entre elas. Além disso, estes resultados evidenciaram significativos níveis de correlação entre distância genética e distância geográfica, sugerindo assim a presença de isolamento por distância. Nossos resultados indicam ainda a região geográfica do Rio de Janeiro como centro de diversidade para T. cassinoides. Uma forte estruturação genética foi encontrada para os dados de DNA nuclear e plastidial. Os resultados da análise de cpDNA, sugerem que a espécie T. cassinoides está dividida em três grupos filogeográficos: Norte, Central e Sul. Já os resultados de DNA nuclear apenas se diferenciam dos anteriores por considerar os grupos filogeográficos Norte e Central como um único grupo. Dados de modelagem de nicho ecológico foram gerados e associados com análises demográficas e de estruturação populacional visando um melhor entendimento dos padrões filogeográficos da espécie e inferências sobre a ocorrência de possíveis alterações populacionais ocorridas nos últimos 21 mil anos (Last Glacial Maximum - LGM) e 6 mil anos (Holocene Optimum - HO). Os resultados destas análises sugerem a estabilidade do tamanho populacional e das possíveis áreas de ocorrência de T. cassinoides no LGM e no HO. Assim, aventamos a hipótese de que a quebra de fluxo gênico entre as regiões filogeográficas propostas no presente estudo sejam anteriores ao LGM. Esse padrão converge com resultados encontrados para outras espécies de comunidades vegetais periféricas e diverge daqueles encontrados para espécies do núcleo principal da Floresta Ombrófila Densa, evidenciando a importância de estudos com espécies de diferentes comunidades vegetais da Floresta Atlântica para um melhor entendimento dos processos que moldaram a evolução das espécies nesse complexo bioma / The Atlantic Forest is one of the most biodiverse biomes on the planet. Nevertheless, little is known about the processes that have engendered such highly diverse plantlife in this region. Most studies on the Atlantic Forest approach the biome from an ample scope, without considering the various vegetational types that are found therein. Though broadly termed Montane Rain Forest, this biome also contains other peripheral forms of vegetation, such as Submontane Rain Forest, Cloud Forest, Riparian Rainforest, Rainforest Patches and Coastal Swamp Forest, commonly known as \"caxetais\" (plur). The term \"caxetal\" (sing) derives from the overwhelming predominance of Tabebuia cassinoides (Lam.) DC., the \"caxeta\". This naturally fragmented vegetational formation is found in patches on permanently waterlogged soils all the way from the north of Santa Catarina state up to northern most Espírito Santo. Populations with fragmented distribution are potential models for populational genetics studies, seen as the geographical delimitation of natural populations is one of the biggest problems facing research of this kind. In the light of this, the present thesis aims to: (1) verify how the aggregated, well-delimited and fragmented geographical distribution of the tree species T. cassinoides might influence the structuring of genetic diversity on a local level; (2) ascertain the degree of inter and intra-populational genetic variability in natural T. cassinoides populations throughout the Atlantic Forest, and (3) determine the phylogeographical structure of T. cassinoides. In order to achieve this we analyzed data for eight nuclear microsatellite markers and sequencing for the trnC-ycf6 region of plastidial DNA (cpDNA). The genetic data obtained was first used to generate knowledge concerning genetic diversity and populational structuring on a local level, in the Iguape (São Paulo state) region. Our results suggest that the fragmentation of these populations is geographical only, due to their edaphic needs, and that this locally aggregated and naturally fragmented mode of distribution does not indicate genetic subdivision. The characterization of inter and intra-populational genetic variability for T. cassinoides throughout its range of distribution, based on nuclear microsatellite markers, showed that the species has low levels of genetic diversity and that 61% of this diversity is encountered within, and 39% among, the populations. Furthermore, the results evince high and significant levels of correlation between genetic and geographic distance, thus suggesting that this isolation is distance-related. Our findings also indicate that the geographical region of Rio de Janeiro is the center of T. cassinoides diversity. Considerable genetic structuring was identified from the nuclear and plastidial DNA, though with partial distinctions. Results for cpDNA analysis suggest that T. cassinoides is divided into three phylogeographical groups: North, Central and South. Nuclear DNA analysis, however, took the Central and North phylogeographical groups to be one and the same. Ecological niche modeling data were generated and associated with demographic analyses and findings on populational structuring so that we could determine the species\' phylogeographical patterns and infer the occurrence of possible populational alterations during two distinct periods: 21 thousand years ago (the Last Glacial Minimum) and over the last 6 thousand years (Holocene Optimum - HO). The results of these analyses suggest that population sizes remained stable in possible areas of occurrence during the LGM and HO. Based on these findings we suggest the hypotheses that the stemming of gene flow among the phylogeographical regions proposed by this study predates the LGM. This pattern converges with results found for other species of peripheral vegetal communities but diverges from those for species from the Dense Coastal Hydrophilic Forest nucleus. As such, our research underscores the importance of further studies with different vegetal communities that comprise the Atlantic Forest in order to foster a better understanding of the processes that shaped the evolution of species in this complex biome

