Protozoários do gênero Trypanosoma infectam milhões de pessoas todo ano e coletivamente contribuem muito para as misérias humanas, pois são causa de muitas das doenças negligenciadas tropicais. Várias vias metabólicas essenciais são encontradas nesses parasitas tornando-os particularmente atrativos para investigações moleculares. Mecanismos de controle pós-transcricional tem sido alvo de estudo por sua peculiaridade nesses organismos. Nesse cenário, proteínas da classe das poli-A-binding proteins (PABP) possuem função no início da tradução, turnover do mRNA e interação com o 5´-CAP. Nesse trabalho foi identificada a homóloga poli-A binding protein 1 (PABP1) de Trypanosoma brucei. O silenciamento do gene pabp1 revelou que a ausência da proteína é letal ao parasita, comprovando sua essencialidade nesse organismo. Da mesma maneira, na ausência da proteína observou-se erro no processamento do mRNA sugerindo possível função nos eventos de cis e trans splicing. Sua localização subcelular foi avaliada indicando localização citoplasmática, bem como o são suas homólogas. No citoplasma, a proteína apresenta-se em estrutura reticulada, co-localizada com proteínas de retículo endoplasmático. Porém, sob estresse induzido a proteína relocaliza para o compartimento nuclear, indicando ser uma proteína com trânsito núcleo-citoplasma ainda não demonstrada na literatura. As funções identificadas sugerem a existência de um sub-complexo a 3´ do mRNA que acopla poliadenilação e splicing. Além disso, a relocalização nuclear parece ocorrer em resposta a estímulo externo, sugerindo que a relocalização do mRNA para o núcleo pode ser uma estratégia da célula para modular sua resposta gênica frente a variações do ambiente. / Protozoa of the genus Trypanosoma infect millions of people every year and collectively contribute to the human misery by causing several neglected tropical diseases. Several intriguing molecular pathways are found in these parasites also, rendering them particularly attractive for biochemical investigation. This unique eukaryotic cells lack mechanisms to control gene expression at the transcriptional level, they mostly control protein synthesis by posttranscriptional regulation process. Several RNAs and proteins are involved in this process, including poly(A) binding proteins. The poly(A)- binding protein of eukaryotes plays a role in polyadenylation, translation initiation and metabolism of mRNA. In this work the poly(A) binding protein 1 (PABP1) was identified in Trypanosoma brucei. Depletion of TbPABP1 showed its essential role in the procyclic form of the parasite. Immunofluorescence assays showed localization in the cytosolic compartment despite of its functions in cis and trans splicing as shown by RNA analysis of cells free from PABP1. As it was shown in the homologs, PABP1 it´s not only a cytosolic protein but it shuttles between the nucleus and the cytoplasm. Together with the literature, these results suggest an active complex in the 3´ end of the mRNA which works in synchrony with the splicing and capping machinery implying PABP1 as possible link between these processes.

