Fear and anxiety are fundamental emotional states that are critical for survival. These states are characterized by a variety of coordinated responses, including behavioral and autonomic changes, that need to be properly integrated. For the past decades, most studies have separated the behavioral and autonomic elements, generating a gap in understanding their integrative nature. In this thesis, a framework analysis is presented that allows for the integration of cardiac, behavioral, and neuronal readouts in freely moving mice during different emotional states. Furthermore, a growing body of evidence demonstrates that a vital component of these states is the physiological report of bodily states, or interoception, which allows for quick adaptation to changing situations. A set of distinctive interoceptive pathways has been described from the periphery to the brainstem; however, the circuits that process and integrate cardiac interoceptive signals in higher orders are poorly understood. The midbrain periaqueductal gray (PAG) is a region crucially involved in defensive states through its modulation of both, cardiac and behavioral components. Preliminary studies demonstrate an anatomical connection between the major cardiac interoception brainstem area, the nucleus of the solitary tract, and the PAG; however, the functional characterization and the specific neuronal substrates responsible for interoception in this area have not been described. An interesting particularity of the PAG is that the ventro-lateral subcolumn is the highest order of the neuraxis where inhibitory neurons that express the glycine can be found. In the lower brainstem and spinal cord, glycinergic inhibitory neurons have demonstrated a role in processing sensory and autonomic signals from the periphery, raising the question of whether the PAG glycinergic neurons could be involved in integrating cardiac interoceptive signals as part of a defensive state. In this thesis, using virally mediated trans-synaptic retrograde tracing, I showed that glycinergic PAG neurons receive inputs from cardiac regulatory areas in the brainstem and project massively to forebrain and midbrain regions. By employing advanced techniques such as deep brain calcium imaging with a miniaturized microscope and optogenetics, this study provides compelling evidence for the involvement of glycinergic PAG neurons in controlling heart rate and maintaining cardiac macrostate dynamics within physiological levels. The results of the optogenetic manipulation further revealed that a change in the heart rate macrostate caused by the glycinergic PAG neurons leads to anxiety-like behaviors, providing further evidence for the role of these neurons in regulating defensive states. Overall, by unraveling the neural circuitry underlying interoception in the PAG, our study paves the way to better understand fear and anxiety disorders. / Furcht und Angst sind grundlegende emotionale Zustände, die für das Überleben entscheidend sind. Diese Zustände sind durch eine Vielzahl von koordinierten Reaktionen gekennzeichnet, darunter auch Verhaltensänderungen und autonome Veränderungen, die richtig integriert werden müssen. In den letzten Jahrzehnten haben die meisten Studien die verhaltensbezogenen und autonomen Elemente getrennt, was zu einer Lücke im Verständnis ihrer integrativen Natur führte. In dieser Arbeit wird eine Rahmenanalyse vorgestellt, die die Integration von kardialen, verhaltensbezogenen und neuronalen Messwerten bei