A Mata Atlântica representa um dos Biomas mais diversos do Planeta. No entanto, ainda pouco se sabe sobre os processos que levaram à alta diversidade de plantas nesta região. A maior parte dos estudos na Mata Atlântica trata este Bioma de forma ampla, sem considerar os diversos tipos vegetacionais encontrados na região. Apesar de ser dominado pela Floresta Pluvial Montana, este Bioma ainda inclui outros tipos vegetacionais periféricos, tais como: as Florestas Pluviais Baixo Montanas, Florestas Pluviais de Altitude, Florestas Pluviais Ripária, Florestas Pluviais em Manchas e as Florestas Paludosas Litorâneas, popularmente conhecidas como \"caxetais\". O nome \"caxetal\" foi dado devido à predominância da espécie Tabebuia Cassinoides (Lam.) DC., a qual é popularmente conhecida como \"caxeta\". Esta formação vegetal tem distribuição restrita a áreas com solos permanentemente encharcados do norte de Santa Catarina até o norte do Espírito Santo, onde ocorre de forma naturalmente fragmentada, formando ilhas ao longo de sua extensão de ocorrência. Populações com distribuição fragmentada são modelos em potencial para estudos de genética de populações, visto que a delimitação geográfica de populações naturais é um dos maiores problemas para estudos dessa natureza. Diante desse cenário, a presente tese teve como objetivo: (1) verificar como a distribuição geográfica da espécie arbórea T. cassinoides, agregada, bem delimitada e fragmentada na paisagem, pode influenciar na estruturação da diversidade genética em nível local; (2) caracterizar o grau de variabilidade genética inter e intrapopulacional em populações naturais de T. cassinoides ao longo da Mata Atlântica; e, (3) determinar a estrutura filogeográfica de T. cassinoides. Para tanto foram analisados dados de oito marcadores de microssatélites nucleares, além do sequenciamento da região trnC-ycf6 do DNA plastidial (cpDNA). Os dados genéticos obtidos foram primeiramente utilizados para o conhecimento da diversidade genética e estruturação da população em nível local, na região de Iguape (SP). Nossos resultados sugerem que a fragmentação dessas populações é somente geográfica, devido a suas necessidades edáficas, bem como que o modo de distribuição agregada e naturalmente fragmentada não indica a subdivisão genética das mesmas. A caracterização da variabilidade genética inter e intra-populacional em populações naturais de T. cassinoides ao longo de toda sua área de distribuição, com base nos marcadores de microssatélites nucleares indicou que a espécie possui baixos níveis de diversidade genética, e que 61% dessa diversidade é encontrada dentro das populações e 39% entre elas. Além disso, estes resultados evidenciaram significativos níveis de correlação entre distância genética e distância geográfica, sugerindo assim a presença de isolamento por distância. Nossos resultados indicam ainda a região geográfica do Rio de Janeiro como centro de diversidade para T. cassinoides. Uma forte estruturação genética foi encontrada para os dados de DNA nuclear e plastidial. Os resultados da análise de cpDNA, sugerem que a espécie T. cassinoides está dividida em três grupos filogeográficos: Norte, Central e Sul. Já os resultados de DNA nuclear apenas se diferenciam dos anteriores por considerar os grupos filogeográficos Norte e Central como um único grupo. Dados de modelagem de nicho ecológico foram gerados e associados com análises demográficas e de estruturação populacional visando um melhor entendimento dos padrões filogeográficos da espécie e inferências sobre a ocorrência de possíveis alterações populacionais ocorridas nos últimos 21 mil anos (Last Glacial Maximum - LGM) e 6 mil anos (Holocene Optimum - HO). Os resultados destas análises sugerem a estabilidade do tamanho populacional e das possíveis áreas de ocorrência de T. cassinoides no LGM e no HO. Assim, aventamos a hipótese de que a quebra de fluxo gênico entre as regiões filogeográficas propostas no presente estudo sejam anteriores ao LGM. Esse padrão converge com resultados encontrados para outras espécies de comunidades vegetais periféricas e diverge daqueles encontrados para espécies do núcleo principal da Floresta Ombrófila Densa, evidenciando a importância de estudos com espécies de diferentes comunidades vegetais da Floresta Atlântica para um melhor entendimento dos processos que moldaram a evolução das espécies nesse complexo bioma / The Atlantic Forest is one of the most biodiverse biomes on the planet. Nevertheless, little is known about the processes that have engendered such highly diverse plantlife in this region. Most studies on the Atlantic Forest approach the biome from an ample scope, without considering the various vegetational types that are found therein. Though broadly termed Montane Rain Forest, this biome also contains other peripheral forms of vegetation, such as Submontane