Protozoários do gênero Trypanosoma infectam milhões de pessoas todo ano e coletivamente contribuem muito para as misérias humanas, pois são causa de muitas das doenças negligenciadas tropicais. Várias vias metabólicas essenciais são encontradas nesses parasitas tornando-os particularmente atrativos para investigações moleculares. Mecanismos de controle pós-transcricional tem sido alvo de estudo por sua peculiaridade nesses organismos. Nesse cenário, proteínas da classe das poli-A-binding proteins (PABP) possuem função no início da tradução, turnover do mRNA e interação com o 5´-CAP. Nesse trabalho foi identificada a homóloga poli-A binding protein 1 (PABP1) de Trypanosoma brucei. O silenciamento do gene pabp1 revelou que a ausência da proteína é letal ao parasita, comprovando sua essencialidade nesse organismo. Da mesma maneira, na ausência da proteína observou-se erro no processamento do mRNA sugerindo possível função nos eventos de cis e trans splicing. Sua localização subcelular foi avaliada indicando localização citoplasmática, bem como o são suas homólogas. No citoplasma, a proteína apresenta-se em estrutura reticulada, co-localizada com proteínas de retículo endoplasmático. Porém, sob estresse induzido a proteína relocaliza para o compartimento nuclear, indicando ser uma proteína com trânsito núcleo-citoplasma ainda não demonstrada na literatura. As funções identificadas sugerem a existência de um sub-complexo a 3´ do mRNA que acopla poliadenilação e splicing. Além disso, a relocalização nuclear parece ocorrer em resposta a estímulo externo, sugerindo que a relocalização do mRNA para o núcleo pode ser uma estratégia da célula para modular sua resposta gênica frente a variações do ambiente. / Protozoa of the genus Trypanosoma infect millions of people every year and collectively contribute to the human misery by causing several neglected tropical diseases. Several intriguing molecular pathways are found in these parasites also, rendering them particularly attractive for biochemical investigation. This unique eukaryotic cells lack mechanisms to control gene expression at the transcriptional level, they mostly control protein synthesis by posttranscriptional regulation process. Several RNAs and proteins are involved in this process, including poly(A) binding proteins. The poly(A)- binding protein of eukaryotes plays a role in polyadenylation, translation initiation and metabolism of mRNA. In this work the poly(A) binding protein 1 (PABP1) was identified in Trypanosoma brucei. Depletion of TbPABP1 showed its essential role in the procyclic form of the parasite. Immunofluorescence assays showed localization in the cytosolic compartment despite of its functions in cis and trans splicing as shown by RNA analysis of cells free from PABP1. As it was shown in the homologs, PABP1 it´s not only a cytosolic protein but it shuttles between the nucleus and the cytoplasm. Together with the literature, these results suggest an active complex in the 3´ end of the mRNA which works in synchrony with the splicing and capping machinery implying PABP1 as possible link between these processes.

O hormônio tireotrófico (TSH) é o principal regulador da síntese e da secreção dos hormônios tireoidianos (HTs), os quais exercem um mecanismo de feedback negativo na hipófise reduzindo a síntese das cadeias <font face=\"Symbol\">&#946 e <font face=\"Symbol\">&#945 (CGA - Glycoprotein hormones Alpha Chain) por meio de mecanismos que envolvem modificações na transcrição de genes que codificam essas proteínas (ações genômicas). Na última década tem aumentado o número de evidências de que, em paralelo as ações genômicas clássicas, algumas ações dos HTs são desencadeadas na presença de inibidores da transcrição gênica e em curto espaço de tempo (segundos a minutos), caracterizando-se assim as ações não genômicas dos HTs. Este trabalho tem como foco avaliar a possibilidade de que os HTs regulem a expressão desses genes não genomicamente. Para tal avaliamos as alterações decorrentes do hipotiroidismo, seguido ou não do tratamento agudo com T3 em dose fisiológica ou saturante, sobre o grau de poliadenilação e a expressão do mRNA das subunidades alfa (CGA) e <font face=\"Symbol\">&#946TSH, bem como sua repercussão sobre a síntese e secreção de <font face=\"Symbol\">&#946TSH. Através da metodologia de PCR em Tempo Real observamos nos animais tireoidectomizados tratados com salina (Tx) um aumento de 10 e 4 vezes no conteúdo de mRNA do <font face=\"Symbol\">&#946TSH e CGA, respectivamente, e na razão <font face=\"Symbol\">&#946TSH/CGA quando comparado ao