sich frei bewegenden Mäusen während verschiedener emotionaler Zustände ermöglicht. Darüber hinaus gibt es immer mehr Belege dafür, dass eine wichtige Komponente dieser Zustände die physiologische Rückmeldung von Körperzuständen an das Gehirn, die sog. Interozeption ist, die eine schnelle Anpassung an sich ändernde Situationen ermöglicht. Es wurde eine Reihe von ausgeprägten interozeptiven Bahnen von der Peripherie bis zum Hirnstamm beschrieben. Jedoch sind die Schaltkreise, die kardiale interozeptive Signale in höherer Ordnung verarbeiten und integrieren, kaum bekannt. Das periaquäduktale Grau des Mittelhirns (PAG) ist eine Region, die sich entscheidend an Verteidigungszuständen beteiligt ist und deren Modulation sowohl kardiale als auch verhaltensbezogene Signale beeinflusst. Vorläufige Studien zeigen eine anatomische Verbindung zwischen dem wichtigsten kardialen Interozeptionsbereich des Hirnstamms, dem Nucleus tractus solitarius, und dem PAG; die funktionelle Charakterisierung und die spezifischen neuronalen Substrate, die für die Interozeption in diesem Bereich verantwortlich sind, sind bislang jedoch nicht beschrieben worden. Eine interessante Besonderheit des PAG ist, dass die ventro-laterale Subkolumne die höchste Ordnung der Hirnachse mit hemmenden glyzinergen Zellkörpern aufweist. Im Hirnstamm und im Rückenmark haben diese hemmenden Neuronen eine Rolle bei der Verarbeitung sensorischer und autonomer Signale aus der Peripherie gezeigt, was die Frage aufwirft, ob die glyzinergen Neuronen des PAG an der Integration kardialer interozeptiver Signale als Teil eines Verteidigungszustandes beteiligt sein könnten. In dieser Arbeit habe ich mit Hilfe von viral vermitteltem trans-synaptischem retrograden Tracing gezeigt, dass glyzinerge PAG-Neuronen Inputs von kardialen Regulationsbereichen im Hirnstamm erhalten und massiv in Vorder- und Mittelhirnregionen projizieren. Durch den Einsatz fortschrittlicher Techniken, wie z. B. Tiefenhirn- Kalziumbildgebung mit einem miniaturisierten Mikroskop und Optogenetik, liefert diese Studie überzeugende Beweise für die Beteiligung glyzinerger PAG-Neuronen an der Kontrolle der Herzfrequenz und der Aufrechterhaltung der kardialen Makrostate-Dynamik innerhalb physiologischer Grenzen. Die Ergebnisse der optogenetischen Manipulationen zeigten außerdem, dass eine durch die glyzinergen PAG-Neuronen verursachte Veränderung des Makrostates der Herzfrequenz zu angstähnlichem Verhalten führt, was einen weiteren Beweis für die Rolle dieser Neuronen bei Furcht und Angst darstellt. Insgesamt ebnet unsere Studie durch die Entschlüsselung der neuronalen Schaltkreise, die der Interozeption im PAG zugrunde liegen, den Weg zu einem besseren Verständnis von Angst und Angststörungen.

Zur Kontrolle und Steigerung der Fruchtbarkeitsleistung von hochleistenden Milchkühen muss eine frühzeitige, sichere Methode zur Feststellung einer Trächtigkeit erfolgen. Neben der transrektalen Ultraschalldiagnostik als direkte Methode gibt es hierzu über den Nachweis boviner trächtigkeitsassoziierter Glykoproteine (bovine Pregnancy Associated Glycoproteins = bPAGs) eine indirekte, genauso früh einsetzbare Methode. Über einen Hauptversuch sollten die Praktikabilität sowie die Sensitivität und Spezifität eines laborungebundenen blutbasierten bPAG-Trächtigkeitstests unter Feldbedingungen ermittelt werden. In Teilversuchen sollten die Haltbarkeit des bPAG in kühl- und gefriergelagerten Proben beurteilt werden. Zudem sollten die Testergebnisse von unbesamten