This thesis is focused on the development of a gene delivery system, especially for the purpose of DNA vaccination. DNA expression vectors have the potential to be useful therapeutics for a wide variety of applications. A carrier system was designed to realize the delivery of genes to cells and the promotion of controlled adequate expression in the target cells. The low gene delivery efficiency observed with systems composed of polyplexes is mainly due to low stability of polycation e.g polyethylenimine-DNA complexes and inability of most of the complexes to the reach nucleus after entering the cells. The encapsulation of polyethylenimine-DNA complexes inside the alginate microspheres was expected to provide protection from nuclease-based attack, thereby, increasing the stability of the complex and also to achieve controlled release of the complex at the target tissue. In this study, controlled release of complexes from alginate microspheres was studied with DNA staining. In Tris-HCl buffer, the release of PEI-DNA complexes were completed in 48 h, however in cell culture medium (DMEM) 18 % of complexes were released in 48 h because of presence of Ca+2 ions in DMEM. Also, in order to provide mucosal gene delivery for mucosal immunization polyethylene glycol (PEG) was introduced into the composition of microspheres and the two systems were compared in terms of release kinetics of the complexes. In the presence of PEG, release of PEI-DNA complexes from alginate microspheres in the cell culture medium (DMEM) were enhanced and 50 % of PEI-DNA were released from the microspheres in 48 h. To understand the effect of the PEG on the surface of microspheres zeta potential analysis and microscopic examination were carried out. By increasing percentage of PEG (0, 15, 30, 50) in microspheres, less negative zeta potential value were measured. Mucoadhesion of alginate and PEG-alginate microspheres were evaluated by using modified microbalance method, and in the presence of PEG enhancement of mucoadhesion was observed. In this way a gene delivery system with a possible route through mucosa of tissues was prepared.

Einleitung: Glioblastoma multiforme (GBM) gehören zu den häufigsten und bösartigsten Hirntumoren. Eine vollständige Heilung ist derzeit noch nicht möglich. Ziele: Es wurde ein orthotopes GBM-Xenotransplantat-Modell in der Maus etabliert, optimale Durchführungsprotokolle wurden erstellt und die Wachstumskinetik der Tumoren charakterisiert. Außerdem erfolgte eine lokale therapeutische Intervention mit Komplexen aus Polymeren und siRNAs (small interfering RNAs) bzw. AntimiRs (Anti-micro-RNAs) und der Verlauf wurde mittels Biolumineszenz-imaging (BLI) überwacht. Die tumortragenden Hirne wurden immunhistochemisch untersucht. Neben der Therapie wurden erstmals Tissue Slice Cokulturen aus Maushirnen mit orthotopen Xenotransplantaten hergestellt und durch immunhistochemische Untersuchungen bezüglich des Tumorwachstums und der Invasivität in das umliegende Normalgewebe charakterisiert. Des Weiteren wurde ein subkutanes (s.c.) Xenotransplantat-Modell etabliert, dessen Tumorwachstum mittels BLI überwacht wurde, welches eine therapeutische Applikation von PEI-komplexierten siRNAs enthielt und deren Tumoren mittels Messung der Proteinkonzentration und der Lumineszenz charakterisiert wurden. Mit dieser Arbeit wurden durch die Verwendung von siRNAs bzw. AntimiRs im Rahmen der RNA-Interferenz Strategien entwickelt, mit denen eine Grundlage für die spezifisch auf ein bestimmtes Gen gerichtete GBM-Therapie geschaffen werden konnte. Tiere, Material, Methoden: In insgesamt 190 immundefizienten Mäusen wurden s.c. und orthotope Xenotransplantate aus der Reporterzelllinie G55T2-Luc-GFP hergestellt. Eine Behandlungsgruppe mit s.c. Xenotransplantaten bestand aus 