Rain Forest, Cloud Forest, Riparian Rainforest, Rainforest Patches and Coastal Swamp Forest, commonly known as \"caxetais\" (plur). The term \"caxetal\" (sing) derives from the overwhelming predominance of Tabebuia cassinoides (Lam.) DC., the \"caxeta\". This naturally fragmented vegetational formation is found in patches on permanently waterlogged soils all the way from the north of Santa Catarina state up to northern most Espírito Santo. Populations with fragmented distribution are potential models for populational genetics studies, seen as the geographical delimitation of natural populations is one of the biggest problems facing research of this kind. In the light of this, the present thesis aims to: (1) verify how the aggregated, well-delimited and fragmented geographical distribution of the tree species T. cassinoides might influence the structuring of genetic diversity on a local level; (2) ascertain the degree of inter and intra-populational genetic variability in natural T. cassinoides populations throughout the Atlantic Forest, and (3) determine the phylogeographical structure of T. cassinoides. In order to achieve this we analyzed data for eight nuclear microsatellite markers and sequencing for the trnC-ycf6 region of plastidial DNA (cpDNA). The genetic data obtained was first used to generate knowledge concerning genetic diversity and populational structuring on a local level, in the Iguape (São Paulo state) region. Our results suggest that the fragmentation of these populations is geographical only, due to their edaphic needs, and that this locally aggregated and naturally fragmented mode of distribution does not indicate genetic subdivision. The characterization of inter and intra-populational genetic variability for T. cassinoides throughout its range of distribution, based on nuclear microsatellite markers, showed that the species has low levels of genetic diversity and that 61% of this diversity is encountered within, and 39% among, the populations. Furthermore, the results evince high and significant levels of correlation between genetic and geographic distance, thus suggesting that this isolation is distance-related. Our findings also indicate that the geographical region of Rio de Janeiro is the center of T. cassinoides diversity. Considerable genetic structuring was identified from the nuclear and plastidial DNA, though with partial distinctions. Results for cpDNA analysis suggest that T. cassinoides is divided into three phylogeographical groups: North, Central and South. Nuclear DNA analysis, however, took the Central and North phylogeographical groups to be one and the same. Ecological niche modeling data were generated and associated with demographic analyses and findings on populational structuring so that we could determine the species\' phylogeographical patterns and infer the occurrence of possible populational alterations during two distinct periods: 21 thousand years ago (the Last Glacial Minimum) and over the last 6 thousand years (Holocene Optimum - HO). The results of these analyses suggest that population sizes remained stable in possible areas of occurrence during the LGM and HO. Based on these findings we suggest the hypotheses that the stemming of gene flow among the phylogeographical regions proposed by this study predates the LGM. This pattern converges with results found for other species of peripheral vegetal communities but diverges from those for species from the Dense Coastal Hydrophilic Forest nucleus. As such, our research underscores the importance of further studies with different vegetal communities that comprise the Atlantic Forest in order to foster a better understanding of the processes that shaped the evolution of species in this complex biome

Thesis (PhD (Plant Biotechnology))--University of Stellenbosch, 2010. / ENGLISH ABSTRACT: Virus Induced Gene Silencing (VIGS) was optimized to allow for the study of starch metabolism. The plastidial inorganic pyrophosphatase gene, for which a mutant has never been identified, was studied using VIGS and it was found to have a broad role in this subcellular compartment. The accumulation of inorganic pyrophosphate limited the production of starch, carotenoids, chlorophyll, and increased the plants susceptibility to drought stress. These effects highlight the importance of this enzyme in maintaining a low intraplastidial concentration of PPi providing an environment which facilitates these anabolic processes. Several genes involved in starch synthesis and degradation were also targeted with the aim of establishing a system of multiple gene silencing for the study of metabolic pathways. One, two and three genes were successfully silenced using this system which was validated based on previously published data. Interestingly, simultaneous silencing of the two isoforms of disproportionating enzyme led to a novel phenotype as a large reduction in starch instead of the expected increase was observed. / No Afrikaans abstract available