animal eutireoideo. A administração da dose saturante de T3 em 30 min não alterou o conteúdo do mRNA de <font face=\"Symbol\">&#946TSH e CGA, enquanto a dose fisiológica reduziu 52 e 34%, respectivamente, sem alterar a razão <font face=\"Symbol\">&#946TSH/CGA, comparando com o grupo Tx. Com o ensaio RACE-PAT, observou-se que o grupo Tx apresentou um aumento no comprimento da cauda poli-A do mRNA de <font face=\"Symbol\">&#946TSH, não havendo alterações semelhantes para o mRNA de CGA. A administração aguda de T3, apenas na dose saturante, provocou uma redução de 17% no comprimento da cauda poli-A do mRNA do <font face=\"Symbol\">&#946TSH nos animais hipotiroideos comparados com o grupo Tx. Nenhuma alteração foi observada no comprimento da cauda poli-A do mRNA de CGA, indicando um possível efeito específico do T3 sobre a poliadenilação da subunidade <font face=\"Symbol\">&#946. Através dos ensaios Western Blot / ECL, Imunohistoquímica e Histoquímica foi observado que as duas doses de T3 utilizadas promoveram um aumento de 30% no conteúdo protéico de TSH, uma redução na marcação de <font face=\"Symbol\">&#946TSH na periferia dos tireotrofos e aumento na polimerização de actina na hipófise dos animais hipotiroideos tratados, possivelmente por inibir a secreção deste hormônio. Como estes resultados foram observados em 30 min, e parte deles envolveu alterações em etapas pós-transcricionais da regulação da expressão de genes (poliadenilação), podemos inferir que o T3 esteja agindo por uma via não genômica regulando a síntese e secreção do TSH. / The thyroid-stimulating hormone (TSH) is the main regulator of the synthesis and secretion of thyroid hormones (TH), which exert a negative feedback mechanism in the pituitary by reducing the synthesis of <font face=\"Symbol\">&#946 and <font face=\"Symbol\">&#945 (CGA - Glycoprotein hormones alpha chain) chains through mechanisms that involve changes in the transcription of genes that encode these proteins (known as genomic action). However, in the last decade, an increasing body of evidence has shown that, in parallel with the classical genomic mechanisms, some TH actions might be elicited in a short period time (seconds to minutes), and in the presence of gene transcription inhibitors, which indicates that TH can also act nongenomically. In the present study we evaluate if TH could regulate some steps of the expression of <font face=\"Symbol\">&#946 TSH and CGA in a short period of time, which might provide evidence that they could act by non genomic mechanisms. For this, the expression and polyadenylation of alpha (CGA) and <font face=\"Symbol\">&#946 subunits of TSH mRNA, and TSH content, were evaluated by real time PCR and western blot, respectively, in thyroidectomized (hypothyroid) rats, 30 min after they were subjected or not to physiological or saturating doses of T3. It was observed that hyroidectomyzed animals treated with saline (Tx) presented an increase of 10 and 4 times in the content of <font face=\"Symbol\">&#946TSH and CGA mRNA, respectively, and in the <font face=\"Symbol\">&#946TSH / CGA ratio compared with control group. The saturating dose of T3 did not alter the <font face=\"Symbol\">&#946TSH and CGA mRNAs content, but the physiological dose reduced them at 52 and 34% respectively, without changing the <font face=\"Symbol\">&#946TSH / CGA ratio, compared with Tx group. The RACE-PAT assay showed that the Tx rats presented an increase in the mRNA <font face=\"Symbol\">&#946TSH poly-A tail length, whereas no change was observed to the mRNA of CGA. The acute and saturating dose of T3 caused a 17% reduction in the length of mRNA <font face=\"Symbol\">&#946TSH poly-A tail in hypothyroid animals compared with hypothyroid group. No changes were observed in the length of the poly-A tail of mRNA CGA, suggesting a specific effect of T3 on the <font face=\"Symbol\">&#946 subunit polyadenylation. Through the Western blot/ECL, histochemistry and immunohistochemistry methods we could observe that T3 (in both doses used) promoted a 30% increase in TSH protein content, a decrease in <font face=\"Symbol\">&#946TSH labeling near thyrotrophs plasma membrane and increased the actin polymerization in the pituitary of hypothyroid animals, possibly by inhibiting the secretion of this hormone. Considering that these results were observed in 30 min, and some of them involve changes in post-transcriptional regulation of gene expression (polyadenylation), we can infer that in parallel to its genomic action, T3 acts by non genomic pathways in the regulation of the TSH synthesis and secretion.