7-8 Tieren. Die Behandlungsgruppe erhielt intraperitoneale (i.p.) Injektionen des PEI-siRNA-Komplexes LP10Y-siLuc3 (LP10Y: AG Aigner, Universität Leipzig, Deutschland, siLuc3: Eurogentec, Belgien), während die Negativkontrollgruppe (NC) i.p. Injektionen mit dem Komplex LP10Y-siLuc2 erhielt. Diese Behandlung erfolgte 3 x wöchentlich über 6-12 d. Das Wachstum der Tumore wurde mit BLI in vivo verfolgt und die Lumineszenz im zeitlichen Verlauf gemessen. Die Tumore wurden lysiert und deren Lumineszenz bezogen auf die Proteinkonzentration gemessen. Für das orthotope Xenotransplantat wurde eine Schraube mit Führungskanal (Screw guide, Plastics One, USA) 1 mm rostral und 2 mm lateral des Bregmas stereotaktisch implantiert. Mit einer Mikroinfusionspumpe und einer Mikrodosierspritze wurden die Zellen über den Führungskanal mit 12 µl/ h in das rechte Striatum injiziert. 5-7 d nach der Inokulation der Zellen erfolgte das Einbringen von 3 µl der PEI-AntimiR bzw. siRNA-Komplexe PEI/antimiR-155-Komplex (PEI: AG Aigner, Universität Leipzig, Deutschland, AntimiR 155-ZEN: Integrated DNA Technologies, USA) bzw. LP10Y-siPLK1 (PLK1: Eurogentec, Belgien). Die Tiere der NC wurden mit den Komplexen PEI/antimiR-NC5-Komplex bzw. LP10Y-siLuc3 behandelt. Zum Vergleich wurde eine Gruppe gar nicht behandelt. Die Behandlung erfolgte 3 x wöchentlich über 12 d. Eine Behandlungsgruppe bestand aus 10 randomisiert verteilten Tieren. Das Wachstum wurde in vivo mit BLI verfolgt. Die Hirne wurden entnommen und mit einem Vibratom Gewebeschnitte erstellt, die mit Kresylviolett gefärbt und an denen mit einer Bildbearbeitungssoftware die Tumorflächen ausgemessen wurden. Außerdem wurden mit einem Mikrotom Paraffinschnitte hergestellt und diese immunhistochemisch beurteilt. Es wurden Tissue Slice Cokulturen aus unbehandelten Tumoren und gesundem Gewebe des Striatums bzw. Cortex erstellt und aus diesen ebenfalls Paraffinschnitte hergestellt, welche immunhistochemisch beurteilt wurden. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass ein Tumorwachstum s.c. injizierter GBM-Zellen in vivo mit BLI verfolgt werden kann und dass die siRNA siLuc3 mit LP10Y erfolgreich in G55T2-Luc-GFP eingeschleust wurde. Bei der Untersuchung der Luciferaseaktivität bezogen auf die Proteinkonzentration der lysierten s.c. Tumoren konnte eine Reduktion der Lumineszenz in der Behandlungsgruppe nachgewiesen werden. Das orthotope Xenotransplantat-Modell wies eine Tumoranwuchsrate von bis zu 96 % und eine Mortalitätsrate von bis zu 0 % auf. Das Tumorwachstum konnte nicht in vivo mit BLI verfolgt werden, da die umliegenden Gewebe die Lumineszenz vollständig abschirmten. Bei den Behandlungen mit LP10Y-siPLK1 und dem PEI/antimiR-155-Komplex konnte histologisch eine Reduktion der Tumorgröße und immunhistochemisch Apoptose und eine Tendenz zur Reduktion der Proliferation und Migration nachgewiesen werden. In der Behandlungsgruppe mit LP10Y-siPLK1 konnte außerdem eine verminderte Expression von PLK1 im Tumorgewebe und eine gesteigerte Überlebensrate nachgewiesen werden. Mit den Tissue Slice Cokulturen konnte festgestellt werden, dass die Xenotransplantate in den verschiedenen Hirnabschnitten unterschiedliches Migrationsverhalten zeigen. Die auf dem Cortex wachsenden Tumore waren kleiner als die auf dem Striatum wachsenden Tumore, wiesen jedoch mehr Migration in das umliegende Hirngewebe und mehr raumforderndes Wachstum im Verhältnis zum nicht raumfordernden Wachstum auf. Das Verhältnis der migrierenden Zellen zur Länge des Tumors des Xenotransplantats im Cortex wies höhere Werte auf als das im Striatum. Schlussfolgerungen: LP10Y eignet sich zur Einschleusung von siRNA und könnte ein vielversprechendes Nano-Therapeutikum darstellen. Das BLI von Luciferase exprimierenden, s.c. Tumoren ist ein gutes Verfahren zur