O presente trabalho analisou as etapas de formação de rudimentos seminais e grãos de pólen de Passiflora elegans e P. haematostigma. As espécies foram analisadas fazendo-se o uso de microscopia fotônica e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O gineceu apresenta um estigma com emergências estigmáticas, estilete sólido e ovário tricarpelar e unilocular. O ovário apresenta inúmeros rudimentos seminais que formam-se a partir de divisões periclinais da camada central. Os rudimentos são crassinucelados e os tegumentos têm origem dérmica. A célula arquesporial divide-se mitoticamente antes da meiose. A meiose resulta em uma tétrade linear, com ginósporo calazal viável. A ginogametogênese é do tipo Poligonum e, durante a diferenciação do ginófito, os estratos parietais do nucelo são parcialmente consumidos e a epiderme nucelar divide-se periclinalmente na porção apical. As antípodas são efêmeras e o ginófito maduro apresenta duas sinérgides com aparelho fibrilar desenvolvido, oosfera e núcleo secundário no pólo micropilar. O rudimento seminal é anátropo, arilado, bitegumentado e com micrópila em “zig-zag”. O androceu é constituído por cinco anteras tetrasporangiadas. Os estratos parietais desenvolvem-se do tipo Dicotiledôneo e as camadas médias são persistentes na antera madura de P. haematostigma. As células do tapete são poliplóides e colapsam liberando os conteúdos no interior do lóculo. A citocinese é do tipo simultânea e as tétrades são tetraédricas na maioria. O pólen é liberado na fase bicelular, apresenta número de colpos variável em P. elegans e seis colporos em P. haematostigma. A esporoderme não apresenta camada basal em P. elegans e é mais espessa do que em P. haematostigma. Plastídios e mitocôndrias são englobados durante a formação da célula generativa e persistem até a fase de pólen maduro. / The present work analyzed the different developmental stages of the ovule and of the pollen grain in Passiflora elegans and P. haematostigma. The species were analyzed using photonic microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The gynoecium has a stigma with stigmatic outgrowths, solid style and tricarpelar and unilocular ovary. The ovary has several seminal rudiments that are originated from the periclinal divisions of the central layer. The ovule is crassinucelate and the dermal layer originates the integuments. The arquesporial cell divides mitotically before meiosis. The meiosis results into a linear tetrad and only the chalazal gynospore is viable. The gynogametogenesis is of the Poligonum type, the nucellus parietal layers are partially degraded during the gynophyte differentiation, and nuclear epidermis divides periclinally in the apical portion. The antipodal cells are ephemeral and the mature gynophyte has two synergids with a developed filiform apparatus, egg cell and secondary nuclei in the micropilar pole. The ovule is anatropous, arillate, bitegmic and with zig-zag micropile. The androecium is constituted of five tetrasporangiate anthers. The parietal layers develop like the Dicotiledoneous type and middle layers are persistent in the mature anther of P. haematostigma. The tapetal cells are polyploids and collapse releasing their contents to the locus. The cytokinesis is of the simultaneous type and most of the tetrads are tetrahedral. The pollen is released during the bicellular stage, has a variable number of colpus in P. elegans and six colporus in P. haematostigma. The sporoderm does not have a basal layer in P. elegans and is thicker than in P. haematostigma. Plastids and mitochondria are enclosed during the generative cell formation and persist until the mature pollen stage.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4533.pdf: 2866936 bytes, checksum: a3b1ef75c45a68a6305453e240c9d466 (MD5) Previous issue date: 2012-05-18 / Universidade Federal de Minas Gerais / PILOSOCEREUS AURISETUS is a taxonomic group composed by eight columnar cacti species occurring on rock outcrops in xeric environments. As other xerophitic species found outside the Caatinga domain, the species populations of P. AURISETUS group exhibit a disjunct distribution pattern within the Cerrado domain in central and eastern Brazil. Such a distribution pattern may have resulted from long-distance dispersal events or fragmentation of a more extensive distribution in the past. The main goal of this work was identify demographic events that possibly shaped the evolutionary history of the group and resulted in the current biogeographic pattern. In the present work, phylogenetic analyses and phylogeographical inferences were implemented using the nucleotide variation of plastid genomic sequences. The phylogenetic analyses showed the absence of reciprocal monophyly for great part of the species and the occurring of quite divergent species from the others of the group: P. jauruensis, P. aureispinus e P. bohlei. In addition, P. machrisii populations formed two distinct clades highly supported by the phylogeny which partly agree with the geographic distribution of the species (north and central-south). Population analyses and phylogeographical inferences allowed the identification of the diversification origin of the group and the possible expansion and fragmentation events which determined the evolutionary pathway of the populations. The genetic variability level and the genetic structure observed alongside the current distribution pattern of the populations and biological information about the species suggest that fragmentation events were the main responsible for the biogeographical pattern of the group, which should be related to the palioclimatic oscillations of the Quaternary. / PILOSOCEREUS AURISETUS é um grupo taxonômico composto por oito espécies de cactos colunares que ocorrem associadas a afloramentos rochosos em ambientes