Kühen post partum (p.p.) und früh wiederbesamten Kühen unter 60 Tagen p.p. vor dem Hintergrund vorliegender Rest-bPAG-Mengen der zurückliegenden Trächtigkeit analysiert werden. Im Hauptversuch befanden sich von Juli bis Dezember 2014 109 Kühe zweier Betriebe in Mecklenburg Vorpommern. Voraussetzung war, dass sich die Tiere mindestens 60 Tage p.p. befanden, um falsch positive Ergebnisse durch noch im Blut zirkulierende bPAGs der zurückliegenden Trächtigkeit auszuschließen. Bei dem zu validierenden „IDEXX Visual Pregnancy Test“ handelt es sich um einen indirekten Antigen-Capture ELISA, welcher bPAGs im Blutserum oder im EDTA-Plasma tragender Rinder nachweist. Verlässliche Ergebnisse sind laut Herstellerangabe erstmalig ab 28 Tagen post inseminationem (p.i.) möglich. Die Testergebnisse werden visuell im Vergleich mit parallel angesetzten Positiv- und Negativkontrollen zugeordnet. Als Goldstandard wurde in der Feldstudie bei jedem Tier eine erste Trächtigkeitsuntersuchung 28 Tage p.i., eine zweite 35 Tage und eine dritte nach dem 45. Tag p.i. mit transrektaler Sonografie vorgenommen. Während der ersten beiden Befundungen erfolgte eine Blutprobenentnahme aus der V. caudalis mediana und eine Untersuchung mit dem „IDEXX Visual Pregnancy Test“. Eine dritte Blutprobenentnahme (>45 Tage p.i.) wurde veranlasst, sofern das Testergebnis am Tag 35 nicht mit dem Ergebnis der transrektalen Sonografie übereinstimmte bzw. die visuelle Zuordenbarkeit des Testergebnisses nicht eindeutig möglich war. Im Hauptversuch lag die Trächtigkeitsrate bei 51,4% (56 von 109) und 48,6% (53 von 109) nicht tragenden Tieren. Alle 56 mittels transrektaler Sonografie als tragend diagnostizierten Kühe wurden ohne Ausnahme korrekt vom Trächtigkeitstest ebenfalls als positiv getestet. Folglich betrug die Sensitivität des Tests 100%. Bei 48 von 53 sonografisch nicht für tragend befundenen Tieren stimmte dies mit dem bPAG-Bluttest überein. Fünf Probandinnen wiesen 28 Tage p.i. ein falsch positives Testergebnis auf, welches bei zwei Kühen auch bei der dritten Testdurchführung am 47. bzw. am 49. Tag p.i. unverändert eine Trächtigkeit falsch anzeigte. Somit betrug die Spezifität 90,6%. Des Weiteren wurden Gütekriterien-Validationen mittels positivem und negativem prädiktivem Wert sowie über das positive und negative Wahrscheinlichkeitsverhältnis und die Genauigkeit durchgeführt. Es resultierten jeweils sehr gute Werte hieraus. Die Teilversuche ergaben eine gute Haltbarkeit des bPAG auch bei vorheriger Kühl- oder Gefrierlagerung der Blutproben. Die bPAG aus der zurückliegenden Trächtigkeit blieben teils bis einschließlich Tag 55 p.p. nachweisbar. Der Zeitaufwand für den Bluttest betrug mindestens 175 Minuten pro Testdurchlauf; davon fielen 105 Minuten auf die eigentliche Testdurchführung. Je kleiner die Probenanzahl pro Testserie, desto teurer wird jeder einzelne Trächtigkeitstest pro Tier aufgrund der jeweils doppelt mit anzusetzenden Positiv- und Negativkontrollen. Der Trächtigkeitstest ist somit nur für größere Tierarztpraxen geeignet, die die nötige personelle Ausstattung und eine genügend große Anzahl an Trächtigkeitsuntersuchungen pro Testdurchlauf garantieren können. Aufgrund in Frage kommender falsch positiver Ergebnisse, aller Voraussicht nach dem späten embryonalen Fruchttod zuzuschreiben, wird eine direkte manuelle und/oder transrektal sonografische Nachuntersuchung zumindest aller am 28. Tag p.i. positiv getesteten Kühe nach dem 45. Tag p.i. für zwingend notwendig erachtet.