Verfolgung der Wachstumskinetik. Es scheint sich jedoch nicht zur Untersuchung der Transfektionseffizienz von PEI-Komplexen zu eignen, da die Erscheinungsform von Glioblastomen mit Einblutungen, Nekrosen und Zysten sehr verschieden sein kann. Es ist also möglich dass die Tumoren unterschiedlich viele lebende Zellen pro Volumen mit entsprechender Luciferaseaktivität aufweisen. Alternativ dazu ist das Untersuchungsmodell der Lumineszenz bezogen auf die Proteinkonzentration lysierter Tumoren ein geeignetes Verfahren für die Quantifizierung der Luciferaseaktivität und der Transfektionseffizienz von PEI-Komplexen in GBM. Das im Zuge dieser Arbeit etablierte orthotope Xenotransplantat-Modell ist ein valides Modell mit verschiedenen Eigenschaften humaner GBM. Die Ergebnisse aus den Behandlungen der orthotopen GBM mit den PEI-siRNA bzw. AntimiRKomplexen sprechen für eine gute biologische Aktivität, niedrige Zytotoxizität, eine gute Knockdowneffizienz und somit auch therapeutische Effizienz der Komplexe in vivo. Das orthotope Xenotransplantat-Modell und die Tissue Slice Cokulturen stellen geeignete, gut reproduzierbare und genetisch unmanipulierte Modelle dar, welche die Untersuchung von Wachstums- und Migrationsverhalten mit und ohne therapeutische Intervention, sowie des Behandlungserfolges erlauben. Beide Polymere könnten vielversprechende Nano-Therapeutika darstellen. Ein neues exvivo-Modell, in dem die GBM in ihrer natürlichen Umgebung gewachsen sind und sich in der Cokultur weiterhin sehr ähnlich der Originalsituation verhalten können, wurde etabliert. Für die Statistiken wurde, zum Vergleich von Gruppen, der One-Way ANOVA-Test von SigmaPlot 13 verwendet.

Background: MiRNAs act as negative regulators of gene expression through target mRNA degradation or inhibition of its translation. In cancer, several miRNAs are upregulated and play crucial roles in tumorigenesis, making the inhibition of these oncomiRs an interesting therapeutic approach. This can be achieved by directly complementary single-stranded anti-miRNA oligonucleotides (antimiRs). A major bottleneck in antimiR therapy, however, is their efficient delivery. The nanoparticle formation with polyethylenimine (PEI) may be particularly promising, based on the PEI’s ability to electrostatically interact with oligonucleotides. This leads to their protection and supports delivery. In the present study, we explore for the first time PEI for antimiR formulation and delivery. We use the branched low molecular weight PEI F25-LMW for the complexation of different antimiRs, and analyse tumor- and metastasis-inhibitory effects of PEI/antimiR complexes in different tumor models. Results: In prostate carcinoma, transfection of antimiRs against miR-375 and miR-141 leads to tumor cell inhibition in 2D- and 3D-models. More importantly, an in vivo tumor therapy study in prostate carcinoma xenografts reveals anti-tumor effects of the PEI/antimiR complexes. In advanced melanoma and metastasis, we identify by a microRNA screen miR-150 as a particularly relevant oncomiR candidate, and validate this result in vitro and in vivo. Again, the systemic application of PEI/antimiR complexes inhibiting this miRNA, or the previously described antimiR-638, leads to profound tumor growth inhibition. These effects are associated with the upregulation of direct miRNA target genes. In a melanoma metastasis mouse model, anti-metastatic effects of PEI/antimiR treatment are observed as well. Conclusions: We thus describe PEI-based complexes as efficient platform for antimiR therapy, as determined in two different tumor entities using in vivo models of tumor growth or metastasis. Our study also highlights the therapeutic relevance of miR-375, miR-141, miR-150 and miR-638 as target miRNAs for antimiR-mediated inhibition.