xéricos. Assim como outras espécies xerófitas encontradas fora do domínio da Caatinga, as populações das espécies do grupo P. AURISETUS exibem um padrão de distribuição descontínua dentro do domínio Cerrado no centro e leste do Brasil. Esse padrão de distribuição pode ser resultado de eventos de dispersão a longa distância ou de fragmentação de uma distribuição mais extensa no passado. O objetivo principal desse trabalho foi identificar eventos demográficos que possivelmente moldaram a história evolutiva do grupo e resultaram no padrão biogeográfico atual. No presente trabalho foram realizadas análises filogenéticas e inferências filogeográficas a partir da variação nucleotídica de sequências do genoma plastidial. As análises filogenéticas demonstraram que a maior parte das espécies do grupo não apresenta monofilia recíproca de seus haplótipos e que o grupo abrange três espécies bastante divergentes das demais: P. jauruensis, P. aureispinus e P. bohlei. Adicionalmente, as populações da espécie P. machrisii formaram dois clados distintos e bem suportados na filogenia, os quais concordam parcialmente com a distribuição geográfica da espécie (norte e centro-sul). As análises populacionais e as inferências filogeográficas permitiram inferir a origem da diversificação do grupo e os possíveis eventos de expansão e fragmentação que determinaram o caminho evolutivo das populações. Os níveis de variabilidade genética e estruturação observados, juntamente com o padrão atual de distribuição das populações e informações sobre a biologia das espécies, sugerem que eventos de fragmentação foram os principais responsáveis pelo padrão biogeográfico do grupo, os quais devem estar relacionados às oscilações palioclimáticas do Quaternário.

O presente trabalho analisou as etapas de formação de rudimentos seminais e grãos de pólen de Passiflora elegans e P. haematostigma. As espécies foram analisadas fazendo-se o uso de microscopia fotônica e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O gineceu apresenta um estigma com emergências estigmáticas, estilete sólido e ovário tricarpelar e unilocular. O ovário apresenta inúmeros rudimentos seminais que formam-se a partir de divisões periclinais da camada central. Os rudimentos são crassinucelados e os tegumentos têm origem dérmica. A célula arquesporial divide-se mitoticamente antes da meiose. A meiose resulta em uma tétrade linear, com ginósporo calazal viável. A ginogametogênese é do tipo Poligonum e, durante a diferenciação do ginófito, os estratos parietais do nucelo são parcialmente consumidos e a epiderme nucelar divide-se periclinalmente na porção apical. As antípodas são efêmeras e o ginófito maduro apresenta duas sinérgides com aparelho fibrilar desenvolvido, oosfera e núcleo secundário no pólo micropilar. O rudimento seminal é anátropo, arilado, bitegumentado e com micrópila em “zig-zag”. O androceu é constituído por cinco anteras tetrasporangiadas. Os estratos parietais desenvolvem-se do tipo Dicotiledôneo e as camadas médias são persistentes na antera madura de P. haematostigma. As células do tapete são poliplóides e colapsam liberando os conteúdos no interior do lóculo. A citocinese é do tipo simultânea e as tétrades são tetraédricas na maioria. O pólen é liberado na fase bicelular, apresenta número de colpos variável em P. elegans e seis colporos em P. haematostigma. A esporoderme não apresenta camada basal em P. elegans e é mais espessa do que em P. haematostigma. Plastídios e mitocôndrias são englobados durante a formação da célula generativa e persistem até a fase de pólen maduro. / The present work analyzed the different developmental stages of the ovule and of the pollen grain in Passiflora elegans and P. haematostigma. The species were analyzed using photonic microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The gynoecium has a stigma with stigmatic outgrowths, solid style and tricarpelar and unilocular ovary. The ovary has several seminal rudiments that are originated from the periclinal divisions of the central layer. The ovule is crassinucelate and the dermal layer originates the integuments. The arquesporial cell divides mitotically before meiosis. The meiosis results into a linear tetrad and only the chalazal gynospore is viable. The gynogametogenesis is of the Poligonum type, the nucellus parietal layers are partially degraded during the gynophyte differentiation, and nuclear epidermis divides periclinally in the apical portion. The antipodal cells are ephemeral and the mature gynophyte has two synergids with a developed filiform apparatus, egg cell and secondary nuclei in the micropilar pole. The ovule is anatropous, arillate, bitegmic and with zig-zag micropile. The androecium is constituted of five tetrasporangiate anthers. The parietal layers develop like the Dicotiledoneous type and middle layers are persistent in the mature anther of P. haematostigma. The tapetal cells are polyploids and collapse releasing their contents to the locus. The cytokinesis is of the simultaneous type and most of the tetrads are tetrahedral. The pollen is released during the bicellular stage, has a variable number of colpus in P. elegans and six colporus in P. haematostigma. The sporoderm does not have a basal layer in P. elegans and is thicker than in P. haematostigma. Plastids and mitochondria are enclosed during the generative cell formation and persist until the mature pollen stage.