Zur Kontrolle und Steigerung der Fruchtbarkeitsleistung von hochleistenden Milchkühen muss eine frühzeitige, sichere Methode zur Feststellung einer Trächtigkeit erfolgen. Neben der transrektalen Ultraschalldiagnostik als direkte Methode gibt es hierzu über den Nachweis boviner trächtigkeitsassoziierter Glykoproteine (bovine Pregnancy Associated Glycoproteins = bPAGs) eine indirekte, genauso früh einsetzbare Methode. Über einen Hauptversuch sollten die Praktikabilität sowie die Sensitivität und Spezifität eines laborungebundenen blutbasierten bPAG-Trächtigkeitstests unter Feldbedingungen ermittelt werden. In Teilversuchen sollten die Haltbarkeit des bPAG in kühl- und gefriergelagerten Proben beurteilt werden. Zudem sollten die Testergebnisse von unbesamten Kühen post partum (p.p.) und früh wiederbesamten Kühen unter 60 Tagen p.p. vor dem Hintergrund vorliegender Rest-bPAG-Mengen der zurückliegenden Trächtigkeit analysiert werden. Im Hauptversuch befanden sich von Juli bis Dezember 2014 109 Kühe zweier Betriebe in Mecklenburg Vorpommern. Voraussetzung war, dass sich die Tiere mindestens 60 Tage p.p. befanden, um falsch positive Ergebnisse durch noch im Blut zirkulierende bPAGs der zurückliegenden Trächtigkeit auszuschließen. Bei dem zu validierenden „IDEXX Visual Pregnancy Test“ handelt es sich um einen indirekten Antigen-Capture ELISA, welcher bPAGs im Blutserum oder im EDTA-Plasma tragender Rinder nachweist. Verlässliche Ergebnisse sind laut Herstellerangabe erstmalig ab 28 Tagen post inseminationem (p.i.) möglich. Die Testergebnisse werden visuell im Vergleich mit parallel angesetzten Positiv- und Negativkontrollen zugeordnet. Als Goldstandard wurde in der Feldstudie bei jedem Tier eine erste Trächtigkeitsuntersuchung 28 Tage p.i., eine zweite 35 Tage und eine dritte nach dem 45. Tag p.i. mit transrektaler Sonografie vorgenommen. Während der ersten beiden Befundungen erfolgte eine Blutprobenentnahme aus der V. caudalis mediana und eine Untersuchung mit dem „IDEXX Visual Pregnancy Test“. Eine dritte Blutprobenentnahme (>45 Tage p.i.) wurde veranlasst, sofern das Testergebnis am Tag 35 nicht mit dem Ergebnis der transrektalen Sonografie übereinstimmte bzw. die visuelle Zuordenbarkeit des Testergebnisses nicht eindeutig möglich war. Im Hauptversuch lag die Trächtigkeitsrate bei 51,4% (56 von 109) und 48,6% (53 von 109) nicht tragenden Tieren. Alle 56 mittels transrektaler Sonografie als tragend diagnostizierten Kühe wurden ohne Ausnahme korrekt vom Trächtigkeitstest ebenfalls als positiv getestet. Folglich betrug die Sensitivität des Tests 100%. Bei 48 von 53 sonografisch nicht für tragend befundenen Tieren stimmte dies mit dem bPAG-Bluttest überein. Fünf Probandinnen wiesen 28 Tage p.i. ein falsch positives Testergebnis auf, welches bei zwei Kühen auch bei der dritten Testdurchführung am 47. bzw. am 49. Tag p.i. unverändert eine Trächtigkeit falsch anzeigte. Somit betrug die Spezifität 90,6%. Des Weiteren wurden Gütekriterien-Validationen mittels positivem und negativem prädiktivem Wert sowie über das positive und negative Wahrscheinlichkeitsverhältnis und die Genauigkeit durchgeführt. Es resultierten jeweils sehr gute Werte hieraus. Die Teilversuche ergaben eine gute Haltbarkeit des bPAG auch bei vorheriger Kühl- oder Gefrierlagerung der Blutproben. Die bPAG aus der zurückliegenden Trächtigkeit blieben teils bis einschließlich Tag 55 p.p. nachweisbar. Der Zeitaufwand für den Bluttest betrug mindestens 175 Minuten pro Testdurchlauf; davon fielen 105 Minuten auf die eigentliche Testdurchführung. Je kleiner die Probenanzahl pro Testserie, desto teurer wird jeder einzelne Trächtigkeitstest pro Tier aufgrund der jeweils doppelt mit anzusetzenden Positiv- und Negativkontrollen. Der Trächtigkeitstest ist somit nur für größere Tierarztpraxen geeignet, die die nötige personelle Ausstattung und eine genügend große Anzahl an Trächtigkeitsuntersuchungen pro Testdurchlauf garantieren können. Aufgrund in Frage kommender falsch positiver Ergebnisse, aller Voraussicht nach dem späten embryonalen Fruchttod zuzuschreiben, wird eine direkte manuelle und/oder transrektal sonografische Nachuntersuchung zumindest aller am 28. Tag p.i. positiv getesteten Kühe nach dem 45. Tag p.i. für zwingend notwendig erachtet.