O hormônio tireotrófico (TSH) é o principal regulador da síntese e da secreção dos hormônios tireoidianos (HTs), os quais exercem um mecanismo de feedback negativo na hipófise reduzindo a síntese das cadeias beta (Tshb) e alfa (Cga) por meio de ações genômicas. Em paralelo, algumas ações dos HTs são desencadeadas na presença de inibidores da transcrição gênica e em segundos a minutos, caracterizando-se assim as ações não genômicas. O objetivo deste estudo foi avaliar as possíveis ações não genômicas do T3 sobre a expressão, processamento pós-transcricional, tradução e secreção do TSH, e a participação do cálcio e magnésio neste processo. Os resultados demonstraram que o T3, via interação com a integrina aVb3, reduz o conteúdo de mRNA de Tshb mesmo na presença de bloqueador da transcrição gênica, o comprimento da cauda poli(A), a taxa de tradução deste transcrito e a secreção por vias dependentes da integrina aVb3 e PI3K. E também aumenta a concentração intracelular de magnésio mas não altera a de cálcio. Estes dados evidenciam a existência de um mecanismo adicional e não genômico pelo qual o T3 interage com a integrina aVb3 e reduz a síntese/secreção de TSH que se soma ao já conhecido efeito de feedback negativo via controle da taxa de transcrição gênica de Tshb e Cga. / The thyrotropin (TSH) is the main regulator of thyroid hormones (HTs) synthesis and secretion, which in turn, exert a negative feedback in the pituitary gland reducing the synthesis of alpha (Cga) and beta (Tshb) TSH subunits by genomic actions. In parallel, some HTs actions are triggered in the presence of inhibitors of gene transcription and in seconds to minutes, featuring the non genomic actions of HTs. The goal of this study was to evaluate the possible non genomic actions of T3 on expression, posttranscriptional regulation, translation and secretion of TSH, as well as, the participation of calcium and magnesium on this process. The results have shown that the T3, interacts with aVb3 integrin, reduces the content of Tshb mRNA even in the presence of gene transcription inhibitor, decreases the poly(A) tail length, the translation rate of this transcript and the secretion through aVb3- and PI3K-dependent mechanisms. The T3 also increases and does not alter the intracellular concentration of magnesium and calcium, respectively. These data demonstrates the existence of an additional and non genomic mechanism by which the T3 interacts with aVb3 integrin and reduces the synthesis/secretion of TSH, in parallel to the control of Tshb and Cga gene transcription.

O hormônio tireotrófico (TSH) é o principal regulador da síntese e da secreção dos hormônios tireoidianos (HTs), os quais exercem um mecanismo de feedback negativo na hipófise reduzindo a síntese das cadeias <font face=\"Symbol\">&#946 e <font face=\"Symbol\">&#945 (CGA - Glycoprotein hormones Alpha Chain) por meio de mecanismos que envolvem modificações na transcrição de genes que codificam essas proteínas (ações genômicas). Na última década tem aumentado o número de evidências de que, em paralelo as ações genômicas clássicas, algumas ações dos HTs são desencadeadas na presença de inibidores da transcrição gênica e em curto espaço de tempo (segundos a minutos), caracterizando-se assim as ações não genômicas dos HTs. Este trabalho tem como foco avaliar a possibilidade de que os HTs regulem a expressão desses genes não genomicamente. Para tal avaliamos as alterações decorrentes do hipotiroidismo, seguido ou não do tratamento agudo com T3 em dose fisiológica ou saturante, sobre o grau de poliadenilação e a expressão do mRNA das subunidades alfa (CGA) e <font face=\"Symbol\">&#946TSH, bem como sua repercussão sobre a síntese e secreção de <font face=\"Symbol\">&#946TSH. Através da metodologia de PCR em Tempo Real observamos nos animais tireoidectomizados tratados com salina (Tx) um aumento de 10 e 4 vezes no conteúdo de mRNA do <font face=\"Symbol\">&#946TSH e CGA, respectivamente, e na razão <font face=\"Symbol\">&#946TSH/CGA quando comparado ao animal eutireoideo. A administração da dose saturante de T3 em 30 min não alterou o conteúdo do mRNA de <font face=\"Symbol\">&#946TSH e CGA, enquanto a dose fisiológica reduziu 52 e 34%, respectivamente, sem alterar a razão <font face=\"Symbol\">&#946TSH/CGA, comparando com o grupo