O presente trabalho analisou as etapas de formação de rudimentos seminais e grãos de pólen de Passiflora elegans e P. haematostigma. As espécies foram analisadas fazendo-se o uso de microscopia fotônica e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O gineceu apresenta um estigma com emergências estigmáticas, estilete sólido e ovário tricarpelar e unilocular. O ovário apresenta inúmeros rudimentos seminais que formam-se a partir de divisões periclinais da camada central. Os rudimentos são crassinucelados e os tegumentos têm origem dérmica. A célula arquesporial divide-se mitoticamente antes da meiose. A meiose resulta em uma tétrade linear, com ginósporo calazal viável. A ginogametogênese é do tipo Poligonum e, durante a diferenciação do ginófito, os estratos parietais do nucelo são parcialmente consumidos e a epiderme nucelar divide-se periclinalmente na porção apical. As antípodas são efêmeras e o ginófito maduro apresenta duas sinérgides com aparelho fibrilar desenvolvido, oosfera e núcleo secundário no pólo micropilar. O rudimento seminal é anátropo, arilado, bitegumentado e com micrópila em “zig-zag”. O androceu é constituído por cinco anteras tetrasporangiadas. Os estratos parietais desenvolvem-se do tipo Dicotiledôneo e as camadas médias são persistentes na antera madura de P. haematostigma. As células do tapete são poliplóides e colapsam liberando os conteúdos no interior do lóculo. A citocinese é do tipo simultânea e as tétrades são tetraédricas na maioria. O pólen é liberado na fase bicelular, apresenta número de colpos variável em P. elegans e seis colporos em P. haematostigma. A esporoderme não apresenta camada basal em P. elegans e é mais espessa do que em P. haematostigma. Plastídios e mitocôndrias são englobados durante a formação da célula generativa e persistem até a fase de pólen maduro. / The present work analyzed the different developmental stages of the ovule and of the pollen grain in Passiflora elegans and P. haematostigma. The species were analyzed using photonic microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The gynoecium has a stigma with stigmatic outgrowths, solid style and tricarpelar and unilocular ovary. The ovary has several seminal rudiments that are originated from the periclinal divisions of the central layer. The ovule is crassinucelate and the dermal layer originates the integuments. The arquesporial cell divides mitotically before meiosis. The meiosis results into a linear tetrad and only the chalazal gynospore is viable. The gynogametogenesis is of the Poligonum type, the nucellus parietal layers are partially degraded during the gynophyte differentiation, and nuclear epidermis divides periclinally in the apical portion. The antipodal cells are ephemeral and the mature gynophyte has two synergids with a developed filiform apparatus, egg cell and secondary nuclei in the micropilar pole. The ovule is anatropous, arillate, bitegmic and with zig-zag micropile. The androecium is constituted of five tetrasporangiate anthers. The parietal layers develop like the Dicotiledoneous type and middle layers are persistent in the mature anther of P. haematostigma. The tapetal cells are polyploids and collapse releasing their contents to the locus. The cytokinesis is of the simultaneous type and most of the tetrads are tetrahedral. The pollen is released during the bicellular stage, has a variable number of colpus in P. elegans and six colporus in P. haematostigma. The sporoderm does not have a basal layer in P. elegans and is thicker than in P. haematostigma. Plastids and mitochondria are enclosed during the generative cell formation and persist until the mature pollen stage.

