Orientador: Eleni Gomes / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Hamilton Cabral / Resumo: As pectinases são enzimas com importantes aplicações econômicas, especialmente na indústria alimentícia. Pectinases termoestáveis, produzidas por microrganismos termofílicos, apresentam uma série de características que favorecem sua aplicação em processos industriais, como, por exemplo, estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura e maior tolerância a agentes químicos desnaturantes de proteínas. Contudo, os principais microrganismos empregados na produção de poligalacturonases (PGs) são fungos mesofílicos. O presente trabalho teve por objetivo realizar um estudo comparativo de produção de PGs em fermentação em estado sólido (FES) por fungos mesofílicos e termofílicos. Foram utilizados os fungos mesofílicos Aspergillus niger NRRL 3112 e Penicillium itallicum IZ 1584, reconhecidos como bons produtores de PGs, os termofílicos Thermomyces lanuginosus ROB e Rhizomucor pusillus A13.36 e o termodúrico Aspergillus fumigatus N31. Os microrganismos foram cultivados em FES em farelo de trigo, os mesofílicos a 27ºC e os demais a 45ºC, por períodos de 10 a 15 dias. Os maiores produtores de PG foram P. itallicum IZ 1584 (51U/g) e A. fumigatus N31 (59,40 U/g). As PGs dos fungos termofílicos apresentaram maiores valores de temperatura ótima e maior termoestabilidade que as dos mesofílicos. T. lanuginosus produziu PG com maior valor de temperatura ótima (70ºC). A. fumigatus produziu a PG mais termoestável, que conservou 100% da atividade original após 1 h de incubação a 50ºC em ausência de substrato. Cromatografias em filtração em gel e zimogramas revelaram a expressão de 7 isoformas de PG em A. niger NRRL 3112, 3 isoformas em P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB e R. pusillus, e 2 isoformas em A. fumigatus N31. / Abstract: Pectinases are enzymes with important economic applications, especially in food industry. Termostable pectinases, produced by termophilic microorganisms, display an array of characteristics that support their application in industrial processes, such as stability through a wide pH and temperature range, as well as higher tolerance to protein denaturating chemical agents. However, the major microoganisms employed in polygalacturonases (PGs) prodution are mesophilic fungi. The present work aimed to make a comparative study of PG production by mesophilic and thermophilc fungi in Solid-State Fermentation (SSF). The fungi employed were the mesophilic Aspergillus niger NRRL 3112 and Penicillium itallicum IZ 1584, both known as good PGs producers, the thermophilic Thermomyces lanuginosus ROB and Rhizomucor pusillus A13.36 and the termoduric Aspergillus fumigatus N31. The fungi were bred in wheat bran in SSF, the mesophilic at 27ºC and the others at 45ºC, during periods of 10 to 15 days. The higher PGs producers where P. itallicum IZ 1584 (51U/g) and A. fumigatus N31 (59,40 U/g). PGs of thermophilc fungi have shown higher values of optimum temperature and termostability than mesophilic PGs. T. lanuginosus produced PG with the higher value of optimum temperature for activity (70ºC). A. fumigatus have shown the most thermostable PG, which mantained 100% of its original activity after 1 h of incubation at 50ºC in absence of substrate. Gel filtration chromatography and zymograms revealed the expression of 7 PG isoforms for A. niger, 3 isoforms for P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB and R. Pusillus, and 2 isoforms for A. fumigatus N31. / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: Maria de Lourdes T. de M. Polizeli / Resumo: O fungo Rhizomucor pusillus A 13.36, quando cultivado por fermentação em estado sólido utilizando farelo de algodão como fonte de carbono por 72 horas, produziu altos níveis de poligalacturonase (18,6U/g). Essa enzima apresentou atividade máxima em pH 5,5 e em 55oC. A poligalacturonase bruta apresentou estabilidade na faixa de pH entre 4,5 e 6,5, com uma atividade residual de 91,3% no pH 6,5, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 80% nas temperaturas de 55 a 60oC. Esta enzima foi purificada por concentração e uma combinação de procedimentos de gel filtração e cromatografia de troca-iônica. A massa molecular da enzima foi 53,7kDa. A focalização isoelétrica mostrou uma única banda cujo ponto isoelétrico (pI) foi 3,8. A atividade máxima da enzima purificada também ocorreu em pH 5,5 e a 55oC. A enzima purificada foi estável na faixa de pH 4,5 a 6,5, com atividade residual na faixa de 80 a 100%, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 100% nas temperaturas de 55 a 60oC. A enzima purificada foi totalmente inibida por Ca2+, Cu2+, Hg2+ e 80% inibida por Fe2+ e Ag+. Mg2+ estimulou a atividade da poligalacturonase em 100%. Entre os substratos avaliados, a pectina de citrus (D.E. 92%) foi o que mais estimulou a ação da enzima. A afinidade por pectinas de alta esterificação e a ausência de atividade quando o ácido poligalacturônico foi usado como substrato, indica que a enzima purificada é uma polimetilgalacturonase. Os resultados obtidos pela cromatografia de papel demonstraram que a polimetilgalacturonase purificada possui o modo de clivagem endo/exo misto. O Km com pectina de citrus foi 10,78mg mL-1 e a Vmax foi 2379,04μmolmin-1mg-1. As possíveis aplicações desta enzima incluem composição de detergentes, processamento têxtil e de fibras de celulose, degradação ou modificação de material vegetal, aditivo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rhizomucor pusillus A 13.36 produced high levels of polygalacturonase (18.6U/g) in solid state fermentation in medium composed by cotton bran for 72 hours. This enzyme showed maximal activity at pH 5.5 and 55oC. Crude polygalacturonase was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity of 91,3% at pH 6.5, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 80% at 55-60oC. This enzyme was purified by concentration and a combination of gel filtration and ion exchange chromatographic procedures. The molecular mass of the enzyme was 53.7kDa. Isoelectric focusing showed a single band with an isoelectric point (pI) of 3.8. The purified enzyme also showed maximum activity at pH 5.5 and 55oC. The purified enzyme was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity range of 80 to 100%, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 100% at 55-60oC. The purified enzyme was totally inhibited by Ca2+, Cu2+, Hg2+ and 80% inhibited by Fe2+ and Ag+. Mg2+ increased poligalacturonase activity in 100%. Citrus pectin (D.E. 92%) was found to be the preferred substrate among the different substrates tested in the enzyme assay. The affinity for high pectin esterification and the lack of activity when polygalacturonic acid was used as substrate, indicates that the enzyme is a polymethylgalacturonase. The results obtained by paper chromatography showed that the purified polymethylgalacturonase has the mixed endo/exo mode of cleavage. The Km with citrus pectin was 10.78mg mL-1 and the Vmax was 2379.04μmolmin-1mg- 1. The possible applications of this enzyme include the composition of detergents, textile and cellulosic fiber processing, degradation or modification of plant material, animal feed additive and wine and juice processing. / Doutor