Tx. Com o ensaio RACE-PAT, observou-se que o grupo Tx apresentou um aumento no comprimento da cauda poli-A do mRNA de <font face=\"Symbol\">&#946TSH, não havendo alterações semelhantes para o mRNA de CGA. A administração aguda de T3, apenas na dose saturante, provocou uma redução de 17% no comprimento da cauda poli-A do mRNA do <font face=\"Symbol\">&#946TSH nos animais hipotiroideos comparados com o grupo Tx. Nenhuma alteração foi observada no comprimento da cauda poli-A do mRNA de CGA, indicando um possível efeito específico do T3 sobre a poliadenilação da subunidade <font face=\"Symbol\">&#946. Através dos ensaios Western Blot / ECL, Imunohistoquímica e Histoquímica foi observado que as duas doses de T3 utilizadas promoveram um aumento de 30% no conteúdo protéico de TSH, uma redução na marcação de <font face=\"Symbol\">&#946TSH na periferia dos tireotrofos e aumento na polimerização de actina na hipófise dos animais hipotiroideos tratados, possivelmente por inibir a secreção deste hormônio. Como estes resultados foram observados em 30 min, e parte deles envolveu alterações em etapas pós-transcricionais da regulação da expressão de genes (poliadenilação), podemos inferir que o T3 esteja agindo por uma via não genômica regulando a síntese e secreção do TSH. / The thyroid-stimulating hormone (TSH) is the main regulator of the synthesis and secretion of thyroid hormones (TH), which exert a negative feedback mechanism in the pituitary by reducing the synthesis of <font face=\"Symbol\">&#946 and <font face=\"Symbol\">&#945 (CGA - Glycoprotein hormones alpha chain) chains through mechanisms that involve changes in the transcription of genes that encode these proteins (known as genomic action). However, in the last decade, an increasing body of evidence has shown that, in parallel with the classical genomic mechanisms, some TH actions might be elicited in a short period time (seconds to minutes), and in the presence of gene transcription inhibitors, which indicates that TH can also act nongenomically. In the present study we evaluate if TH could regulate some steps of the expression of <font face=\"Symbol\">&#946 TSH and CGA in a short period of time, which might provide evidence that they could act by non genomic mechanisms. For this, the expression and polyadenylation of alpha (CGA) and <font face=\"Symbol\">&#946 subunits of TSH mRNA, and TSH content, were evaluated by real time PCR and western blot, respectively, in thyroidectomized (hypothyroid) rats, 30 min after they were subjected or not to physiological or saturating doses of T3. It was observed that hyroidectomyzed animals treated with saline (Tx) presented an increase of 10 and 4 times in the content of <font face=\"Symbol\">&#946TSH and CGA mRNA, respectively, and in the <font face=\"Symbol\">&#946TSH / CGA ratio compared with control group. The saturating dose of T3 did not alter the <font face=\"Symbol\">&#946TSH and CGA mRNAs content, but the physiological dose reduced them at 52 and 34% respectively, without changing the <font face=\"Symbol\">&#946TSH / CGA ratio, compared with Tx group. The RACE-PAT assay showed that the Tx rats presented an increase in the mRNA <font face=\"Symbol\">&#946TSH poly-A tail length, whereas no change was observed to the mRNA of CGA. The acute and saturating dose of T3 caused a 17% reduction in the length of mRNA <font face=\"Symbol\">&#946TSH poly-A tail in hypothyroid animals compared with hypothyroid group. No changes were observed in the length of the poly-A tail of mRNA CGA, suggesting a specific effect of T3 on the <font face=\"Symbol\">&#946 subunit polyadenylation. Through the Western blot/ECL, histochemistry and immunohistochemistry methods we could observe that T3 (in both doses used) promoted a 30% increase in TSH protein content, a decrease in <font face=\"Symbol\">&#946TSH labeling near thyrotrophs plasma membrane and increased the actin polymerization in the pituitary of hypothyroid animals, possibly by inhibiting the secretion of this hormone. Considering that these results were observed in 30 min, and some of them involve changes in post-transcriptional regulation of gene expression (polyadenylation), we can infer that in parallel to its genomic action, T3 acts by non genomic pathways in the regulation of the TSH synthesis and secretion.