Un des principaux acteurs impliqués dans la régulation du statut redox intracellulaire, permettant aux plantes de s’adapter aux contraintes environnementales, est une famille multigénique de petites (12-14 kDa) oxydoréductases ubiquistes appelées thiorédoxines (TRX). Le génome d’Arabidopsis code une vingtaine de TRX canoniques dont neuf sont plastidiales (TRX f, m, x et y). Très étudiées dans notre laboratoire par des approches biochimiques, les TRX de types f et m apparaissent réguler majoritairement l’activité d’enzymes impliquées dans le métabolisme primaire tandis que les types x et y servir principalement de substrats réducteurs d’enzymes antioxydantes. Plus récemment, une dixième TRX, proposée plastidiale et nommée TRX z, a été identifiée. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé cette nouvelle TRX chloroplastique montrant des propriétés physico-chimiques inhabituelles, la rendant unique. En effet, la TRX z semble interagir, via des interactions électrostatiques, avec des protéines pour former des complexes de masses moléculaires élevées, potentiellement liés aux acides nucléiques. De plus, la TRX z, dont l’expression est induite à la lumière, principalement dans les tissus photosynthétiques, est la première TRX chloroplastique qui n’est pas réduite par le système FTR à la lumière mais qui peut être réduite par les autres TRX plastidiales, suggérant une interconnexion entre ces différentes TRX. D’autre part, une recherche exhaustive de cibles de la TRX z, par deux approches spécifiques et complémentaires (protéomique et double hybride), ont révélé 90 cibles putatives de la TRX z. La plupart de ces cibles, jamais identifiées comme cibles des TRX, sont impliquées dans la réponse de défense des plantes mise en place lors de stress biotiques. Ces résultats suggèrent que la TRX z pourrait être un élément clé dans la mise en place de ces réponses. L’analyse fonctionnelle préliminaire de la TRX z au cours de la réponse immune innée conforte cette hypothèse. L’ensemble de ces résultats indique que la TRX z pourrait jouer le rôle d’une protéine senseur de l’état d’oxydoréduction de la cellule. / One of the main actors involved in regulation of the cellular redox state, which allow plant adaptation to stress environmental conditions, is a multigenic family of small (12-14 kDa) ubiquitous oxidoreductases named thioredoxins (TRX). Arabidopsis encodes around twenty canonical TRX, including nine plastidial isoforms (TRX f, m, x and y). Extensively studied in our laboratory by biochemical approaches, TRX f and m was found to mainly redox regulate the activity of enzymes involved in the primary metabolism whereas TRX x and y serve as reducing substrates for antioxidant enzymes. More recently, a tenth TRX, predicted plastidial and named TRX z, was identified. During my PhD, I have characterized this new plastidial TRX showing unusual physicochemical properties, making it unique. Indeed, TRX z seems to interact, via electrostatic bonds, with proteins to form high molecular weight complexes, potentially linked to nucleic acids. Moreover, TRX z, which is expressed in green tissues in the light, is the first plastidial TRX which is not reduced by the FTR system but which can be reduced by other plastidial TRX, suggesting an interconnection between these TRX. Furthermore, a large scale inventory of TRX z targets, by two specific and complementary approaches (proteomic and yeast two hybrid), revealed 90 putative TRX z targets. Most of these, which have never been identified as TRX targets before, are implicated in plant defense response to biotic stresses. These results suggest that TRX z might be a key player in these responses. Preliminary functional analysis of TRX z during immune innate response reinforces this hypothesis. Altogether, these results indicate that TRX z appears as an important sensor of the redox status of the cell.

JEREISSATI, Camila Barbosa Pinheiro. Análise proteômica de plastídeos do endosperma de sementes em desenvolvimento de pinhão manso (Jatropha curcas L.). 2015. 127 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Vitor Campos (vitband@gmail.com) on 2016-09-01T22:55:24Z No. of bitstreams: 1 2015_teses_cbpjereissati.pdf: 1568499 bytes, checksum: 2f41598abfda8cf6bcab51817b1b742a (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T21:06:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_teses_cbpjereissati.pdf: 1568499 bytes, checksum: 2f41598abfda8cf6bcab51817b1b742a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T21:06:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_teses_cbpjereissati.pdf: 1568499 bytes, checksum: 2f41598abfda8cf6bcab51817b1b742a (MD5) Previous issue date: 2015 / Jatropha curcas L. is a plant native to America and belongs to the Euphorbiaceae family. Currently it is gaining economical interest mainly because it is an oilseed crop with potential to produce biodiesel. However, presence of phorbol esters (a class of diterpenes) that are the major toxic constituents of the seeds, limits a better usage of the plant, by making the use of the residue, obtained after the oil extraction from the seeds, unfeasible for animal feed, due to its pro-carcinogenic activity and inflammatory action. Proteomic analysis of the plastids isolated from developing seeds of Jatropha is important because the synthesis of fatty acid as well as phorbol esters, the two most attractive compounds in the study of Jatropha curcas, occur in plastids. Proteomic analysis of this organelle is crucial to better understand and explore not only the biosynthetic pathway of these two compounds but other metabolic pathways , and addtionaly providing foundation for researchs that aimed to develope genotypes with more suitable characteristics for industrial applications. In this study, we performed a proteomic analysis of plastids isolated from the endosperm of developing Jatropha curcas seeds that were in the initial stage of deposition of protein and lipid reserves. Proteins extracted from the plastids were digested with trypsin, and the peptides were applied to an EASY-nano LC system coupled online to an ESI-LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer, and this led to the identification of 1103 proteins representing 804 protein groups, of which 923 were considered as true identifications, and this considerably expands the repertoire of J. curcas proteins identified so far. Of the identified proteins, only five are encoded in the plastid genome, and none of them are involved in photosynthesis, evidentiating the nonphotosynthetic nature of the isolated plastids. Homologues for 824 out of 923 identified proteins were present in three different plastids proteins databases i.e. PPDB, SUBA and PlProt, while homologues for 13 proteins were not found in any of these three databases but were marked as plastidial by at least one of the three prediction programs used (TargetP, ChloroP and PlantMPloc). Functional classification showed that proteins belonging to amino acids metabolism comprise the main functional class, followed by carbohydrate, energy, and lipid metabolisms. The small and large subunits of Rubisco were identified, and their presence in plastids is considered to be an adaptive feature counterbalancing for the loss of one-third of the carbon as CO2 as a result of the conversion of carbohydrate to oil through glycolysis. While several enzymes involved in the biosynthesis of several precursors of diterpenoids were identified, we were unable to identify any terpene synthase/cyclase, which suggests that the plastids isolated from the endosperm of developing seeds do not synthesize phorbol esters. In conclusion, this study provides insights into the major biosynthetic pathways and certain unique features of the plastids from the endosperm of developing seeds at the whole proteome level. / O pinhão manso (Jatropha curcas L.) é uma planta nativa da América, pertencente à família Euphorbiaceae. Atualmente, ela desperta interesse econômico principalmente por se tratar de uma oleaginosa com potencial para a produção de biodiesel. Entretanto, a presença de ésteres de forbol (uma classe de diterpeno), que são os principais constituintes tóxicos das sementes, limita uma melhor utilização dessa planta, por inviabilizar o uso do resíduo de extração do óleo das sementes na alimentação animal, bem como, por apresentar atividade pró-carcinogênica e ação inflamatória. A análise proteômica de plastídeos, isolados de sementes em desenvolvimento de pinhão manso, é uma importante vertente de estudo, pois tanto a síntese de ácidos graxos como dos ésteres de forbol, os dois compostos mais atrativos no estudo de Jatropha curcas, ocorrem nos plastídeos. O estudo proteômico dessa organela torna-se crucial para melhor compreender e explorar não somente as vias biossintéticas desses dois compostos, como de outras vias metabólicas, além de proporcionar um conjunto de dados que pode ser utilizado em pesquisas voltadas para o desenvolvimento de genótipos com características mais adequadas para aplicações industriais. No presente trabalho, realizou-se uma análise proteômica de plastídeos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento do pinhão manso, que estavam nos estágios iniciais de deposição de lipídios e proteínas de reserva (25-30DAA), confirmados por meio de análises histológica e histoquímica. As proteínas extraídas dos plastídeos foram digeridas com tripsina e os peptídeos foram aplicados no sistema de nano-LC EASYII acoplado online ao espectrômetro de massa nano ESI LTQ-Orbitrap velos, o que resultou na identificação 1103 proteínas, representando 804 grupos de proteínas, dos quais 923 foram consideradas identificações verdadeiras. Isso expandiu consideravelmente o repertório de proteínas do pinhão manso até agora identificas. Dentre as proteínas identificadas, apenas 5 são codificadas pelo genoma plastidial, e nenhuma delas está envolvida na fotossíntese, o que evidencia a natureza não fotossintética dos plastídeos isolados. Homólogos de 824, dentre as 923 proteínas identificadas, estavam presentes nos bancos de dados PPDB, SUBA e PlProt, enquanto homólogos para 13 proteínas não foram encontrados em nenhum dos três bancos de dados plastidiais, mas foram detectados como plastidiais por pelo menos um dos três programas de predição de localização subcelular utilizados (TargetP, ChloroP, PlantMPloc). A classificação funcional mostrou que a maioria das proteínas identificadas pertencia ao metabolismo dos aminoácidos, seguido dos metabolismos dos carboidratos, energético e dos lipídios. As subunidades maiores e menores da Rubisco foram identificadas, e sua presença nos plastídeos foi considerada uma característica adaptativa para contrabalancear a perda de um terço do carbono na forma de CO2 como um resultado da conversão de carboidratos em óleo através da glicólise. Apesar de enzimas envolvidas na biossíntese de diversos precursores dos diterpenóides terem sido identificadas, não foi detectado nenhuma terpeno sintase/ciclase, o que sugere que os plastídeos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento não sintetizam ésteres de forbol, apesar de uma grande quantidade desse composto ser encontrada neste tecido. Como conclusão, o presente trabalho proporciona insights sobre as principais vias biossíntéticas, e sobre características peculiares dos plastideos isolados do endosperma de sementes em desenvolvimento.